Abstract
kreft i bukspyttkjertelen (PC) restene den fjerde største årsaken til kreftdød med en uakseptabel overlevelse som har holdt seg relativt uendret de siste 25 årene. Tilstedeværelsen av okkulte eller kliniske metastaser ved diagnosetidspunktet sammen med mangelen på effektive chemotherapies utgjøre et akutt behov for å utforme nye og målrettede terapeutiske leveranser som favoriserer den kliniske utfall. Heri, undersøkte vi anti-karsinogent potensial av polyfenoler fra fem forskjellige brunalger i humane PC-celler (MiaPaCa-2, Panc-1, BXPC-3 og PANC-3,27). Total antioksidant kapasitet (TAC) analyse på stegvise polyphenol separasjoner med økende polaritet (Heksan-DCM-EA-metanol) identifiserte høye nivåer av TAC i DCM og EA utdrag tvers av alle tang vurdert. All DCM og EA separert polyfenoler induserte en dose-avhengig og vedvarende (tidsuavhengig) inhibering av celleproliferasjon og levedyktighet. Dessuten har disse polyfenoler dypt forbedrede DNA-skade (akridin orange /etidiumbromidfarging og DNA-fragmentering) i alle cellelinjene som ble undersøkt. Enda viktigere, luciferase reporter-analyse viste en signifikant inhibering av NFKB transkripsjon i celler behandlet med polyfenoler. Interessant, QPCR analyse identifisert en differensial ennå klar regulering av pro-tumorigent EGFR, VEGFA, AKT, hTERT, Kras, BCL2, FGFα og PDGFα transkripsjon i celler behandlet med DCM og EA polyfenoler. Immunoblotting validerer hemmende potensialet for tang polyfenoler i EGFR fosforylering, Kras, AurKβ og Stat3. Sammen utgjør disse data tyder på at middels polaritet basert fraksjoner av tang polyfenoler kan betydelig forsterke tumor celledreping og kan tjene som potensielt legemiddel leveransen til PC kur. Flere studier dissekere ut de aktive bestanddelene i potente fraksjoner, virkningsmekanismer og synergisme, om noen, er garantert og er for tiden i ferd
Citation. Aravindan S, Delma CR, Thirugnanasambandan SS, Herman TS, Aravindan N (2013) Anti-kreft i bukspyttkjertelen Leveransen fra Sea: First-Hand Bevis på Effekt, molekylære mål og Virknings for Mangfoldige Polyfenoler fra fem forskjellige brunalger. PLoS ONE 8 (4): e61977. doi: 10,1371 /journal.pone.0061977
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: Per 31. desember 2012; Godkjent: 15 mars 2013; Publisert: 16 april 2013
Copyright: © 2013 Aravindan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne støttes av forskning bistandsmidler fra Institutt for Radiation Oncology ved University of Oklahoma Health Sciences Center til N. Aravindan og, Government of India, Ministry of Science and Technology (DBT Sanksjon Best.-nr. Dato: BT /PR11535 /AAQ /03/431/2008, 17.09.2009) stipend (Evaluering av polyfenoler og Polysakkarider fra Phaeophytes mot oksidativt stress og kreft progresjon for Drug Development) til T. Somasundaram. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Vær oppmerksom på at medforfatter Natarajan Aravindan er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle og noen av PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen (PC) forblir den fjerde største årsaken til kreftdød i USA med en forventet 43,920 nye tilfeller i 2012 [1]. Dessverre, PC dødelighet forble relativt uendret siden 1975, med en 5-års overlevelse på bare 5,4% [2]. Tilstedeværelsen av okkult eller kliniske metastaser på diagnosetidspunktet sammen med mangelen på effektive kjemoterapier bidrar til høy dødelighet hos pasienter med PC. For dette formål, behandling av PC, svært avhengige av bedre forståelse av genetikk og biologi [3], som kan være nært forbundet med tumordannelse og metastasedannelse. Dessuten er PC-en av de mest egenmedikamentresistente tumorer og, er motstand mot kjemoterapeutiske midler en vesentlig årsak til behandlingssvikt i PC. Til tross for omfattende forskning på mange målrettede terapier med gode anti-tumor effekter i prekliniske modeller, klinisk undersøkelse viste at