Abstract
metabotrope glutamatreseptoren 1 (GRM1) signal har vært innblandet i godartede og ondartede lidelser inkludert prostatakreft (PCA). For ytterligere å undersøke hvilken rolle genetiske endringer av
GRM1
i PCA skjermet vi hele menneske
GRM1
genet inkludert kodende sekvens, ekson-intron veikryss, og flankerer uoversatt regioner (UTR) for tilstedeværelsen av mutasjoner og enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i flere PCA cellelinjer og matchet tumor normal vev fra kaukasiske amerikanere (CAS) og afro-amerikanere (AAS). Vi brukte toveis sekvensering, allel-spesifikk PCR, og bioinformatikk å identifisere genetiske endringer i
GRM1 Hotell og forutsi deres funksjonelle rolle. En roman missense mutasjon identifisert på C1744T (582 Pro Ser) plasseringen av
GRM1
genet i en primær AA-PCA cellelinje (E006AA) ble spådd å påvirke protein stabilitet og funksjoner. En annen roman mutasjon identifisert på exon-intron krysset mellom exon-8 i C4-2B cellelinje resultert i endring av
GRM1
spleising donor området. I tillegg fant vi missense SNP på T2977C (993 Ser Pro) posisjon og flere ikke-koding mutasjoner og SNPs i 3′-UTR av
GRM1
genet i PCA cellelinjer og vev. Disse nye mutasjoner kan bidra til sykdommen ved endringer i
GRM1
genet skjøting, reseptor aktivering, og post-reseptor nedstrøms signal
Citation. Ali S, Shourideh M, Koochekpour S (2014) identifisering av Novel
GRM1
mutasjoner og enkeltnukleotidpolymorfi i prostatakreft cellelinjer og vev. PLoS ONE 9 (7): e103204. doi: 10,1371 /journal.pone.0103204
Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA
mottatt: 16 april 2014; Godkjent: 25 juni 2014; Publisert: 25.07.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av R01MD005824, R21CA183892, og R21CA181152 tilskudd til Dr. Shahriar Koochekpour. Ekstra støtte ble gitt av Roswell Park Cancer Institute og National Cancer Institute stipend # P30 CA016056. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Glutamat signalering fører til aktivering av flere nedstrøms signalkaskader. Disse nedstrøms signalkaskader inkluderer (i) aktivering av ligand ionekanaler (kjent som ionotrope glutamat reseptorer (iGluRs)) og tilstrømningen av Ca
2 + og /eller K
+ ioner i sentrale og perifere nervesystemet [ ,,,0],1], (ii) aktivering av metabotrope glutamatreseptorer (mGluR) kjent som G-protein koblede reseptorer (GPCR) og andre messenger-veier for eksempel fosfolipase C (PLC), fosfoinositid 3-kinase /retrovirus AK thymoma /mTOR (PI3K /AKT /mTOR) [2], og (iii) aktivering av G-protein-uavhengige signaloverføringsveier, mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) og proteinkinase C (PKC) /ERK1 /2 trasé [3], [4]. Siste to signalkaskader, PI3K /AKT /mTOR og MAPK /ERK har omfattende vært innblandet i flere kreft hos mennesker og legger vekt på glutamat signalisering i tumorigenesis [4] Hotell
mGluR omfatter en grunnleggende kjennetegn arkitektur. En stor bi fliker ekstracellulære amino-terminale domene (ATD) også kjent som «venus fly trap» med en spesifikk sekvens av 24 aminosyrer for glutamat-bindingssetet, et 70 aminosyre-cysteinrike domene (CRD) som kreves for dimerisering etter aktivering, etterfulgt ved klassiske syv alfa-heliks transmembran domene, og en intracellulær cytoplasmatiske haledomene (CTD) [5]. Ulike isoformer av gruppe I mGluR’er (mGluR1) har blitt identifisert, avhengig av lengden av C-terminal domene [5]. Det C-terminale domene består av en prolin-rik Homer1 bindingsmotiv (isoform a), som innebærer i intrikate protein-protein interaksjoner og kompleksdannelse med molekylære [6]. Avkutting av CTD fører til tap av Homer1 bindingsmotiv i isoformer b-d og således påvirker interaksjonen med andre nedstrøms signalmolekyler og trasé [5]. Tilstedeværelse av ulik lengde isoformer av
GRM1
gen med varierende rolle i påfølgende aktivering av nedstrøms signalveier, fremheve viktigheten av spleise mekanismer i
GRM1
gen-funksjon [5].
