Abstract
Bakgrunn
OCT4 og Survivin er viktige faktorer for kreftcelle spredning, fornyelse og dedifferentiation, og korrelerer med resistens mot strålebehandling og kjemoterapi i de fleste humane kreftformer, men deres reguleringsmekanismer er ikke godt kjent.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien, 50 pasienter med spiserørs plateepitelkarsinom (ESCC) ble retrospektivt analysert. OCT4 ble uttrykt i 13 tilfeller (26%), og Survivin ble positivt uttrykt i 31 tilfeller (62%), undersøkt av immunkjemi. OCT4 ble funnet å være en uavhengig prediktiv faktor for median overlevelse tid, og pasientene fra undergruppen med både høy uttrykk for OCT4 og Survivin hadde den verste prognosen undersøkt av log-rank test. For ytterligere å undersøke molekylære reguleringsmekanisme mellom OCT4 og Survivin, bygget vi den spesifikke
liten
hårnål RNA (shRNA) -expressing vektorer målretting OCT4 eller /og Survivin og manipulert uttrykk for OCT4 og Survivin. Ved Western blotting og RT-PCR, fant vi at OCT4 kunne up-regulere Survivin uttrykk i esophageal kreft cellelinjer Eca109 og TE1. Samtidig knockdown av OCT4 og Survivin uttrykk indusert celle apoptose og G2-fase reduksjon av cellesyklus ved flowcytometri, og til slutt utøves en forbedret anti-proliferasjonspotensiale i Eca109 og TE1 cellelinjer ved MTT-analyse.
Konklusjoner
Denne studien viser at OCT4 og survivin uttrykk ble korrelert med dårlig overlevelse hos pasienter med ESCC. OCT4 og Survivin kan betraktes som mål i ESCC biotherapy
Citation. Li C, Yan Y, Ji W, Bao L, Qian H, Chen L, et al. (2012) OCT4 Positively Regulerer Survivin Expression å fremme Cancer Cell Proliferation og fører til dårlig prognose i Esophageal Plateepitelkarsinom. PLoS ONE 7 (11): e49693. doi: 10,1371 /journal.pone.0049693
Redaktør: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, Australia
mottatt: 11 juni 2012; Godkjent: 11 oktober 2012; Publisert: 21.11.2012
Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Scientific Foundation of China (30801106, 81172308, 30973469). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) er en av de mest ondartede svulster med høy dødelighet [1], [2]. Selv om noen nye molekylære mål har blitt funnet og brukt i ESCC biotherapy, er de molekylære mekanismene for ESCC tilbakefall og metastase fortsatt ikke forstått. En økende mengde bevis antydet at bare en liten brøkdel av kreft initiere celler har evnen til å fornye seg selv, så vel som, for å drive initiering og progresjon av kreft, og presentert på det sterkeste resistens mot kjemoterapi og radioterapi [3], [4] , som gir oss en bedre forståelse av molekylære grunnlaget for ESCC.
Octamer bindende transkripsjonsfaktor 4 (OCT4) er en av de stammerelaterte transkripsjonsfaktorer som regulerer tumor spredning og selvfornyelse. Dårlig differensierte eller udifferensierte kreftceller har vært preget av mange fenotypiske trekk som ligner på udifferensierte embryoniske stamceller, som tyder på at OCT4 kan uttrykkes i faste tumorer som en kreftcelle initiere biomarkør [5]. OCT4 tilhører familien av POU-domene transkripsjonsfaktorer, inkludert en homeodomain som er viktig i fosterutviklingen [6], [7]. Det har blitt bevist at OCT4 uttrykt i mange somatiske kreftformer, som brystkreft, prostatakreft, ikke-småcellet lungekreft, blærekreft, muntlig plateepitelkarsinom, magekreft, spiserørskreft [8] – [14]. OCT4 uttrykk spiller en sentral kobling i tumorigenesis og vedlikehold av kreftceller.