enkelt målrettet terapi og mest kombinerte behandlingsformer var ikke i stand til å forbedre prognosen for denne sykdommen. Det er bemerkelsesverdig å nevne at det er 1344 pågående kliniske studier (www.clinical trials.gov åpnes 30. november 2012) i dag, rettet mange potensielle molekylære mål med en rekke lovende Gassrør narkotika-leveranser. Til tross for en slik kolossal forsøk på å dempe PC progresjon og spredning, i sanntid, er vi i langt nær de akseptable overlevelse. Delvis er dette tilskrives det faktum at PC-en kan ha forskjellige egenskaper og mål i forskjellige stadier av patogenese, vedlikehold og metastase [4]. Videre krysstale mellom cellesignalveier, et viktig fenomen i PC-en, kan det føre til kreft celle overlevelse og metastasering, selv om noen veier er blokkert av målrettet terapi. Følsomhet for terapi kan også variere etter kreftceller på ulike stadier. Den unike PC struktur med rikelig stroma skaper en svulstens mikromiljø med hypoksi og lav blod perfusjon rente, som hindrer levering av legemidler til kreftceller. Derfor er det en opprivende behov for å utforme nye og målrettede terapeutiske strategier som kan forbedre kliniske utfall for pasienter diagnostisert med PC. Følgelig her vi undersøkt anti-PC potensialet av polyfenoler fra en uvanlig kilde, marine brunalger.
Macro alger (sjø ugress) er viktige kilder til protein, jod, vitaminer og mineraler, og dermed har vist seg å ha chemo forebyggende potensialer [5]. Videre studier har konsekvent vist at de tang har et høyt innhold av polyfenoler som catechin, epicatechin, epigallocatechin galat og gallisk syre (se anmeldelse [6]). Disse polyfenoliske forbindelser har vist mange helse fordel bioaktiviteter så som anti-oksidanter, anti-kreft, anti-viral, anti-inflammatorisk, og en evne til å hemme human blodplateaggregering 6,7. I tillegg studier har vist en positiv sammenheng mellom økt inntak av naturlige antioksidanter og redusert koronar hjertesykdom, kreft dødelighet, samt lengre levetid [6], [8]. En nær sammenheng mellom anti-kreftfremkallende aktivitet og antioksidantaktivitet har blitt rapportert i musemodeller av kreft med polyfenoler [9] – [12]. I tillegg note, nyere undersøkelser nettopp demonstrerte anti-proliferativ, pro-apoptotisk, DNA-skade, anti-angiogene, veksthemmende, cellesyklus-stans og anti-metastatiske funksjoner av tangekstrakter i en rekke tumormodeller, inkludert melanom, nasofaryngeal, gastrisk karsinom, brystkreft etc. [13] – [18]. Imidlertid er disse studiene begrenset til polysakkarider og /eller råekstrakter, og fordelen av tang polyfenoler eller deres aktive komponenter mot bukspyttkjertelen kreftutvikling og /eller dets progresjon (hvis ikke for noen tumor) er aldri blitt undersøkt. Videre en grundig innsikt i effekten av tang polyfenoler i denne innstillingen, sitt potensial i reguleringen av tumorcellesignalering, virknings (potensielle ennå bestemte molekylære mål, hvis noen), gjenstår å reconnoitered. På grunn av det faktum at polyfenoler målrette mot nøkkelcellesignalbaner, undersøkte vi effekten av polyfenoler fra fem forskjellige brunalger i PC-innstillinger. Denne studien gir førstehånds bevis på antioksidanter, anti-proliferative og celle drepe potensialer av polaritet basert utdrag av disse tang. Videre denne studien viser også potensialet i de uttrukne polyfenoler på store tumorprogresjon molekylære mål inkludert NFkB, EGFR, Kras, STAT3, VEGF, AKT, TERT, FGFA, BCL2 og PDGFA.