mGluR’er signale ble først innblandet i cellulær proliferasjon av gliomceller [7] og melanom utvikling [8], enten i
in vitro
eller
in vivo
studier og deretter denne reseptor ble vist å spille en avgjørende rolle i forskjellige typer kreft [9], [10], [11], [12] onkogen funksjon av mGluR1 ble vist ved induksjon av transformerte fenotype med overekspresjon av
GRM1
genet i melanocytter [13] . Tilsvarende i vår tidligere studie undersøkte vi uttrykket av mGluR1 i grunnskolen og metastatisk PCA cellelinjer og vev [10]. PCa celler vekst avhengighet av
GRM1
-signalling ble også demonstrert av glutamat blokade eller bruk av Riluzol, som GRM1 antagonist eller hemmer av glutamat release. Riluzol redusert PCA celler spredning, migrasjon, invasjon, og indusert apoptose som vist ved økt uttrykk nivå av kløyvde caspase-9, -7, -3, PARP, og phopho-H2AX
ser139 [10].
somatiske mutasjoner er blitt identifisert i forskjellige domener av mGluR’er, inkludert ligand-bindende domene, transmembrandomene og cytosol-domene i ulike typer av kreft [4]. Missense mutasjoner av mGluR identifisert i forskjellige domener kan ha biologisk relevans i kreft. Faktisk har somatiske mutasjoner i mGluR’er blitt rapportert å fremme brystkreft, melanom, og nyrecellekarsinom vekst og progresjon
in vivo product: [11], [12], [14]. Esseltine og kollega [15] studerte de funksjonelle konsekvensene av flere missense mutasjoner identifisert i forskjellige domener av mGluR i flere typer kreft, inkludert lunge adenokarsinom, plateepitelkarsinom, høyverdig astrocytom, og brystkreft. Disse missense mutasjoner i forskjellige domener av mGluR påvirke reseptor uttrykk og gi selektiv fordel til forskjellige nedstrøms signalveier (f.eks PI3K /Akt /mTOR, ERK1 /2-aktivering) og endring i mobilnettet morfologi.
Noen rapporter finnes for GRM1 mutasjoner og enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i PCA cellelinjer eller vev. Disse studiene er begrenset til hel-exome sekvensering og transkriptom analyse. Disse høye throughput analyser er ikke i stand til å identifisere intron-exon veikryss eller ikke-koding varianter og krever videre eksperimentell validering av de identifiserte mutasjoner. I tillegg gjorde disse studiene ikke er African American (AA) -PCa prøver og cellelinjer for GRM1 mutasjon eller SNP gjenkjenning. For å overvinne disse begrensningene, skjermet vi full lengde GRM1 genet inkludert alle eksoner, exon-intron veikryss, og flankerer ikke-kodende 5′- og 3′-uoversatt regioner (UTR) for å identifisere genetiske forandringer i flere PCA cellelinjer og matchet svulst -Normal vev i AAs og kaukasiske amerikanere (CAS). Vi identifiserte nye mutasjoner og SNPs i GRM1 genet. Funksjonelle konsekvenser av disse mutasjonene ble spådd å bruke tilgjengelig online bioinformatikk.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Vi skjermet genomisk DNA av ti PCA cellelinjer (PC-3 , E006AA, DU-145, MDA-PCa2b, 22RV1, LAPC4, Vcap, CWR-R1, LNCaP, C4-2B) og normal prostata epitelceller for påvisning av mutasjoner og polymorfismer i kodende region, flankerer uoversatt regioner (5′- og 3′- UTR), og exon-intron veikryssene full lengde
GRM1
genet.
