Abstract
Bakgrunn
Lunge kreft står for mesteparten av hjernen metastaser som utgjør store terapeutiske utfordringer. Biomarkører prognosticating for utvikling av hjernemetastaser hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) kan forbedre personlig omsorg. Seks serum proteomikk biomarkører ble tidligere undersøkt ved Memorial Sloan Kettering men deres assosiasjoner med hjernemetastaser var ukjent.
Metoder
Serum NSE, Cyfra 21-1, ProGRP, SCC-Ag, TIMP1, og HE4 ved ELISA-baserte proteomikk analyser ble prospektivt samlet inn fra påfølgende pasienter med stadium IV NSCLC. Forbehandling serum biomarkør nivåer samt alder, histologi, og
epidermal vekstfaktor reseptor product: (
EGFR
) mutasjonsstatus ble evaluert for tilknytning til grunnlinjen tilstedeværelse av hjernemetastaser ved hjelp av logistisk regresjon og multivariabel analyse. For pasienter uten hjernemetastaser ved baseline, ble den kumulative forekomsten av påfølgende hjernemetastaser forhold i henhold til baseline biomarkører og kliniske faktorer ved hjelp Gray test.
Resultater
Totalt 118 pasienter ble inkludert, 31 (26%, 95% KI 0,19 til 0,35) hadde hjernemetastaser ved baseline og en ytterligere 26 (22%, 95% KI 0.15-0.30) utviklet hjernemetastaser senere. Før behandling serum biomarkør nivåene var tilgjengelig i 104 pasienter. Det var ingen signifikant sammenheng mellom de seks serum biomarkører og grunnlinjen nærvær eller senere utvikling av hjernemetastaser. Alder yngre enn 65 år var den eneste klinisk faktor signifikant assosiert med hjernemetastaser ved baseline (OR 3,00; 95% KI 1,22 til 7,34, P = 0,02) av multivariabel analyse. Det ble observert en trend mot økt kumulativ insidens av påfølgende hjernemetastaser hos pasienter med
EGFR
mutasjon (p = 0,2), men dette var ikke statistisk signifikant muligens på grunn av liten utvalgsstørrelse.
Konklusjoner
Serum NSE, Cyfra 21-1, Pro-GRP, SCC-Ag, TIMP1, og HE4 er ikke signifikant assosiert med hjernemetastaser. Våre metoder tar hensyn til oppfølgingstiden kan påføres på uavhengige datasett for å identifisere en pasient kohort med en høyere biologisk tilbøyelighet for utvikling av hjernemetastaser. Slik informasjon kan være nyttig for studiet av midler rettet mot utvikling av hjernemetastaser
Citation. Li BT, Lou E, Hsu M, Yu HA, Naidoo J, Zauderer MG, et al. (2016) Serum Biomarkører Associated med Kliniske resultater mislykkes i å forutsi hjernemetastaser hos pasienter med stadium IV Ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 11 (1): e0146063. doi: 10,1371 /journal.pone.0146063
Redaktør: Amit Dutt, Advanced senter for behandling, forskning og utdanning i Cancer, Tata Memorial Center, INDIA
mottatt: 20 juli 2015; Godkjent: 11 desember 2015; Publisert: 05.01.2016
Copyright: © 2016 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:. Ubegrenset filantropiske midler til Thoracic Oncology service på Memorial Sloan Kettering Cancer Center ble brukt til å støtte studien, som mottatt av MGK. Denne studien ble støttet av Core Grant (P30 CA008748) ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center fra National Institutes of Health, USA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Brain metastaser forbli den vanligste formen for sentralnervesystemet maligniteter og omtrent halvparten av dem stammer fra lungekreft [1, 2]. Til tross for fremskritt innen kreftbehandling, median overlevelse for pasienter med lungekreft hjernemetastaser som gruppe er bare 4-6 måneder [3]. Foreløpig er det ingen godkjent biomarkør som kan brukes av pasienter med lungekreft å pålitelig prognosticate for utvikling av hjernemetastaser. Studier som undersøker sammenhengen av
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)
mutasjon status og utvikling av hjernemetastaser har gitt blandede resultater, og studier viser en høyere forekomst av hjernemetastaser hos pasienter med
EGFR
mutasjon har ikke tatt hensyn til den relativt lengre overlevelse av disse pasientene [4-9]. Utviklingen av ikke-invasive prognostiske biomarkører for hjernemetastaser kan hjelpe velge risikopasienter høye med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) for mer intensiv avbildning av hjernen overvåking og forebyggende behandlingsstrategier slik som de vist seg å bedre overlevelse i småcellet lungekreft [ ,,,0],10, 11].