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneske Panc-1 (ATCC-CRL1469), Panc-3,27 (ATCC-CRL2549), BxPC-3 (ATCC-CRL1687), og MIA Paca-2 (ATCC-1420) celler ble hentet fra Dr Daniel J. Brackett (Institutt for kirurgi, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, OK). Kultur og vedlikehold av Panc-1, BxPC-3, og MIA PACA-2-celler ble utført som beskrevet tidligere [19]. Panc-3,27-celler ble opprettholdt som monolagskulturer ved ukentlige seriell passasje i 100 mm vevskulturskåler i høy glukose RPMI-1640 medium med 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 1 500 mg /l natriumbikarbonat, 10units /ml humant rekombinant insulin og 15% føtalt bovint serum. MCF10A (ATCC-CRL10317), Human aorta glatte muskelceller (HASMC, ATCC-PCS-100-012) og menneskelig iliacusarterie endotelceller (HIAE, ATCC) celler ble hentet fra Dr. Mohan Natarajan (University of Texas Health Sciences Center på San Antonio, TX). Celler ble opprettholdt som monolagkulturer i Medium 199 (Life Technologies, Grand Island, New York) supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 1500 mg /L natriumbikarbonat, MEM vitaminer, ikke-essensielle aminosyrer, penn /strep og 10% HIFBS. For MCF10A mediet ble i tillegg supplert med melke epithelial Growth Supplement (Life Technologies) og kolera toksin (Sigma). For passasje og for alle forsøkene ble cellene løsnet ved hjelp av trypsin (0,25%) /EDTA (1%), resuspendert i fullstendig medium, telles elektronisk på Countess automatisk celleteller (Carlsbad, CA) og inkubert i en 95% luft /5% CO2 fuktet inkubator.
polyphenol utvinning og celle behandlinger
Celler belagt i 100 mm vevskulturplater inneholder 6 ml komplett vekstmedium fikk lov til å vokse opp til 70% til 80 % samløpet. Fem arter av brunalger,
Dictyota dichotoma plakater (DD),
Hormophysa triquerta plakater (HT),
Spatoglossum asperum plakater (SA),
Stoechospermum marginatum
(SM) og
Padina tetrastromatica product: (PT) ble hentet fra Mandapam kysten, Gulf of Mannar, Sør østkysten av India. Tang og tare er samlet som en del av Institutt for vitenskap og teknologi, Government of India sponset DBT-prosjektet, og siden denne samlingen ikke involverer noen truede eller vernede arter, ingen spesielle tillatelser var nødvendig (Forest Department, Government of India unntatt). Ferskt innsamlet alger ble vasket, ovnstørket og deres pulver ble brukt for sekvensiell ekstraksjon av polyfenoler i gradient (økning) polaritet oppløsningsmidler inkludert heksan (H), diklormetan (DCM), etylacetat (EA) og metanol (M). I korte trekk, ble 50 g pulverisert alger fuktet i tre volumer av spesifikk løsningsmiddel ristet i 48 timer ved romtemperatur. Oppslemmingen ble filtrert gjennom Whatman filterpapir, etterfulgt av inkubasjon av resten i den etterfølgende løsemidlet. Resulterer fire filtrater ble tørket helt i pre-veid mikro sentrifugerør bruker speedvac (Thermo Scientific, Asheville, NC). De tørkede filtrater ble veid og oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) til en slutt lager-konsentrasjon på 100 mg /ml. For celle behandling, polyfenol » lager » oppløsninger ble ytterligere fortynnet i vanlig cellekultur (DMEM) medium til en » » arbeidskonsentrasjon på 10 mg /ml. Celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner (10, 50, 100 ug /ml) av polyfenoler og tillatt å inkubere ved 37 ° C i 3 timer og 24 timer, med mindre annet er nevnt eller i teksten. Sluttkonsentrasjonen av DMSO i cellekulturmediet var. 0,0001%
Total antioksidant kapasitet analyse
For å bestemme antioksidant potensialet i 20 polyphenol brøkdel som består av 4 karakteristiske fraksjoner fra hver tang fra totalt 5 tang og tare, total antioksidant kapasitet analyse (TCA) ble utført som beskrevet av Prieto og medarbeidere [20]. I korte trekk, ble to deler av hver ekstraksjon ved forskjellige konsentrasjoner (100, 250, 500 pg /ml og 1 mg /ml) blandes med en del av TCA-reagens (0,6 M svovelsyre, 28 mM natriumfosfat og 4 mM ammoniummolybdat) og inkuberes ved 95 ° C i 90 min. Absorbansen ble målt ved 635 nm ved hjelp av Synergy II mikroplateleser (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT). Gallussyre (GA) ble anvendt som den positive kontroll, og negative kontroller med rene oppløsningsmidler ble også inkludert. Fraksjoner som utviser høye nivåer av total antioksidant kapasitet vil bli benyttet for videre (anti-PC) analyse.