Castrate-resistente (PC-3, DU-145, MDA-PCa2b, VCap, og 22RV1) og androgen- stimulert (LNCaP og LAPC4) PCA-cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) [16], [17]. Normale prostata epitelceller (NL-Pr.EC) og C4-2B cellelinjer ble kjøpt fra henholdsvis Clonetics (Bio Whittaker, Walkers, MD) og UROCOR (Uroscience Group, Oklahoma City, OK). E006AA ble etablert fra en AA pasient med orgel-begrenset PCa [16]. CWR-R1 cellelinjen ble gitt som en gave fra Dr. Elizabeth Wilson (University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) [18]. PC-3, ble DU-145, og VCap cellelinjer opprettholdt i DMEM supplert med føtalt bovint serum (FBS, 10%) og antibiotika (1%). E006AA, 22RV1, CWR-R1, C4-2B, og LNCaP-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 med FBS (10%) og antibiotika (1%). MDA-PCa2b-cellelinjen ble dyrket i definere medium som anbefalt av produsenten (ATCC, Manassa, VA). LAPC4 cellelinjer var kultur i IMDM supplert med 10% FBS og 1% antibiotika.
tumorprøver og etisk erklæringen
For å evaluere genetiske endringer i
GRM1
genet, vi inkludert totalt 21 matchet prostata normal-tumorprøver hentet fra Aas (n = 10) og CAS (n = 11). Alle vev biospecimens ble hentet fra biospecimen kjernefasilitet ved Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC) tilknyttet Tulane Medical School og School of Medicine, Louisiana State University Health Sciences Senter (LSUHSC, New Orleans, LA). Forhånds informert skriftlig samtykkeerklæring ble innhentet fra hver pasient under prøvene samling for bruk av sine prøver i vitenskapelige funn og studien ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved LSUHSC. Matchet normal-tumorvev var tilgjengelige for åtte tilfeller (N3-T3, N4-T4, N5-T5; N13-T13, N21-T21, N35-T35, N52-T52, N71-T71) av instanser og seks tilfeller (N2 t2, N6-T6, N26-T26, N27-T27, N32-T32, N38-T38) AA-pasienter
Genomisk DNA, Polymerase Chain Reaction, og sekvensering av
GRM1
Gene
Genomisk DNA ble isolert fra prostata vev og cellelinjer ved hjelp AllPrep DNA /RNA Quigen kit (Qiagen, Valencia, CA). Full-lengde
GRM1
genet (isoform α) ble valgt (NM_000838.3) for å designe primere som dekker alle eksoner, exon-intron veikryss, og 5′- og 3′-UTR. Dette transkripsjon omfatter totalt ni eksoner. Basert på mutasjoner og SNPs oppdaget i ekson-8 og -9 i PCA cellelinjer, valgte vi disse regionene for videre sekvensering i matchet tumor normal vev. Primer design ble utført ved hjelp PrimerSelect verktøy for DNASTAR lasergene 9 kjerne dress (DNASTAR, Madison, WI). Totalt 9492 bp ble amplifisert i seksten amplikonene inkludert den flankerende 50-100 bp som dekker exon-intronic sekvens. Primer detaljer (sekvens, smeltetemperatur, og fragment størrelse) er gitt i tabell S1. Hvert genomisk DNA-prøve (totalt 25 ng) ble amplifisert ved 32 sykluser på 10 pl totalt volum av polymerase kjedereaksjon (PCR) inneholdende spesifikke primere (0,2 uM), dNTPs (0,2 mM), MgCl2 (1,5 mM); GoTaq DNA-polymerase (0,75 U) i 1 x PCR-buffer (Promega, Madison, WI, USA). PCR-produktene ble renset ved behandling med 5 U av Eksonuklease-I (Ekso-1) og 2 U av alkalisk rekefosfatase (SAP) sammen med 1x buffer ved 37 ° C i 2-3 timer etterfulgt av varme-inaktivering av enzymer ved 85 oC i 20 minutter. Etter Ekso-SAP-behandling, ble PCR-produktene ble fortynnet til 15 ng /mL konsentrasjon. PCR-produktet spesifisitet, mengde, kvalitet og ble analysert ved 1,2% agarosegelelektroforese. Toveis sekvensering av PCR-produktene ble utført ved Genomisk kjernefasilitet (RPCI, Buffalo) ved hjelp av ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA). Data ble analysert ved hjelp av sekvensanalyse programvare og verifisert ved visuell undersøkelse av de identifiserte varianter i elektroferogrammet.