En tidligere studie publisert i
British Journal of Cancer
av Jacot
et al product: [12] har funnet at høye nivåer av serum neuron-spesifikk enolase (NSE) kan være forbundet med hjernemetastaser hos pasienter med lunge cancer. De høye nivåene av NSE ble antatt å være formidlet av neuronal skade på vev som omgir hjernemetastaser, men dette funn ble aldri uavhengig er validert [12]. Vår gruppe har tidligere utgitt en analyse av seks serum biomarkører: NSE, cytokeratin 19 fragment 21-1 (Cyfra 21-1), pro-gastrin-releasing peptid (Pro-GRP), plateepitelkarsinom antigen (SCC-Ag), vev inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP1), og humant epididymis protein 4 (HE4), og undersøkt deres evne til å forbedre ikke-invasiv diagnose og differensiering av histologiske subtyper av lungekreft [13]. I videre analyse av dette datasettet, vi har oppdaget trender mot økt serum biomarkør nivåer i undergruppe av pasienter med lungekreft hjernemetastaser. Vi derfor søkt å evaluere den prognostiske verdien av disse serum biomarkører ved å undersøke deres tilknytning til baseline tilstedeværelse og påfølgende utvikling av hjernemetastaser hos pasienter med NSCLC. Videre har vi også søkt å fastslå om kliniske faktorer som alder, histologi, og
EGFR
mutasjonsstatus, forbinder med utviklingen av hjernemetastaser, tar hensyn til overlevelse og oppfølging tid.
Materialer og metoder
Studiedesign og pasienter
Denne forskningen ble godkjent av Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Review Board. Vi gjennomførte en prospektiv studie ved MSK med hovedmål å vurdere den prognostiske verdien av serum-baserte biomarkører (NSE, Cyfra 21-1, Pro-GRP, SCC-Ag, TIMP1, og HE4) [13]. Påfølgende pasienter med metastatisk lungekreft behandlet på MSK mellom 2004 og 2008 ble bedt om å være registrert. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke og serumprøver ble samlet inn før initiering av kjemoterapi. De kvantitative verdier av serum biomarkører ble retrospektivt analysert for deres tilknytning til grunnlinjen tilstedeværelse og påfølgende utvikling av hjernemetastaser. Alle pasientene i denne analysen hadde patologisk bekreftet stadium IV NSCLC. Pasient clinicopathologic kjennetegn som alder, histologi og
EGFR
mutasjonsstatus ble evaluert for tilknytning til grunnlinjen tilstedeværelse og påfølgende utvikling av hjernemetastaser.
Plasma biomarkør analyser
Prøver ble samlet , lagret ved -80 ° C, bearbeidet og analysert ved et MSK Kliniske Laboratory forbedring Endringer (CLIA) sertifisert laboratorium. Vi utførte serum biomarkør analyse ved anvendelse av validerte kommersielt tilgjengelige enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) kits. Den Canag NSE EIA ikke-kompetitiv immunoassay (
Fujirebio Diagnostics AB
,
Sverige
) ble anvendt sammen med to monoklonale antistoffer rettet mot αγ formen av glykolytiske enzym enolase (2-fosfo-D- glycerate hydrolase, EC 4.2.1.11). Den Cyfra 21-1 EIA (
Fujirebio Diagnostics AB
,
Sverige
) ble brukt med to monoklonale antistoffer (MAb) spesifikke for cytokeratin 19 i serum. Den Canag ProGRP EIA (
Fujirebio Diagnostics AB
,
Sverige)
ikke-konkurrerende analyse ble brukt. Den Canag SCC EIA ikke-konkurrerende immunoassay (
Fujirebio Diagnostics AB
,
Sverige
) ble utført ved hjelp av direkte sandwich-teknikk. Den kvantitative sandwich-enzym immunoassay ble brukt for å vurdere menneskelig TIMP1
(Quantikine® R D System
,
Minneapolis
,
Minnesota)
. Den HE4 EIA (
Fujirebio Diagnostics AB
,
Sverige)
ble brukt med to muse monoklonale antistoffer (2H5 og 3D8) rettet mot to epitoper i C-WFDC domene HE4.