Survivin er medlem av hemmere av apoptotiske genet familie, og spiller en viktig rolle i tumorprogresjon ved å hemme celle apoptose, regulering av celledeling og induksjon av angiogenese [15]. Overekspresjon av Survivin ble foreslått i en rekke kreftformer, inkludert ESCC [16], [17], men sjelden til stede i normalt voksent vev. Survivin uttrykk i sirkulerende kreftceller i perifert blod hos pasienter med ESCC ble funnet og gitt verdifull informasjon i prediksjon av kreft tilbakefall og dårlig prognose [18], [19]. Dessuten, overekspresjon av Survivin i ESCC presentert resistens mot kjemoterapi og kortere overlevelse [20], og det ble lignende resultater i andre kreft [21].
Forrige studien viste at knockdown av Survivin ekspresjon i en rekke av human cancer cellelinjer, slik som A549, HeLa og MCF-7-celler, resulterte i en betydelig reduksjon av cellenes levedyktighet, og kombinasjonen av survivin-rettet stanse strategi med kjemoterapeutiske midler utgjorde en verdifull metode for behandling av kreft med en forbedret antitumor effekt [21], [22]. Imidlertid er kreft re-veksten trolig den viktigste funksjonen, fordi kreften initierende celler motstå konvensjonelle kreftbehandlingen og vil trolig spille en viktig rolle i kreft tilbakefall [23]. Derfor er rettet mot kreftceller initiere har potensial til å betydelig forbedre resultatene for kreftpasienter. OCT4 er en mester gen som spiller en nøkkelrolle i selvfornyelse og pluripotency av stamceller. Blir selektivt uttrykt i tumorvev, bevis antydet at OCT4 kan være et lovende mål for utvikling av anticancer strategier for å eliminere kreftceller initiere [24].
Nylig ble det rapportert at Survivin ekspresjon ble dramatisk redusert i OCT4 knockdown muse-embryonale stamceller [25], som tyder på at det er en sammenheng mellom OCT4 og survivin. Men de molekylære regulatoriske mekanismer mellom OCT4 og Survivin er ennå ikke klart i kreft. I denne studien undersøkte vi OCT4 og Survivin uttrykk og analysert den prognostiske betydningen av disse to gener med ESCC prøver. I mellomtiden, reguleringsmekanisme for OCT4 og Survivin uttrykk og deres funksjon på celle apoptose, celleproliferasjon eller cellesyklus ble undersøkt i ESCC cellelinjer.
Resultater
OCT4 og Survivin var over-uttrykt i ESCC
uttrykk for OCT4 og survivin ble oppdaget av immunhistokjemi i prøvene av ESCC og tilstøtende normale esophageal vev. OCT4 ble uttrykt i 13 (26%) av ESCC men bare 2 (4%) av normale esophageal vev. Survivin ble uttrykt i 31 (62%) av ESCC men bare 11 (22%) av normale esophageal vev. Det var forskjeller mellom ESCC og normale esophageal grupper (
p
= 0,0051 for OCT4;
p
= 0,0001 for Survivin). Den OCT4-positive immunoreaktivitets ble hovedsakelig distribuert i ESCC cellulære kjerner og Survivin var hovedsakelig fordelt i ESCC cytoplasma. De OCT4- og Survivin-positive celler ble hovedsakelig lokalisert i basal deler av epitel (Fig. 1). Survivin uttrykk ikke beslektet med OCT4 uttrykk i disse ESCC prøver (R = 0,276,
p
= 0,052, Tabell 1).
parafin-embedded seksjoner ble utsatt for immunhistokjemisk undersøkelse med den primære mus anti-human OCT4 og kanin-anti-humane antistoffer survivin på objektet konsentrasjon av 1:100, og diaminobenzidin (DAB) ble anvendt for å flekke den positive reaksjon. Fosfat-bufret saltvann (PBS), i stedet for de primære antistoffer, ble anvendt for negativ kontroll. Prosenter av positive celler ble talt opp innen 5 høy effekt felt, opprinnelig forstørrelse × 200.
Statistisk sammenheng mellom OCT4 eller Survivin uttrykk og ESCC clinicopathological kjennetegn (kjønn, alder, celledifferensiering, tumor invasjon dybde, lymfeknutemetastase) ble analysert og viste ingen signifikante forskjeller mellom de OCT4- eller survivin-positive og OCT4- eller survivin-negative tilfeller av ESCC (tabell 2).