Allele Spesifikke Genotyping av C1744T Mutasjon i tumorprøver
Vi utviklet et allel-spesifikk PCR-basert genotyping metode for å evaluere den ikke-synonyme mutasjon identifisert ved direkte sekvensering av
GRM1
gen på C1744T (582 Pro Ser) posisjon i E006AA cellelinje. For toveis forsterkning av denne spesifikke mutasjonen ble fire primere designet (Tabell S1, Primer tallene 19 til 22), to ytre primere og to allel-spesifikke (AS) indre primere med sin 3’enden spesifisitet til hvert allel (C T). C-allel forsterkes i en retning med en AS indre primer og en ytre primer-par (# 19 og # 20; amplikon størrelse 439 bp), mens mutant t-allel forsterkes i den motsatte retning med den andre indre og ytre primerpar (# 21 og # 22; amplicon størrelse 297 bp). De to ytre primere også forsterke en konstant fragment (# 20 og # 22; amplikon størrelse 736 bp) som tjener som positive kontroller for PCR. Alle fire primere ble anvendt i én reaksjon og PCR-betingelser ble optimalisert ved å justere konsentrasjonen av hver primer og annealing temperaturer (tabell S1). I hvert sett av PCR-reaksjon, har vi inkludert en positiv og en negativ kontrollprøve for å observere effektiviteten av AS-genotyping.
bioinformatiske analyse av Identifiserer Novel
GRM1
Mutasjoner
Nye mutasjoner identifisert i
GRM1
genet ble testet bioinformatically for ulike mulige effekter på protein struktur, funksjon, og spleisesete varianten. Effekten av missense mutasjon (serin til prolin) på 582 aa posisjon ble testet ved hjelp av elektroniske verktøy; (I) PolyPhen2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) [19], (ii) sile (https://sift.jcvi.org/) [20], og (iii) PhD- SNP (https://gpcr2.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/PhD-SNP/PhD-SNP.cgi) [21].
for å forutsi potensielle strukturelle konsekvens av identifiserte mutasjon ved ekson -intron veikryssene exon-8 i
GRM1
genet, vi brukte to forskjellige online bioinformatikk: (a) Menneskelig spleising finder (https://www.umd.be/HSF/) [22] og ( b) ESEfinder (https://rulai.cshl.edu/tools/ESE/) [23]. DNA sekvens som omfatter villtype eller mutant allel ble brukt som en spørring i Human Splice Finder verktøy for å forutsi spleising donor eller akseptor nettstedet.
Resultater
Identifikasjon av Novel
GRM1
mutasjoner og SNPs i prostata kreft cellelinjer
Sekvensering av hele eksoner av
GRM1
genet i 10 PCA cellelinjer viste 18 genetiske endringer som inkluderer nylig identifiserte ikke-synonyme mutasjoner, spleise-site variasjoner, ikke-synonyme, synonyme, og ikke-kodende polymorfismer (figur 1 og 2, tabell 1-2). A novel non-synonyme mutasjon ved C1744T (582 Pro Ser) stilling av exon-8 ble påvist i E006AA, en primær AA-PCa-cellelinjen (figur 1). Denne mutasjonen ble vist i heterozygot status (CC CT) og ligger i nærheten av transmembrane domene mot ekstra mobilnettet siden av GRM1 reseptor og resulterte i prolin (hydrofil aminosyre, kodon-CCT) til serin (nøytral aminosyre, kodon-TCT) amino syre endring (Figur 2). Andre roman mutasjon ble identifisert ved exon-intron krysset av exon-8 i C4-2B, en kastrering-resistent PCa cellelinje (figur 1, tabell 1). Denne mutasjonen resulterte i G til T omdannelse ved starten av intron-8 og først i heterozygot tilstand. Fem ikke-kodende mutasjoner ble også funnet i 3′-UTR-regionen av exon-9
GRM1
gen i to forskjellige PCA-cellelinjer (LAPC4 og MDA-PCa2b) (tabell 2). En av disse mutasjonene er lokalisert på 2149 bp nedstrøms stoppkodon i LAPC4 og rapportert i NCBI data base (dbSNP bygge 139) som rs41285865. Mens andre fire mutasjoner som ligger på 221 bp, 486 bp, 2664 bp og 2737 bp nedstrøms for stoppkodonet i MDA-PCa2b cellelinje (tabell 2). Disse mutasjonene rapportert i NCBI data base (dbSNP bygge 139) som rs362827, rs6918099 henholdsvis rs79394543 og rs362829.