celleviabilitet
Trypan blå eksklusjon assay ble anvendt for å identifisere effekten av tang polyfenoler i reguleringen av PC-celle-levedyktighet. Mia-PACA-2, Panc-1, Panc-3,27 og BxPC-3-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner (10, 20, 50 eller 100 ug /ml) av diklormetan fraksjoner (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) eller etylacetat fraksjoner (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) ble undersøkt etter 24 timer for endringer i celle levedyktighet. Kvantitativ vurdering ble gjort ved hjelp av grevinnen automatisert celleteller som beskrevet tidligere [19] og sammenlignet med ubehandlede kontroller ved hjelp av to-veis ANOVA med Bonferonii post-hoc test (GraphPad PRISM v4.03, GraphPad Prism Software Inc., La Jolla, CA) . AP verdi av 0,05 regnes som statistisk signifikant
Cell overlevelse
Cell overlevelse ble analysert ved hjelp CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, USA) i Panc-. 1 og MIA PACA-2-celler behandlet med diklormetan (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) eller etylacetat (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA HT-EA) fraksjoner følgende produsentens protokoll. I korte trekk-celler (5.000 celler /brønn) sås i 96-brønns plate med 200 ul /brønn vekstmedium ble inkubert ved 37 ° C i en periode 24 timer. For doseeskaleringsstudier celler ble utsatt for økende konsentrasjoner (10, 20, 50 og 100 mikrogram /ml) av tang polyfenoler og analysert etter 3 timer. For tidsavhengige gjenvinnings-studier, ble cellene behandlet med 100 ug /ml av polyfenol-fraksjoner og undersøkt etter 3, 24, 48 eller 72 timer. Etter behandling, vekstmediet var omhyggelig og fullstendig fjernet, og platene ble holdt under frysepunktet (-70 ° C) i ytterligere 24 timer. Frosne celler ble deretter lysert med CyQUANT® GR fargestoff /celle-lyseringsbuffer (200 ul /brønn) ved romtemperatur, beskyttet mot lys i 5 minutter og fluorescens (480 nm eksitasjon og 520 nm emisjon) ved anvendelse av Synergy II mikroplateleser ( BioTek). Alle prøvene ble analysert in triplo. Negative kontroller uten celler ble inkludert. Gruppevise sammenligninger ble gjort ved hjelp av to-veis ANOVA med Bonferonii post-hoc test (GraphPad PRISM) og en P-verdi på 0,05 regnes som statistisk signifikant. Videre, for å avgjøre hvorvidt denne polyfenol (er) som drives anti-spredning er tumor-celle selektiv og, for å avgrense deres normale celle cytotoksisitet, om noen, undersøkte vi deres virkninger på primære celler. For dette, MCF10A, HIAE og HASMC-celler behandlet med 100 ug /ml DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT- EA eller HT-EA ble undersøkt etter 24 timer for endringer i celleproliferasjon.
Nuclear morfologi av dual farging
Panc-1, Panc-3.27, BxPC-3 og Mia-Paca-2 -celler (5 x 10
5-celler) dyrket i 4-brønners plate (Nunc) ble behandlet med 100 ug /ml av diklormetan (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) eller etylacetat (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fraksjonene ble analysert etter 24 timer for kjernefysisk morfologi som tidligere beskrevet [21].