OCT4 og survivin Korrelert til dårlig prognose av ESCC pasienter
Oppfølgings data fra 50 pasienter ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden for å estimere overlevelseskurver. Median OS var 34,5 måneder. Gjennomsnittlig overlevelse av pasienter med ESCC OCT4 positivt uttrykk var betydelig mindre enn den til pasienter med OCT4 negativ uttrykket (
p
0,001). Den tilsvarende resultat var viste mellom Survivin-positive og -negative ESCC tilfeller (
p
= 0,009). Blant de tre undergrupper (OCT4-positive /Survivin-positive, OCT4-negativ /Survivin-positive, OCT4-negativ /Survivin-negative), pasienter med OCT4-positive /Survivin-positive ESCC hadde en betydelig dårligst prognose (
p
0,001), og den lengste OS ble dokumentert i OCT4-negativ /survivin-negative undergruppe (fig 2A).. ble utført ytterligere analyser mellom to undergrupper av log-rank test, og resultatene viste at OCT4 og Survivin uttrykk ble sterkt assosiert med dårlig prognose av ESCC pasienter (Fig. 2B).
(A) Femti pasienter med ESCC ble inkludert i studien, og OS ble definert som perioden fra driften dato til dato for død eller sluttdatoen for oppfølging. Overlevelseskurver ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og den vesentlige forskjell ble testet ved hjelp av log-rank test. (B) Hver to undergrupper ble sammenlignet med log-rank test.
Dataanalyse med univariate Cox proporsjonal risikomodell avslørt at OCT4 og Survivin var signifikante prognostiske faktorer av ESCC pasienter. Men multivariat analyse viste at OCT4 var en selvstendig prognostisk verdi i ESCC pasienter, men Survivin var ikke (
p
= 0,168, Tabell 3).
hemmende effekt shRNA vektorer Målrette OCT4 og survivin i ESCC cellelinjer
For å identifisere om den konkrete
liten
hårnål RNA (shRNA) rettet mot OCT4
(OCT4-shRNA), etter survivin
( sur-shRNA)
, eller dobbel shRNAs (Dual-shRNA) rettet mot både OCT4 og survivin, påvirket kreftfaren celleproliferasjon, MTT analysen ble utført for å påvise celle levedyktighet. Celleviabilitet var åpenbart redusert i Eca109 og TE1 celler transfektert med OCT4-shRNA og Sur-shRNA sammenlignet med foreldre eller Ctr-shRNA transfekterte celler. Dual-shRNA utøves en forbedret hemmende effekt på celle levedyktighet i forhold til shRNA vektor rettet mot enkeltfaktor. Imidlertid var det ingen forskjell i celleviabilitet mellom OCT4-shRNA og Sur-shRNA-grupper (Fig. 3A).
(A) for foreldre og shRNA-transfekterte Eca109 og TE1 celler ble dyrket i 96-brønners plater med en tetthet på 8 x 10
3 celler /brønn i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved methylthiazoletetrazolium (MTT) analyse ved en bølgelengde på 490 nm,
#
p
0,01; Dual-shRNA: vektor som inneholder doble shRNAs rettet mot både OCT4 og Survivin. (B) Etter Eca109 celler ble transfektert med shRNA vektorer, 5 × 10
6 celler /ml ble høstet og farget med Annexin V-FITC og PI, og analysert ved flowcytometri. Prosenter av tidlig apoptose ble vist i histogrammet, data var representanter fra tre uavhengige eksperimenter og kvantitative histogrammer ble samlet data, feilfelt er standardavvik (SD), *
p
0,05;
#
p
0,01. (C) Cellesyklusen ble målt ved flow-cytometri. Data over cellesyklus ble vist i histogrammet, *
p
. 0,05
apoptose av ESCC cellelinjer ble målt til FCM med Anexin V-FITC og PI farging. Etter behandling med shRNA vektorer for 48 timer ble prosenter av tidlig celle apoptose økt i OCT4-shRNA (13,4 ± 2,76%), Sur-shRNA (10,89 ± 2,21%) og Dual-shRNA (17,79 ± 3,89%) gruppene, sammenlignet med det i foreldre celler (1,20 ± 1,01%) og Ctr-shRNA (0,87 ± 0,64%) gruppe, særlig høyere i Dual-shRNA gruppe (fig. 3B). Sammenlignet med foreldre og Ctr-shRNA grupper ble prosenter av G2-fase celler betydelig redusert i OCT4-shRNA, Sur-shRNA og Dual-shRNA transfektert grupper, men det var ingen signifikant forskjell for G1 og S-fase celler ( fig. 3C).