Bilder
Bortsett fra disse mutasjonene, en missense SNP (rs6923492 ) ble identifisert ved 993 aminosyre posisjon i cellelinjer undersøkt. Homozygot TT genotype ble observert i PC-3, 22RV1, CWR-R1 cellelinjer, og NL-Pr.EC. Heterozygot TC genotype ble oppdaget i MDA-PCa2b og Vcap cellelinjer, og homozygot CC genotype i E006AA, DU-145, LAPC4, C4-2B, LNCaP cellelinjer. På dette locus, endring av T til C nucleotide resulterte i Serine (TCC) til Proline (CCC) konvertering. Dette missense polymorfisme ligger i cytoplasmatiske domene av reseptoren GRM1 mellom transmembrandomene og kveil-spole-motivet (figur 2). Fire tidligere rapportert synonyme polymorfismer ble også identifisert i kodingssekvensen av exon-9 ved 931 (rs2942), 1056 (rs6923864), 1071 (rs1047006) og 1165 aminosyre (rs9373491) posisjoner (tabell 1). Seks ikke-kodende SNPs ble funnet i 3′-UTR av
GRM1
genet og disse polymorfismer ligger på 637 bp (rs362819), 1277 bp (rs3804294), 1278 bp (rs3804293), 1369 bp (rs362820) , 2392 bp (rs362821) og 2616 bp (rs362822) nedstrøms for å stoppe kodon (tabell 2).
Identifikasjon av
GRM1
Mutasjoner og SNPs i Prostate Cancer Vev
Sequencing av utvalgte eksoner-8 og -9 av
GRM1
genet i prostata tumorvev viste flere genetiske forandringer. En homozygot genotype status (CC genotype) sammenlignet med heterozygot genotype (CT genotype) i tilstøtende normalt vev på 637 bp nedstrøms (rs362819) for å stoppe kodon ble funnet i et AA-tumor (N38-T38 prøver, tabell 3). Ytterligere to genotyper (CC og GA) ble funnet i 3′-UTR regionen bare i AA-prøvene i posisjon 221 bp (rs362827, N2-T2) og 486 bp (rs6918099, N6-T6, N32-T32 og N38-T38) nedstrøms å stoppe kodon. Men disse endringene var av germline opprinnelse. Siden heterozygot genotype (GA rs6918099) på 486 bp nedstrøms for å stoppe kodon ble funnet i tre av 11 AAs, synes det å være en etnisk-spesifikke genotypen. Homozygot CC genotype (rs362827) som bare finnes i en enkelt AA-pasient kan være en sporadisk bakterie linje mutasjon eller en sjelden variant.
I likhet med cellelinje sekvense data identifiserte vi en missense polymorfisme ( rs6923492) på 993 aminosyre posisjon fører serin til prolin aminosyre forandring og ble observert i 7 av 10 Aas (N2-T2, N26-T26, N27-T27, N32-T32, T62, T25, T11) og fem av 11 instanser (N3-T3, N5-T5, N21-T21, T20, T34) vev (tabell 3). En ikke-kodende SNP (rs362819) ble funnet på 637 bp nedstrøms for stoppkodonet. Genotypen status for disse SNPs i tumorvev var samme til tilstøtende normalt vev, hvilket indikerer bakterie linje polymorfismer (tabell 3). To synonymt polymorfismer ble også funnet i ekson-9 i både Aas og CAS populasjoner. Disse ble plassert på 931 aminosyre posisjon (rs2942) og kode for lysinrest, mens en annen synonymt polymorfisme som ligger ved 1056 aminosyreposisjon (rs6923864) kode for glycinrest.