DNA fragmentering på agarosegeler
DNA rakner assay ble anvendt for å identifisere effekten av tang polyfenoler i indusering av PC-celle DNA-fragmentering. I korte trekk, DNA fra Panc-1, Panc-3.27, BxPC-3 og Mia-Paca-2 celler behandlet med DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA -EA, SM-EA, PT-EA og HT-EA i 24 timer ble ekstrahert med DNA stat-60 (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA) etter produsentens anvisninger. DNA-prøver (5 mikrogram) ble elektroforese i 2% agarose gel som inneholder etiumbromid visualisert ved hjelp ChemiDoc ™ XRS imager (Biorad, Hercules, CA) og kvantifisert ved hjelp Mengde-One bildeanalyse programvare (Biorad). Gruppevise sammenligninger ble gjort ved hjelp av variansanalyse med Tukey post-hoc korreksjon. AP verdi av 0,05 regnes som statistisk signifikant
Plasmid Forberedelse, DNA Transfeksjon og luciferaserapportørplasmid analysen
Endringer i NFkB promoter aktivering i diklormetan (DD-DCM, SA-DCM, SM. -DCM, PT-DCM, HT-DCM) eller etylacetat (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fraksjoner behandlet Panc-1, BxPC-3 og MiaPaCa-2 celler undersøkt ved hjelp av luciferase reporter analysen. Den pNFκB-Luc plasmidkonstruksjonen ble amplifisert og renset som beskrevet i våre tidligere studier [22], [23]. Cellelysater fra cellen behandlet i 24 timer ble analysert for luciferase aktivitet i henhold til produsentens protokoll (Biovision Forskning Products, Mountain View, California) og gruppen kloke sammenligninger ble gjort ved hjelp av ANOVA med Tukey post-hoc korreksjon. AP verdi. 0,05 regnes som statistisk signifikant
QPCR
Transkripsjon endringer av nøkkel tumor progresjon molekyler inkludert,
BCL2, EGFR, PDGFA, VEGF, AKT, TERT, Kras og FGF
i diklormetan (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) eller etylacetat (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA ) fraksjoner som ble behandlet (i 3 t) Panc-1, Panc-3,27, BxPC-3 og MiaPaCa-2-celler ble analysert ved sanntids QPCR som tidligere beskrevet [23]. Vi brukte β
aktin
som en positiv kontroll, og en negativ kontroll uten mal RNA ble også inkludert. Hvert forsøk ble utført i triplikat, og
ΔΔ
C
t-verdier ble beregnet ved normalisering av genekspresjon nivåene til p
p-aktin
, og den relative ekspresjonsnivået ble uttrykt som en fold endring.
Immunoblotting
Panc-1, BxPC-3 og MiaPaCa-2-celler eksponert for diklormetan (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT -DCM) eller etylacetat (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fraksjonene ble analysert etter 24 timer for endringer i fosforylering av EGFR og proteinnivåer av KRAS, STAT3, EGFR og AURKβ. Totalt protein utvinning og immunblotting ble utført som beskrevet i våre tidligere studier [23], [24]. For denne studien ble protein overført membraner inkubert enten med kanin monoklonalt anti-pEGFR
(Tyr1068) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), Kras (Proteintech Group, Inc. Chicago, IL, USA), STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA) eller mus monoklonalt EGFR (Santa Cruz), AURKβ antistoff (Proteintech). Blottene ble strippet og reblotted med muse-monoklonalt anti-α-tubulin-antistoff (Santa Cruz) for å bestemme lik lasting av prøver. Densitometry analyse ble utført ved hjelp Mengde-One (Biorad) og den relative bandet intensiteten ble plottet i et histogram ved hjelp PRISM 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Gruppe kloke sammenligninger ble gjort ved hjelp av variansanalyse med Tukey post-hoc korreksjon.