Ninety åtte-brønns plater ble belagt og analysert ved hjelp av en robot plate analysator. Mikroplater ble belagt med følgende pepperrot peroksidase-merket MAb: anti-NSE MAb E17, anti-Cyfra 21-1 MAb, anti-ProGRP MAb E146, anti-SCC MAb, anti-TIMP1 MAb, og biotinylert anti-HE4 MAb 2H5. Serumprøver ble deretter tilsatt og inkubert med den indikerte monoklonalt antistoff. Etter vasking ble kromogen reagens (hydrogenperoksyd og 3, 3 «, 5, 5’tetrametylbenzidin) tilsatt til hver brønn. For TIMP1, etter vasking en enzymkoblet polyklonalt antistoff som er spesifikt for TIMP1 ble tilsatt til mikroplaten. Etter vasking, ble et substrat løsning til hver brønn
Statistisk analyse
Nivåene av biomarkører ble dikotomisert ved øvre normalgrense basert på tidligere publiserte data. NSE (20 ng /ml ), Cyfra 21-1 (3,3 ng /ml), Pro-GRP (50 pg /ml), SCC-Ag (2,5 ng /ml), TIMP1 (58,9 ug /l), og HE4 (83 pmol /L) [ ,,,0],14-19]. Data ble hentet fra en prospektiv vedlikeholdt anonymisert klinisk database ved MSK.
For å undersøke hvorvidt disse serum biomarkører (høy kontra normal) og kliniske faktorer som alder, histologi og
EGFR
mutasjon har prognostisk verdi for hjernemetastaser, må vi først analysert deres tilknytning til tilstedeværelse eller fravær av hjernemetastaser ved stadium IV diagnose og deretter med utvikling av påfølgende hjernemetastaser hos pasienter som ikke har baseline hjernemetastaser. Association faktorer med tilstedeværelse av hjernemetastaser ble evaluert ved hjelp av logistisk regresjon. Univariat analyse ble utført på alle variabler, og hvis ble observert noen signifikant sammenheng, ble nødvendig da ikke lenger multivariabel analyse. Hvis en faktor ble funnet å være signifikant assosiert med hjernemetastaser på univariat analyse, ble en multivariabel logistisk regresjonsmodell montert for å evaluere foreningen justert for klinisk relevante kovariater.
Neste, vi fanget datoene for den senere utviklingen av hjernemetastaser hos pasienter som ikke hadde baseline hjernemetastaser. En tid til arrangementet tilnærming med konkurrerende risiko metoden som er benyttet for å analysere dette utfallet som det tar hensyn til forskjeller i oppfølgingstiden og de mange dødsfallene i denne metastatisk befolkningen som utelukker observere en hjernemetastaser [20]. Vi brukte den kumulative insidensen funksjonen for å anslå sannsynligheten for påfølgende hjernemetastaser hvor døden uten hjernemetastaser ble ansett som et konkurrerende arrangement. Sammenhengen mellom biomarkør nivåer (høy kontra normal) og den kumulative forekomsten av påfølgende hjernemetastaser ble vurdert av Gray test. En tilsvarende metode ble anvendt for å vurdere de kliniske faktorer for assosiasjon med utvikling av påfølgende hjernemetastaser. For alle analysene ble en p-verdi mindre enn 0,05 betraktet som signifikant. Konkurrerende risikoanalyse ble analysert ved hjelp av
cmprsk
pakken i R versjon 3.1.1 (https://www.R-project.org). Alle andre statistiske analyser ble utført ved hjelp av SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC)
Resultater
Pasient egenskaper
Totalt 118 pasienter med stadium IV NSCLC som var behandling naive ble inkludert, 57 (48%) av dem utviklet hjernemetastaser, oppdaget enten ved diagnose (n = 31, 26%, 95% KI: 0,19 til 0,35) eller senere under behandlingen (n = 26, 22%, 95% KI: 0,15 til 0,30) (tabell 1). Median alder var 64 år (range 36-85), 68 kvinner og 50 menn. Ved histologisk inndeling i undergrupper, 99 hadde adenokarsinom, 13 hadde plateepitelkarsinom, og 6 hadde NSCLC ikke annet er spesifisert. Baseline før behandling serum biomarkører var tilgjengelig for 104 pasienter. Slitasje skyldes enten savnet forbehandling samling eller tapt prøver.