survivin Expression var assosiert med OCT4 i ESCC Cells
For å undersøke samspillet og regulering mellom OCT4 og survivin, den OCT4-shRNA, Sur-shRNA og Dual-shRNA vektorer var utformet for å manipulere målgenet ekspresjon i ESCC cellelinjer. Ved Western blot og RT-PCR-analyse, ble OCT4 og Survivin positivt uttrykt i foreldre Eca109 og TE1 celler. De OCT4-shRNA og Sur-shRNA vektorer kan hemme spesifikke mål genuttrykk, og Dual-shRNA vektor kunne hemme uttrykket av både OCT4 og Survivin gener. Den OCT4-shRNA kan også ned-regulere Survivin uttrykk i Eca109 og TE1 celler (fig. 4A), men Sur-shRNA ikke påvirke OCT4 uttrykk (Fig. 4B).
(A) foreldre og shRNA-transfekterte Eca109 og TE1 celler ble dyrket i 96-brønners plater i en tetthet på 8 x 10
3 celler /brønn i 48 timer, og ekspresjon av OCT4 og survivin i de høstede ESCC-celler ble undersøkt ved hjelp av Western blotting . Glyseraldehyd-3- phosphatedehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en kontroll lasting. Den relative bandet intensiteten ble analysert ved densitometri etter normalisert med GAPDH innholdet *
p
0,05;
#
p
0,01. (B) OCT4 og Survivin mRNA-ekspresjon ble undersøkt ved revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). GAPDH ble anvendt som en indre kontroll. Den relative bandet intensiteten ble analysert ved densitometri etter normalisering med GAPDH innholdet *
p
0,05;
#
p
0,01. Alle data var representanter fra 3 uavhengige eksperimenter. Kvantitative histogrammer ble samlet data. Feilfelt: standardavvik (SD); Dual-shRNA. Vektor som inneholder doble shRNAs rettet mot både OCT4 og Survivin
Dynamisk Lokalisering av OCT4 og Survivin Expression i ESCC Cells
Vi undersøkte dynamisk variant av OCT4 og Survivin uttrykk videre i ESCC celler ved konfokal analysen. Etter 48 timers transfeksjon med OCT4-shRNA, Survivin uttrykk ble særlig nedregulert i kreftcelle cytoplasma sammen med nedgangen av OCT4 uttrykk i cellulære kjerner. Imidlertid, etter transfeksjon med Sur-shRNA, det OCT4 ekspresjonsnivået ble ikke forandret sammen med reduksjon av Survivin ekspresjon (fig. 5).
paren og shRNA-transfekterte Eca109 og TE1 celler ble dyrket i 96- brønns plater ved en tetthet på 8 x 10
3 celler /brønn i 48 timer, og de høstede cellene ble fiksert med 4% formaldehyd, og deretter undersøkt OCT4 og survivin ekspresjon ved immuno fl uorescent konfokal-analyse og observert under et laser-scanning konfokalmikroskop .
Diskusjoner
OCT4, som en av de viktigste transkripsjonsfaktorer, spiller en sentral rolle i pluripotente stamceller [26]. OCT4, sammen med SOX2 og Nanog opprettholder stamcelle pluripotency, selvfornyelse og differensiering [27]. Det har etter hvert blitt en lovende svulst biomarkør for diagnostisering av bakterie celle svulster [28]. Nylig er det rapportert at OCT4 kunne påvises i mange somatiske cellekreftformer fra spiserøret, blære, lunge og lever, og har en sterk innflytelse på pasienters prognose. Funksjonen til OCT4 kan modulere en rekke signalveier, for eksempel Wnt /β-catenin, TGF-β, JAK /STAT3 signalveier [29], [30], for å aktivere eller hemme nedstrøms målgener. Dessuten er OCT4 ekspresjon i mus embryonale stamceller som er nødvendig for beskyttelse mot apoptose, og denne effekten kan være forbundet med STAT3 /Survivin sti [25].