Resultater
Seaweed polyfenoler båtplass høye nivåer av antioksidanter
For å bestemme antioksidant potensialer av tang polyfenoler undersøkte vi den totale antioksidantkapasitet utklippede fraksjoner, inkludert heksan, dichloromethane-, etylacetat- og metan- fraksjoner av alle fem tang undersøkt. Gallussyre ble anvendt som den positive kontroll, og et polysakkarid fraksjon fra tilsvarende tang ble også undersøkt for å tilveiebringe en relativ forstørrelse av antioksidanter i polyfenoler. TCA viste signifikante nivåer av antioksidanter i alle tang polyfenol-fraksjoner (fig. 1). Doseavhengig økning i antioksidant nivåene av alle fraksjonene undersøkes nøyaktig validerer antioksidant tilgjengelighet og konsentrasjon. Relativt, vi observert svært høye nivåer av antioksidanter i diklormetan og etylacetat-fraksjoner av alle undersøkte tang (fig. 1). Inimitably, polyfenoler hentet fra
Stoechospermum marginatum
viste (Fig. 1) til havn maksimale antioksidanter, ~3.5 ganger høyere i DCM og EA fraksjoner. På grunn av det faktum at de DCM og EA fraksjoner inneholder høye antioksidanter tvers av brunalger undersøkt, vi selektivt benyttet i disse to fraksjoner fra hver tang for å avgrense den anti-PC-potensial.
polyfenoler ble ekstrahert fra fem arter av brunalger,
Dictyota dichotoma plakater (DD),
Hormophysa triquerta plakater (HT),
Spatoglossum asperum plakater (SA),
Stoechospermum marginatum product: ( SM) og
Padina tetrastromatica
(PT) ved anvendelse av gradient polaritet oppløsningsmidler inkludert heksan (H), diklormetan (DCM), etylacetat (EA) og metanol (M). Total antioksidantkapasitet analyse ble utført med gallisk syre (GA) som positiv kontroll, vanlig løsemidler som negative kontroller og polysakkarid brøkdel fra tilsvarende tang som relativt mål.
Antioksidant-rik polyphenol fraksjoner forsinker PC celleviabilitet
Mia-Paca-2, Panc 3,27, Panc en og BxPC3 celler behandlet med diklormetan (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) eller etylacetat (DD-EA , SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fraksjoner (10, 20, 50 eller 100 ug /ml) ble kontrollert for endringer i cellelevedyktighet ved hjelp av Trypan blå eksklusjon assay. Alle DCM og EA polyfenol-fraksjoner viste en signifikant (P 0,001) inhibering av cellelevedyktighet så lav som 10 pg /ml konsentrasjon (figur 2A.). Med økende konsentrasjoner av polyfenol-fraksjoner, ble det observert en doseavhengig hemming av cellelevedyktighet i MiaPaCa-2-celler eksponert for DCM eller EA-fraksjoner (fig. 2A). Konsekvent, 100 ug /ml av alle DCM og EA fraksjonen (e) vesentlig innadvendt cellenes levedyktighet ( 60%) i BxPC3 celler (figur 2B.). Imidlertid HT-EA viste forholdsvis mindre hemmende potensiale i denne cellelinje. Like-klok, observerte vi en konsistent hemmende effektivitet (~ 50%) av alle DCM fraksjoner i Panc 3,27 celler (Fig. 2C). På den annen side, EA fraksjoner viste en skråning i effekt ved lav aktivitet med DD-EA til en maksimal-aktivitet med HT-EA i Panc 3,27-celler (Fig. 2C). I Panc 1 celler, både DCM og EA fraksjoner markert hemmet cellenes levedyktighet (fig. 2D). Relativt, observerte vi en maksimal hemning av cellelevedyktighet med SM-DCM og DD-EA (mer enn 50%) fraksjoner. Disse resultatene viser at tang polyfenoler potensielt hemme PC celleviabilitet og videre identifisere «
celle-type
uavhengige» minimal effektiv (50%) hemmende dose i denne innstillingen.
dose forbundet regulering av celle levedyktighet for hver polyphenol fraksjonene ble sammenlignet med ubehandlede kontroller ved hjelp av to-veis ANOVA med Bonferonii post-hoc test og en P-verdi på 0,05 regnes som statistisk signifikant. Linjeplott som viser signifikant inhibering av cellelevedyktighet i (B) BxPC-3, (C) Panc-3,27 og (D) Panc-1-celler behandlet med 100 ug /ml DCM eller EA-fraksjoner.