EGFR
mutasjonstesting ble utført på 44 pasienter som testing var klinisk utvalg per standard vare på den tiden. Av de som ble testet, 17 pasienter hadde
EGFR
mutasjon, hvorav 11 (65%) hadde hjernemetastaser enten ved baseline eller senere.
Association of serum-baserte biomarkører med hjernemetastaser
av de 104 pasienter som hadde før behandlingslinjen serum biomarkører oppsamlet, var det en jevn fordeling av pasienter med hjernemetastaser i utgangspunktet (n = 26, 25%), sammenlignet med pasienter som senere utviklet hjernemetastaser (n = 25, 24%) (tabell 2). Median oppfølging blant overlevende i dette kullet var 7 år (fra 3.6-9 år). Antallet pasienter med baseline biomarkører høye vs. normal i forhold til hjernemetastaser er beskrevet i tabell 2.
For hvert serum biomarkør testet ved baseline (NSE, Cyfra 21-1, Pro-GRP, SCC-Ag, TIMP1, og HE4), univariat analyse av enkelt biomarkører ikke ga noen tilknytning med tilstedeværelse av hjernemetastaser ved baseline dermed ikke lenger multivariat analyse ble utført (tabell 3).
i pasienter uten hjernemetastaser ved baseline, var det ingen signifikante forskjeller mellom pasienter med høy kontra normal før behandling biomarkør nivåer i forhold til forekomsten av påfølgende hjernemetastaser på tvers av alle tidspunkter (fig 1). Det var en tendens mot høyere kumulativ hyppighet av hjernemetastaser hos pasienter med høyt basislinje HE4 forhold til de med normale nivåer av HE4, men dette var ikke statistisk signifikant (P = 0,07). Ingen videre multivariabel analyse ble utført siden ingen faktorer var signifikant assosiert med den kumulative forekomsten av påfølgende hjernemetastaser. Statistiske sammenligninger av påfølgende hjernemetastaser basert på TIMP1 og SCC-Ag nivåer var ikke mulig på grunn av for få pasienter eller hendelser (tabell 2).
Association of alder og NSCLC histologi med hjernemetastaser
i forhold til pasienter i alderen 65 år eller eldre, pasienter yngre enn 65 år hatt betydelig flere hjernemetastaser ved baseline (36% vs. 16%, Odds Ratio [OR 3,01], 95% CI: 1.24 til 7.28, p = 0,01) (Tabell 3). Denne foreningen forble signifikant i multivariabel analyse justert for histologi og
EGFR
mutasjonsstatus (OR 3,00, 95% KI: 1,22 til 7,34, P = 0,02) (Tabell 4). Men blant pasienter uten baseline hjernemetastaser, var det ingen signifikant forskjell mellom aldersgruppene i forekomsten av påfølgende hjernemetastaser (P = 0,5) (fig 2).
Når det gjelder histologi, var det ingen signifikante forskjeller mellom pasienter med adenokarsinom og plateepitelkarsinom histologi i forhold til baseline tilstedeværelse av hjernemetastaser (OR = 0,84, 95% KI: 0,22 til 3,30, P = 0,81) (Tabell 3). Hos pasienter uten hjernemetastaser ved baseline, var det ingen signifikant forskjell mellom pasienter med adenokarsinom og plateepitelkarsinom histologi i forhold til deres samlede forekomst av påfølgende hjernemetastaser på tvers av alle tidspunkter (P = 0,51) (figur 2).