Survivin, en nylig identifisert medlem av inhibitorer av apoptose protein (IAP ) familie, regulerer viktige cellulære prosessen, inkludert undertrykkelse av apoptose, kontroll av celledeling, og fremming av angiogenese [31]. Som en av de mest fremtredende kreftgener, er Survivin uttrykt i nesten alle svulster, men er ikke påvist i de fleste normale voksne vev [32]. Survivin ble betraktet som et mål-gen i cancerterapi, og nedregulering av Survivin kunne undertrykke tumorvekst og tumorcelle forbedre følsomheten for stråling og kjemoterapi ved å fremme apoptose og inhibere cellenes levedyktighet. Narkotika av LY2183108 [33] og YM155 [34] målretting Survivin ble tatt i bruk i kliniske studier i ulike stadier og effekten var lovende. Selv tumorvekst hastighet ble bremset ned på styrken av stanse Survivin, svulster fortsatt har evnen til utvikling og vekst og frata av pasientenes liv, noe som tyder på at Survivin var ikke en enkelt faktor for prognosen. Det er fortsatt en ukjent reguleringsmekanisme mellom OCT4 og Survivin.
Over-uttrykk for OCT4 eller Survivin i ESCC har vært konsekvent knyttet til sykdomsutvikling, metastatisk spredning, resistens mot behandlingen [14], [18]. Derfor, vi har oppdaget både OCT4 og Survivin uttrykk i ESCC vevsprøver, og funnet ut at OCT4 og Survivin ble nært knyttet til det kirurgiske resultatet av ESCC pasienter. Pasienter med OCT4-positive eller Survivin-positive svulster presenteres mye dårligere prognose enn de med OCT4-negative eller Survivin-negative tumorer. Blant undergruppene, pasienter med OCT4-positive /Survivin-positive svulster viste kortest total overlevelse tid. Ved multivariat og univariate analyser, er begge OCT4 og Survivin assosiert med pasientenes prognose, og OCT4 regnes som en selvstendig faktor for forcasting pasientenes total overlevelse tid. Fra vår studie, konkluderte vi med at OCT4 og Survivin ble i fellesskap knyttet til dårlig prognose av ESCC pasienter, men de regulatoriske mekanismer mellom OCT4 og Survivin i ESCC er ennå ikke klart.
Hemme uttrykk for OCT4 eller Survivin i ESCC cellelinjer med OCT4-shRNA eller Sur-shRNA vektorer resulterte i en reduksjon i G2-fase celler og en økning i celle apoptose, og co-undertrykkelse av OCT4 og survivin av Dual-shRNA vektor resulterte i en forbedret effekt. Noen studier har vist at inhibering av Survivin forårsaket cellesyklusarrest i G2-M-fase [35], [36], men vår studie funnet antall G2-faseceller ble redusert enormt etter å undertrykke Survivin uttrykk. G1-S-fasen, i tillegg til G2-M-fase, var det viktig sjekkpunktet i cellesyklus, som styrer og opprettholder celle prosess nøyaktighet. Det ble rapportert at over-uttrykk for Survivin kan hjelpe kreftceller til å passere G2-M sjekkpunkt [37], [38]. På samme tid, besitter Survivin en evne til å oppregulere ekspresjonen av Cyclin D1 og sikrer kreftceller til å passere G1-S sjekkpunkt flytende og får evne til vedvarende proliferasjon [38], [39].