Ved hjelp av allel-spesifikke (AS) PCR-primere og direkte sekvensering i matchet tumor normal vev, genotypet vi nylig identifiserte ikke-synonyme mutasjon ved C1744T (582 Pro Ser) stilling (i E006AA) og mutasjon i ekson-intron krysset mellom exon-8 (i C4-2B) . Disse mutasjoner ble ikke påvist i noen av ondartet prostatavevet (figur 3).
Nærvær av C-allelet viste amplifisering av et 439 bp fragment og tilstedeværelse av T-allelet viste amplifisering av et 267 bp fragment. En uspesifikk fragment av 706 bp ble forsterket i alle prøvene.
Forut Funksjoner av Identifiserte
GRM1
mutasjoner
Prediksjon av funksjonell rolle romanen ikke synonymt (582 Pro Ser) mutasjon identifisert i
GRM1
ble utført ved hjelp av ulike verktøy. PolyPhen-2 spådd en skadelig Bayes posterior sannsynlighet poengsum verdi 0,60 for denne mutasjonen. Denne spådommen poengsum er basert på flersekvenssammenstillingen med homolog sekvens av dette genet i databasen og viser at mutasjonen påvirker protein stabilitet eller dens funksjon.
Uavhengig analysert, sortering Intolerant Fra Tolerant (sile) algoritme også spådd en intoleranse skårverdi 0,02 for aminosyresubstitusjon identifisert på denne locus. Basert på protein sekvens bevaring gjennom evolusjon, spådde SIFT at 582 Pro Ser aminosyresubstitusjon kan også påvirke protein funksjon. Videre brukte vi PhD-SNP metode som utnytter tilgjengelige sykdomsrelaterte SNP database og maskinlæring teknikk for å forutsi nsSNP relatert til sykdom hos mennesker. Denne analysen avslørte sykdom relevante av 582 Pro Ser mutasjon med en pålitelighet indeksverdi på 3.
Siden punktmutasjoner ved ekson-intron eller intron-exon krysset kan føre til exon sklir eller alternativ spleising, vi var interessert i å analysere den potensielle effekten av romanen mutasjonen oppdaget på exon-intron krysset av ekson 8 i C4-2B cellelinje. For dette, benyttet vi den menneskelige skjøting Finder (HSF) og Exon skjøting Enhancer (ESE) finder verktøy for å forutsi konsekvensen på spleisesetet motiv med to ulike alleler av identifisert mutasjonen [22], [23]. Vi har funnet at tilstedeværelsen av T-allel sterkt forut muligheten for å spleise-donormotiv (caaGtgagt) med en høy konsensus verdi på 88,26. Imidlertid substitusjon av T- G-allel resulterte i tap av dette spleisedonormotiv (figur 4A og 4B). Likeledes, spådde ESEfinder en høy poengsum (9.49) motiv (exonic-spleising enhancer) for sekvens med G-allelet i ekson 8-intron krysset av
GRM1
genet. Men denne stillingen reduseres til -7,52 for motiv sekvens med mutant t-allel.
Tjue ett basepar sekvens som flankerer av mutasjonssetet med villtype (A) og mutant allel (B) ble testet for prediksjon av spleising nettstedet motiv (donor eller akseptor).
Diskusjoner
GRM1 signale har vært innblandet i flere ondartet kreft, inkludert kolon adenokarsinom, melanom, lungekreft, skjoldbruskkjertelen carcinoma, brystkreft, astrocytom, neuroblastom og rabdomyosarcoma [4], [5], [24]. Glutamatreseptor fått en spesiell interesse gitt sin trans potensial og tilgjengeligheten av sin ligand, glutamat, i forbindelse med tumormikromiljøet og lett tilgjengelighet av reseptor på overflaten av tumorceller. Differensial uttrykk, kan aktiveringsstatus eller signal omprogrammering av glutamat reseptor i tumorceller bidra til kreftutvikling og progresjon. Disse endringene kan oppstå fra bestemte endringer, inkludert somatiske og germline genetiske forandringer, kopiere nummer variasjon, epigenetisk, og posttranslasjonelle endringer som resulterer i endret uttrykk eller aktivering og dermed styrke tumorprogresjon og metastase [25].