Seaweed polyfenoler hemmer PC celleproliferasjon
Videre å underbygge celle-levedyktighet hemmende potensialet av antioksidant rike polyfenoler faktisk oversettes til påfølgende regulering av celleoverlevelse, vi undersøkte anti-proliferativ potensialet i DCM og EA fraksjoner. For å oppnå dette, målte vi den totale DNA-innhold (som er nær proporsjonalt med cellenummer), og graden av spredning ble bestemt ved å sammenlikne celleantall av behandlede stoff MiaPaCa-2 og Panc-1 celler med ubehandlede kontroller. Sammenlignet med de ubehandlede kontroller, CyQuant-NF-analyse viste en signifikant dose (10, 20, 50 og 100 ug /ml) avhengig hemming av celleproliferasjon både i MiaPaCa-2 og PANC-1-celler med hver diklormetan (DD-DCM SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) eller etylacetat (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fraksjoner (Fig.3). Imidlertid er disse anti-oksiderende rike fraksjoner utviste en «celle-type avhengig» og /eller «løsningsmiddel-avhengig «omfanget av inhibering celleproliferasjon. Øyensynlig, alle fem DCM-fraksjoner (100 ug /ml) dypt (~ 50%) hemmet MiaPaCa-2-celleproliferasjon med maksimum (ca 75%) inhibering observert etter HT-DCM behandling (Fig. 3A). Like-klok, i Panc-1 celler, DD-DCM, PT-DCM og HT-DCM behandling robust (-50%) hemmet celleproliferasjon med maksimal hemming i PT-DCM behandlede celler (fig. 3B). Enda viktigere, EA fraksjonene oppviste også DCM sammenlignbare (~ 50%) celleproliferasjon hemmende potensiale i MiaPaCa-2-celler (Fig. 3C). Øyensynlig, viste PT-EA behandling maksimal inhibering i disse cellene. Skjønt, DD-EA, PT-EA og HT-EA viste hemmende potensiale i Panc-1 celler, relativt (i motsetning til DCM), EA fraksjoner produsert marginal effekt (Fig. 3D). For det andre, undersøkte vi om tang polyphenol hemmet celle-overlevelse er forbigående (med tidsavhengig recovery) eller en permanent årsak virkning. MiaPaCa-2-celler behandlet med 100 ug /ml DCM og EA fraksjoner ble underkastet cyquant analyse etter 3, 24, 48 og 72 timer. Sammenlignet med ubehandlede kontroller, tang polyfenoler utøver en signifikant (P 0,001) anti-proliferasjon så lavt som 3 h (figur 3E.). Enda viktigere, dette DCM og EA fraksjoner indusert hemming av celleproliferasjon vært konsekvent etter (3E Fig.) 24, 48 og 72 timer. Disse resultatene viser at anti-proliferativ potensialet av tang polyfenoler i PC-celler og videre short-list potensielle fraksjoner i denne innstillingen.
celler eksponert for tang polyfenoler ble vurdert for celledeling tre timer etter behandling. Dosen ved inhibering av celleproliferasjon for hver polyfenol fraksjoner ble sammenlignet med ubehandlede kontroller ved bruk av to-veis ANOVA med Bonferonii post hoc-test og en P-verdi av 0,05 er ansett som statistisk signifikant. (E) Linje plott av DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA og HT-EA utsatt MiaPaCa-2 celler viser betydelig og vedvarende (3, 24, 48 og 72 h) hemming av celleproliferasjon. (F) Linje plott av DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA og HT-EA utsatt normal menneskelig MCF10A, HASMC og HIAE celler som viser konsekvent celle overlevelse 24 timer etter behandling. Sammenlignet med ubehandlede kontroller, alle DCM og EA fraksjoner viste ingen signifikant hemming av celleproliferasjon alle tre cellelinjer undersøkt. Time-linje i line-plott viser fluorescens (480 nm eksitasjon og 520 nm utslipps) målinger kontinuerlig opp til 60 minutter.
Videre å bestemme svulst selektiv potensialet for tang polyfenoler og å avgrense normal celle cytotoksisitet, om noen, undersøkte vi effekten av disse fraksjoner på friske celleoverlevelse. For dette MCF10A, HIAE og HASMC-celler behandlet med 100 ug /ml DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA eller HT-EA ble undersøkt etter 24 timer for endringer i celleproliferasjon. Fluorescens (480 nm eksitasjon og 520 nm emisjon) ble målt kontinuerlig for opp til 60 minutter. Sammenlignet med ubehandlede kontroller, fikk CyQuant NF-analyse avslørte ingen signifikant inhibering av celleoverlevelse i MCF10A celler. Like-klok, observerte vi en konsekvent celle overlevelse både i HASMC og HIAE celler behandlet med DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA eller HT-EA antyder ingen bestemt cytotoksisitet av disse fraksjonene i normale celler.