Tidlig apoptose ble økt med nedregulering av survivin i mange rapporter. For ytterligere å undersøke den molekylære mekanismen for OCT4-involvert celle apoptose og cellesyklus arrest i Eca109 og TE1 celler, fant vi at ESCC cellene uttrykte lavere nivåer av OCT4 og Survivin protein etter transfektert med OCT4-shRNA, men Sur-shRNA bare ned- regulert survivin uttrykk, og det var ingen endring i OCT4 uttrykk nivå. Derfor konkluderte vi med at OCT4 kan regulere celle apoptose og celledelingen gjennom Survivin funksjon. OCT4 kan aktivere flere signalveier å kontrollere Survivin uttrykk, slik som STAT3, myc og NFkB trasé [30], [40] -. [42], som er kritisk for kreftcelleoverlevelse og antiapoptosis
I denne studien fant vi at over uttrykk for OCT4 og survivin er en viktig funksjon i ESCC progresjon, og OCT4 uttrykk er nært korrelert med survivin uttrykk i regulering av kreft celle apoptose og spredning. Imidlertid, de molekylære mekanismene mellom OCT4 og Survivin er meget komplisert. Vi skal utføre arbeid for å klargjøre de genetiske trekk OCT4 og Survivin, og design mer effektiv antitumor terapi for ESCC.
Materialer og metoder
Pasient og Prøver
Femti pasienter med ESCC ble inkludert i studien i Changhai Hospital (Shanghai, Kina) fra 1 januar til 31 desember 2005. studien ble godkjent av Ethic Committee of Second Military Medical University. Pasientene besto av 37 menn og 13 kvinner. Alderen varierte fra 47 til 72 år gammel, og median alder var 62 år gammel. Alle pasienter ga informert skriftlig samtykke. De resected lesjoner ble diagnostisert patologisk som ESCC etter operasjonen. Oppfølging av pasienter startet fra driften dato til 31 august, 2011. total overlevelse (OS) ble definert som perioden fra startdatoen for oppfølging dato for død eller sluttdatoen for oppfølging .
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
Menneskelig ESCC cellelinjer, Eca109 og TE1, ble kjøpt fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Celler ble opprettholdt som et monolag i RPMI-1640 med 10% FBS (føtalt bovint serum), 100 IU /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator.
immunhistokjemisk farging
den ferske tumorer og tilstøtende normalt vev ble hentet fra resected prøvene under drift. De parafininnstøpte påfølgende seksjonene ble utsatt for immunhistokjemisk undersøkelse for OCT4 og Survivin uttrykk ved hjelp av primære antistoffer, inkludert mus anti-human OCT4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA) og kanin anti-human Survivin (RD Systems Inc, Minneapolis, Minnesota, USA), og den ultra streptavidin peroksidase Kit (Fuzhou Maixin Bioteknologi Development Co, Fuzhou, Kina). Prosentandelen av positive celler ble talt innen 5 høy effekt felt, og evalueringen av farging reaksjonen ble utført i samsvar med immunoreactive poengsum standard foreslått av Friedrichs [43].
Anleggs og Transfeksjon av shRNA vektorer
De shRNA sekvenser for human OCT4 (OCT4-shRNA: 5′-CCCTCACTTCACTGCACTG-3 «) og survivin (Sur-shRNA: 5′-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3′) ble syntetisert og klonet, henholdsvis i pGenesil vektor (Wuhan Genesil Bioteknologi Co, Ltd, Wuhan, Kina), hvor de kodende sekvensene ble kontrollert av U6 promoter. Dual-shRNA vektor som inneholder doble shRNAs rettet mot både OCT4 og Survivin og mock kontroll shRNA vektor (Ctr-shRNA, 5»-GACTTCATAAGGCGCATGC-3 «) ble samtidig bygget.
ESCC celler i log fase ble transfektert med shRNA vektorer i en konsentrasjon på 4 mg /10
5 celler ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen Corporation Shanghai Representative Office, Shanghai, Kina). De transfekterte celler ble dyrket kontinuerlig ved 37 ° C i en CO
2 inkubator i ytterligere 48 timer, deretter høstet for fremstilling av å undersøke genekspresjon.