Deep sekvense studier har vist at G-proteinkoblet reseptor (GPCR) er mutert i ca 20% av alle kreft og glutamat-reseptor-familien representerer en andre hyppigst muterte GPCR familiemedlem [26]. Somatiske mutasjoner i
GRM1
har blitt rapportert i brede varianter av tumorer som melanom, brystkreft, tykktarmskreft, lungekreft adenokarsinom, hjernesvulster, heamatopoitic, og lymfatisk vev [15].
GRM1
gen består av forskjellige domener med spesifikke funksjoner, inkludert ligand-bindende domene, cysteinrike domene for dimerisering, transmembran, og C-terminalt domene for samvirke med nedstrøms signaliseringsmolekyler. Mutasjoner i disse konserverte residier kan spille en mulig rolle for binding av GRM1 reseptoren med ligand, signale initiering, overføring av signal, eller opphør eller vinning av funksjons fenotyper. Disse mutasjoner kan ikke bare innebære i tumorutvikling og progresjon men også påvirker metastase, inkludert celle motilitet og fremming av angiogenese.
Tidligere studier har vist at mutasjoner i forskjellige G-protein koblet reseptor, CCK2R og GRM1 er assosiert med endret -reseptor-funksjon, nedstrøms signalveier, endret cellulær morfologi, migrering og fremme angiogenese, som fører til forbedret tumerogenesis [15], [27]. Esseltine
et al
studert den funksjonelle rollen
GRM1
mutasjoner som ligger på glutamat-bonding stedet (A168V), glutamat-bindende domene (R375G), cysteinrike område (G396V), G- protein~~POS=TRUNC region (R696W), og homer bindende region (P1148L) i den karboksy-terminale hale av GRM1 reseptor [15]. Transient ekspresjon av det muterte
GRM1
var assosiert med enten redusert celleoverflate-ekspresjon eller basal /quisqualat-stimulerte aktivering av inositolfosfat (IP) og /eller ERK1 /2-aktivering [15]. Mutasjon i Homer-bindende region (P1148L) ble vist å påvirke cellulære morfologi og kan påvirke cellemigrasjon.
Selv om flere mutasjoner er blitt rapportert hos
GRM1
genet i forskjellige humane kreftformer [4], bare et begrenset antall high-throughput studier inkludert hele exome sekvensering eller transkriptomet analyse ble utført og identifisert noen
GRM1
mutasjoner i PCA prøver [28], [29]. To nye mutasjoner (R868H og G144S) i
GRM1 plakater (tabell S2) ble identifisert ved sekvensering av exomes av 50 dødelig catrate bestandig PCA 11 høyverdig primære organ confind PCA prøver (behandling naiv) og 11 PCA cellelinjer [29]. Exome sekvensering av 112 prostata tumor /normal parene identifiserte to missense mutasjoner (A573E og R681H) i
GRM1
genet [28]. En tull mutasjon ble også rapportert i ekson-2 av
GRM1
genet. (TCGA: https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)
Exome eller transkriptom sekvens analysen har sine iboende begrensninger, inkludert manglende evne til å påvise mutasjoner i exon-intron kryss eller ikke-kodende område, og behovet for ytterligere eksperimentell validering av de identifiserte mutasjoner [28]. Videre gjorde disse studiene inkluderer ikke AA-tumorprøver eller deres cellelinjer. På grunn av disse begrensningene, vi vist, for første gang, er hele exonic regionen
GRM1
genet inkludert som flankerer 5′- og 3′-UTR og ekson-intron knutepunkter i ti vanlig anvendte PCA-cellelinjer, inkludert to etablerte AA-PCA cellelinjer (E006AA og MDA-PCa2B), og 21 matchet prostata tumor normal vev fra 11 instanser og 10 AAs pasienter.
i denne studien identifiserte vi to nye mutasjoner i E006AA og C4 -2b cellelinjer. Disse mutasjonene ble ikke identifisert i tidligere studier basert på deres studiedesign eller cellelinjer inkludert for sekvensering [29]. Ikke-synonyme mutasjon (C til T) ved 582 aminosyreposisjon resulterte i prolin til serin endring. Denne mutasjonen ligger i nærheten av transmembrane på ekstracellulære side. Bio prediksjon av funksjonelle rollen til denne mutasjon, ved hjelp av flere analyseverktøy, viste omdannelsen av hydrofile (Serine) til nøytral (prolin) aminosyren er enten intolerant eller fører til skadelig effekt til proteinstabilitet og funksjon. En konvertering fra serin til prolin aminosyre kan også påvirke styrken til signaloverføring etter ligandbinding og GRM1 reseptoraktivering. En annen mutasjon identifisert i exon-intron grensen av
GRM1
exon-8 i C4-2B cellelinje.