Seaweed polyfenoler utøver apoptotisk celledød i PC-celler
for å avgrense om anti-PC potensialet for tang polyfenoler involvere apoptotisk celledød og for å identifisere potensielle størrelsen av forskjellige fraksjoner, karakterisert, undersøkte vi de tilhørende endringer i DNA-fragmentering. Siden vurderingen av apoptose ikke kan stole på en enkelt endepunkt, benyttet vi både kvalitative acridinoransje /etidiumbromidfarging og semi-kvantitative agarosegel DNA fragmentering i Panc-1, Panc 3,27, BxPC3 og MiaPaCa-2 celler. Sammenlignet med ubehandlede kontroller, avslørte fluorescens mikros at alle antioksidant rike polyphenol fraksjoner inkludert DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT -EA og HT-EA oppviser apoptotiske egenskaper (fig. 4). Øyensynlig, observerte vi differensial DNA-fragmentering størrelsene på tvers av fire PC-cellelinjer behandlet med disse polyfenoler. Gående, sammenlignet med de ubehandlede kontroller, agaorse gel-DNA-fragmentering analyser viste statistisk signifikant (P 0,05) induksjon av DNA-fragmentering i Panc 1, Panc 3,27, BxPC-3 og MiaPaCa-2-celler ble behandlet med tang polyfenoler, med unntak av DD- DCM (fig. 5). Relativt, observerte vi en maksimal ( 2 ganger) DNA-ødeleggende effekten av alle tang polyfenoler i Panc-1 og Panc-3,27 celler. Omfang av DNA-fragmentering påført av disse polyfenoler viser at tang ansette apoptotisk celle-drapet i PC
Sett. Høy forstørrelse photomicrographs viser kromatin med blebbing, kjernekraft kondens, og fragmentering indikerer typiske apoptotiske egenskaper i celler behandlet med tang polyfenoler.
DNA-prøver ble elektroforese i 2% agarose gel som inneholder etidiumbromid og kvantifisert ved hjelp Mengde-One.
Seaweed polyfenoler hemmer funksjonell aktivering av NFkB
Videre å undersøke at tang polyfenoler indusert apoptotisk celledød involverer hemming av pro-overlevelse NFkB, vi undersøkte regulering av NFkB arrangøren aktivering med disse DCM og EA fraksjoner i PC-celler. Til dette ble det humane Panc-1, BxPC-3 og MiaPaCa-2-celler transient transfektert med en pNFκB-Luc-plasmid-konstruksjon som gir uttrykk for luciferase reporter-genet i en NFkB-avhengig måte. Binding av NFkB til promotoren aktiverer transkripsjon, slik at Luc reportergenet som skal uttrykkes. Transfekterte celler ble eksponert for DCM og EA fraksjonene (hver for seg), og luciferase reporter-analysen ble utført etter 24 timer. Celler behandlet med tang polyfenol DCM og EA fraksjoner førte til dyp hemning i luciferase-aktivitet, noe som indikerer at disse fraksjonene kunne spesifikt lindre transkripsjonen aktivering av NFkB (fig. 6). Selv om vi fant marginale forskjeller mellom fraksjoner og på tvers av cellelinjer, generelt at opplysningene tydelig portretter en bemerkelsesverdig reduksjon av luciferase aktivitet mye mindre enn de basale nivåer demonstrere sitt potensial i å dempe NFkB transkripsjon.
Cellene ble deretter høstet på 24 timer etter behandling. Dataene som vises representerer gjennomsnitt og standardavvik (SD) av tre uavhengige eksperimenter. Betydelig nedgang i luciferase aktivitet i tang polyfenoler behandlet PC celler.
Seaweed polyfenoler regulere tumorprogresjon molekyler i PC-celler
Også å dissekere ut til fordel for antioksidant rik tang polyfenoler