Western blotting-analyse
De høstede cellene ble lysert i fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) løsning, og det isolerte protein ble underkastet elektroforese på natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og undersøkt ved Western blotting ved anvendelse av anti-survivin og anti-OCT4 antistoffer. Blottene ble visualled av den forbedrede chemiluminescence reagens (PerkinElmer Inc., Shanghai, Kina).
semikvantitativ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Etter 48 timer av transfeksjon, total RNA ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) fra høstet Eca109 og TE1 cellelinjer, og oppløst i diethylpyrocarbonatetreated (DEPC) vann. Uttrykket av OCT4 og Survivin ble undersøkt ved hjelp av Takara Reverse Transcription System Kit (Takara Bioteknologi Co Ltd, Dalian, Kina) av OCT4 primere (følelse: 5′-CAG TCGTCAGCGTCGTCGTTGTAAGCTGCGGCCC-3 «, anti: 5»-ACGCGTCG ACTCAGTTTGAATGCATGGGAG -3 «, produkter 480 bp) og survivin primere (følelse: 5′-CGGAATTCACCATGGGTGCCCCGACG-3′, antisense: 5»-GAAGATC TTCAATCCATGGCAGCCAG-3 «, produkter 448-bp). Glyseraldehyd-3- phosphatedehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en kontroll lasting av primere (sense: 5»-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 «, antisense: 5′-TCCACCACCCTGT TGCTTGTA-3», produkt 120-bp). Band av produktene elektroforese på etidiumbromid (EB) -agarose gel ble analysert semikvantitativt av gråtoner densitometry analyse.
Analyse av Cellesyklus og apoptose ved flowcytometri (FCM)
Etter 48 h transfeksjon, de høstede cellene ble vasket med 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS) løsning og resuspenderte celler med 0,1 M PBS til konsentrasjonen av 10
6 celler /ml. En del av cellene ble løst i 1 ml på forhånd avkjølt 70% alkohol over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med propidiumjodid (PI) -løsning ved en konsentrasjon på 50 ug /ml og RNase A ved en konsentrasjon på 20 ug /ml for 30 min i mørket. Cellesyklus ble analysert ved FCM (FACS420, BD Biosciences, San Jose, California). En annen del av cellene ble inkubert med 5 pl Annexin V-FITC i 195 ul bindingsbuffer i mørke i 10 min. Cellene ble sentrifugert ved 1000 g i 5 minutter og resuspendert i 190 ul bindingsbuffer og 10 ul PI, fulgt av fl uorescence analyse.
Methylthiazoletetrazolium Assay
Eca109 og TE1 celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 8000 celler /brønn og transfektert med shRNA-vektoren som beskrevet ovenfor. Etter 48 timer, 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3,5-diphenytetrazoliumromide (MTT) ved 5 mg /ml ble tilsatt til hver brønn og inkubert kontinuerlig i 4 timer. Etter å ha tilsatt 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO) til hver brønn, absorbansen ble målt ved 490 nm.
Immuno fl uorescent Confocal Assay
Kreftceller ble høstet og fiksert med 4% formaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur, deretter vasket i 0,1 M PBS og behandlet med 0,3% Triton X-100, etterfulgt av inkubasjon med den angitte OCT4 (1:100) og survivin (1:100) primære antistoffer ved 4 ° C over natten, og de sekundære antistoffer, fl uorescein isotiocyanat (FITC) -konjugert anti-kanin-IgG eller cyanin-3 (Cy3) -merket geite-anti-mus IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), ved romtemperatur i 40 min i mørket. Cellene ble farget av 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) og oppdaget under en laserskanning konfokalmikroskop.
Statistical Analysis
chi-kvadrat test og Spearmans rang korrelasjon ble anvendt for å analysere forholdet og korrelasjon mellom relativ genekspresjon og klinisk patologiske data. OS ble vurdert av Kaplan-Meier metoden og signifikant forskjell i OS ble beregnet ved log-rank test. Univariate og multivariate analysene ble utført ved hjelp av Cox proporsjonal risikomodell. De eksperimentelle data var representative for tre uavhengige eksperimenter og analysert statistisk ved hjelp av to-veis analyse av varians (ANOVA) ved hjelp av PASW Statistisk programvareversjonen 18,0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Forskjeller ble ansett å være av betydning for
p
. 0,05