Bioinformatikk analyse ved hjelp av to ulike nettbaserte verktøy spådd at G til T nukleotid konvertering ved denne posisjonen resulterte i avbrudd av spleisedonorsete. Forstyrrelse av spleising stedet motiv på exon-intron krysset ved ekson-8 stilling kan gi grunnlag for å skape ulike spleisevarianter i
GRM1
genet. Ulike isoformer av
GRM1
gen med forskjellig protein lengde er forbundet med differensial aktivering av nedstrømssignalene enten gjennom endringer i signalstyrken eller interaksjon med andre cytosoliske proteiner [30]. Videre studier er nødvendig for å bekrefte den funksjonelle rolle av nye mutasjoner av
GRM1
genet identifisert i denne studien, og de av andre forskere [28], [29]. Ytterligere fire mutasjoner ble identifisert i MDA-PCa2b og en mutasjon i LAPC4 cellelinje som ligger i 3′-UTR av
GRM1
gen og disse mutasjoner er blitt rapportert i NCBI database (dbSNP Build 39) i forskjellige populasjonene. Disse mutasjonene skjedde som kimlinje endringer i tumorprøver undersøkt, og vi har observert at frekvensen av disse mutasjonene er høy i AA-tumorprøver i forhold til CAer. Høy frekvens av disse mutasjoner ble observert i AA-prøver kan assosiere med differensial
GRM1
ekspresjon og funksjon, noe som kan resultere i progresjon eller mer alvorlig sykdommen er. AA befolkning har vist en høy forekomst og dødelighet og presenterer en klinisk mer aggressiv sykdom enn instanser. Den funksjonelle rollen til disse mutasjonene har ikke blitt rapportert i litteraturen [31]
En missense polymorfisme (rs6923492 T C). Identifisert i ekson-ni av
GRM1
genet i PCA cellelinjer og tumorer resulterte i serin til prolin skift ved 993 aminosyreposisjon ved cytoplasmisk enden av reseptoren. Forrige studie med 1000 brystkreftpasienter viste sammenslutning av denne SNP i ER + /PR + ductal carcinoma in TT-genotype carrier med senere alder ved diagnose (4,9 år) sammenlignet med enten TC-og CC-genotype operatører [32]. Men ingen sammenheng ble funnet med melanom følsomhet [33]. En større tumorprøver studien er nødvendig for å bekrefte sammenslutning av denne SNP med mottakelighet for prostata kreftutvikling, aggressivitet og progresjon.
Konklusjoner
I denne studien har vi identifisert nye mutasjoner i
GRM1
-genet i tillegg til tidligere rapporterte mutasjoner og SNP’er ved PCA cellelinjer og også i en undergruppe av ondartet prostatavevet. Disse nye mutasjoner ble spådd å spille en viktig rolle i gen-funksjon inkludert protein stabilitet og skjøting av forskjellige isoformer. Funksjonell validering av disse mutasjonene vil ytterligere styrke rollen til genetiske endringer av
GRM1
genet i prostata kreftutvikling og progresjon.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Detaljer av primere som brukes for sekvensering av
GRM1
genet. Genomiske sekvenser av primere som brukes for PCR og sekvensering i samsvar med Human Genome Assembly (
GRM1
genet tiltredelse # NM_000838.3)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103204.s001 plakater (DOC )
Tabell S2.
Detaljer om somatiske mutasjoner i
GRM1
genet identifisert i hele exome eller transkriptomet sekvense studier av prostatakreft cellelinjer og svulster
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103204.s002 product: ( DOC)