Association of
EGFR
mutasjonsstatus med lungekreft hjernemetastaser
av de 44 pasientene som ble testet for
EGFR
mutasjon, ble 17 pasienter testet positivt, hvorav 11 (65 %) hadde hjernemetastaser ved slutten av studien, med 4 ved baseline og 7 senere. Til sammenligning, bare 11 av 27 pasienter (41%) testet negativt for
EGFR
mutasjon hadde hjernemetastaser ved slutten av studien, herunder 5 ved grunnlinjen og deretter 6 (tabell 1). Den ELLER knytte
EGFR
mutasjon med baseline hjernemetastaser var 1,35 (P = 0,69) (tabell 2). Hos pasienter uten hjernemetastaser ved diagnose av trinn IV NSCLC (n = 35), var det en tendens mot høyere kumulativ hyppighet av hjernemetastaser hos pasienter testet positivt for
EGFR
mutasjon sammenlignet med dem som ble testet negativt. (P = 0,22) (figur 2).
Diskusjoner
Vår studie fant ikke signifikant sammenheng mellom noen av 6 pre-behandling serum biomarkører og grunnlinjen tilstedeværelse eller den påfølgende utvikling av hjernen metastaser hos pasienter med stadium IV NSCLC. Vår studie motbeviste hypotesen ved Jacot
et al product: [12] at serum NSE kan være en spesifikk markør for nevronale skader fra hjernemetastaser. Metodiske forskjeller kan ha stått for forskjeller i konklusjonene, ettersom studien ved Jacot
et al product: [12] undersøkte overlevelsen av pasienter med lungekreft hjernemetastaser, og vår studie undersøkte alle metastatisk lungekreft pasienter for deres baseline eller senere utvikling av hjernemetastaser. En eldre studie av pasienter med småcellet lungekreft etter van de Pol
et al product: [21] viste også at mens serum NSE nivåene steg med utviklingen av metachronous hjernemetastaser, endringer i NSE nivåer var ikke spesielt for intrakraniell sykdomsaktivitet. Mens vår publiserte primære analysen [13] gjorde bekrefte funn av Jacot
et al product: [12] at baseline forbehandling NSE-nivå var prognostisk for total overlevelse (HR 1,266, P = 0,0298), vår studie tyder på at serum NSE er ikke en spesifikk biomarkør for lungekreft hjernemetastaser og slike videre studier bør ikke bli forfulgt.
til dags dato har ingen serum biomarkør for hjernemetastaser er validert hos pasienter med NSCLC. Lee et al [22] fant at forbehandling serum carcinoembryonic antigen korrelert med hjernemetastaser hos pasienter med NSCLC. Imidlertid ville en uavhengig valideringen trenger å ta hensyn til tidspunktet for hjernemetastaser og overlevelse for en biomarkør for å bli ansett som biologisk relevant og klinisk nyttig ved valg av pasienter med høy risiko for etterfølgende utvikling av hjernemetastaser for personlig pleie.
observasjonen fra denne studien at pasienter med alder yngre enn 65 år er signifikant assosiert med hjernemetastaser ved baseline er i samsvar med tidligere publiserte rapporter [11, 23]. En stor retrospektiv gjennomgang av databasen South Oncology Group (SWOG) av Gaspar et al [23] viste at yngre alder og adenokarsinom histologi ble assosiert med utvikling av hjernemetastaser. Enten yngre alder og adenokarsinom histologi har en høyere biologisk tilbøyelighet mot utvikling av hjernemetastaser ikke kunne være tilstrekkelig ivaretatt ved denne studien gitt lite antall pasienter som utviklet påfølgende hjernemetastaser (25 hendelser). Eventuelle ytterligere forsøk på å undersøke korrelasjon mellom alder og histologi med utviklingen av hjernemetastaser ved hjelp av uavhengige datasett må ta hensyn til forskjeller i overlevelse og oppfølging tid.
På grunn av begrenset antall pasienter som hadde gjennomgått
EGFR
mutasjon på tidspunktet for denne studien, var vi ikke i stand til å endelig løse uenighet om sammenhengen mellom
EGFR
mutasjon og utvikling av hjernemetastaser. Men våre metoder var vesentlig annerledes enn tidligere studier i forsøket på å ta opp dette spørsmålet [4-9]. Mange tidligere studier har sett på et sett av pasienter med NSCLC og kjente hjernemetastaser, og så på forekomsten av
EGFR
mutasjoner i denne utvalgte gruppen uten regnskap for overlevelse og tid til utvikling av hjernemetastaser [4, 5 , 7]. Mens flere rapporter har funnet en høyere forekomst av hjernemetastaser hos pasienter med
EGFR
mutant lungekreft, har det aldri vært vist hvorvidt dette skyldes en biologisk tilbøyelighet eller ganske enkelt en følge av lengre tids overlevelse av disse pasienter på grunn til EGFR målrettet terapi [24-26]. I vår studie har vi ikke bare vurdert for tilstedeværelse av hjernemetastaser, men også tid til utvikling av hjernemetastaser på tvers av alle tidspunkter tar dermed hensyn til forskjeller i overlevelse og oppfølging tid.
Det er flere begrensninger i denne studien. Analysen ble gjort retrospektivt som kan ha introdusert bias. Videre størrelsen på utvalget var relativt lite og begrenset antall
EGFR
mutasjonstesting har forhindret ethvert firma utforskende statistisk analyse. Slitasje på grunn av tapte samlinger eller tapt prøver fremhever de praktiske utfordringene i utformingen av en biomarkør studie. Til tross for disse begrensningene og negative resultater, var det ingenting som tyder på at serum biomarkører studert kan brukes klinisk til prognosticate for utvikling av hjernemetastaser. Mens det var en trend mot en sammenheng mellom høyt nivå av HE4 og økt påfølgende utvikling av hjernemetastaser (p = 0,07), kan en slik biomarkør ikke anbefales for klinisk anvendelse uten uavhengig validering av en meget signifikant krets. Gitt serum HE4 ble nylig vist å være assosiert med dårlig prognose hos pasienter med NSCLC [27], videre valideringsstudier kan være berettiget.
Den største styrken til denne studien er våre metoder for å bestemme foreningen av biomarkører med hjernen metastaser både jevnt ved baseline og etter reisen, samt regnskap for tid og pasient overlevelse. For å bekrefte sammenhengen mellom
EGFR
mutasjon eller andre biomarkører og utvikling av hjernemetastaser over tid, kan uavhengige datasett bli analysert ved hjelp av de samme metodene.
Det er verdt å påpeke at mens ikke-invasive prognostiske biomarkører for utvikling av hjernemetastaser er viktig for å forbedre personlige behandlinger av pasienter, må slike biomarkører bli vist seg å være svært følsom og spesifikk for å være klinisk nyttig. Enhver positiv assosiasjon funnet av lete analyser må være uavhengig valideres før klinisk anvendelse [28]. Ved hjelp av serum NSE som et eksempel, til tross for tidligere rapporter, vår uavhengig studie fant at det ikke er en spesifikk biomarkør for lungekreft hjernemetastaser. Videre gjør store uavhengige datasett ikke eksisterer for alle biomarkører. Dermed når utvikle nye serum biomarkører for hjernemetastaser, er avgjørende for deres potensielle kliniske verktøyet en høy omfanget av effekten.
I konklusjonen, dette uavhengig biomarkør studie fant at de 6 før behandling serum biomarkører inkludert NSE var ikke forbundet med referanse tilstedeværelse eller senere utvikling av hjernemetastaser hos pasienter med metastatisk lungekreft. Våre metoder kan anvendes for å uavhengige datasett for å identifisere en pasient kohort med en høyere biologisk tilbøyelighet for utvikling av hjernemetastaser som tar hensyn til forskjellen i oppfølgings tid. Slik informasjon kan være nyttig for studiet av midler rettet mot utvikling av hjernemetastaser.
Takk
Vi takker Michael Franklin, M.S., for redaksjonell bistand og kritisk gjennomgang av dette manuskriptet. Vi takker også IOS Press BV (Nederland) for å gi tillatelse til å bruke tidligere publiserte deler av Materialer og metoder fra vår tidligere publikasjon som følger: Lou E, Johnson M, Sima C, Gonzales-Espinoza R, Fleisher M, Kris MG, Azzoli CG, serum biomarkører for vurdering histologi og resultater hos pasienter med metastatisk lungekreft. Kreft Biomark. 2014; 14 (4): 207-14, med tillatelse fra IOS Press
.
