Abstract
Up-regulering av apoptose regulerende genet
Mcl-en product: (myeloid celle leukemi-1) forekommer i forskjellige krefttyper, og er forbundet med legemiddelresistens i cancerterapi. Det er velkjent at Mcl-en pre-mRNA undergår alternativ spleising arrangementer for å produsere to funksjonelt distinkte proteiner, Mcl-1
S (pro-apoptotiske) og Mcl-l
L (anti-apoptotiske); sistnevnte isoformen er dominerende i ulike kreftformer, inkludert bryst- og eggstokk-kreft celler. I den foreliggende undersøkelse rapporterer vi at RNA-bindende protein (RBP) og proto-onkogen SRSF1 (serin og arginin-rikt skjøting faktor 1) påvirker skjøting av Mcl-1 i både MCF-7 og MDA-MB-231 brystkreftceller og JAR choriocarcinom celler; Vi viser også for første gang at en annen RBP SRSF5 påvirker skjøting av Mcl-en i MCF-7 celler. Videre rapporterer vi at SRSF1 er involvert i andre aspekter av Mcl-en regulering med knockdown av SRSF1, ved RNAi, noe som resulterer i en signifikant reduksjon i Mcl-1 proteinnivåer i MCF-7-celler, men en økning i JAR-celler, henholdsvis, etter potensielt påvirker protein stabilitet og oversettelse av Mcl-l. De viktigste resultatene fra denne studien fremheve viktigheten av den cellulære sammenheng med ulike kreftceller for funksjonen av multifunksjonelle RBPs som SRSF1 og har implikasjoner for terapeutiske tilnærminger som benyttes for å målrette Mcl-en
Citation. Gautrey HL, Tyson -Capper AJ (2012) Regulering av Mcl-en ved SRSF1 og SRSF5 i kreftceller. PLoS ONE 7 (12): e51497. doi: 10,1371 /journal.pone.0051497
Redaktør: Justin L. Mott, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 04.07.2012; Godkjent: 01.11.2012; Publisert: 17.12.2012
Copyright: © 2012 Gautrey, Tyson-Capper. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend tildelt fra JGW Patterson Foundation og tilleggsfinansiering fra Newcastle Health Charity (RVI /NGH) og Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Charity (FH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Apoptose, eller programmert celledød er en viktig prosess som er involvert i normal utvikling og homeostase vev, og dens deregulering kan føre til kreft. Et betydelig antall av apoptose faktorer har blitt vist å være regulert ved alternativ spleising; dette inkluderer Bcl-2-protein familien som styrer den iboende (mitokondrielle) celledød svei [1], [2], Figur 1A. Bcl-2-familien inneholder både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner, og det er balanse mellom de to som bestemmer om veien er aktivert [3], [4]. Den BCL-2 familien kan deles inn i tre grupper basert på deres struktur og funksjon. Den anti-apoptotiske Bcl-2-protein inneholder multiple Bcl-2-homologi (BH) domener og så er strukturelt lik bcl-2, som også er et medlem av denne gruppe. Den pro-apoptotiske Bcl-2 proteiner er delt inn i to undergrupper, den første gruppen er også strukturelt ligner BCL-2 med flere BH-domener, og inkluderer proteiner Bak og Bax. Den andre gruppen av pro-apoptotiske proteiner inneholder bare den BH3 domene. Apoptose utløses når pro-apoptotiske proteiner Bak og Bax forårsake mitokondriell ytre membran permeabilisation. Den anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer forhindre dette ved å binde seg til de pro-apoptotiske proteiner Bax og Bak. BH3-bare proteiner kan aktivere apoptose gjennom to ruter for det første ved direkte aktivering av Bak og Bax, og for det andre ved å binde til anti-apoptotiske proteiner, slik at frigjøring av Bak og Bax.
Mcl-1 er et medlem av Bcl-2-familien av apoptose-regulatorer. Overekspresjon av Mcl-1 har blitt funnet i et bredt spekter av kreftvev [5], [6], [7], så vel som kreft-cellelinjer [8]. I tillegg økte ekspresjon av Mcl-1 har blitt assosiert med dårlig prognose i brystkreft [9]. MCL-en ser også ut til å være en viktig faktor involvert i motstanden mot kreft terapier, og dens nedregulering har vist seg effektiv på å indusere apoptose [7], [10], [11], [12].
Mcl-en
genet inneholder tre eksoner og koder to proteiner, anti-apoptotiske Mcl-en
L og den pro-apoptotiske Mcl-en
S [13], [14]. Den fulle lengde transkript inneholdende alle de tre eksoner koder Mcl-1
L, som inneholder BH1, 2 og 3 samt en TM-området. Dette resulterer i en anti-apoptotiske Bcl-2-protein som blir produsert. Mcl-1
S har det andre exon spleiset ut hvilket resulterer i en nedstrøms forskyvning av leserammen slik at bare de resterende BH3 domenet (figur 1B). Mcl-1
S synes å utøve sin pro-apoptotiske virkning på en lignende måte til andre BH3-bare proteiner ved å binde til anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner, og mer spesifikt MCL-1
S kun bindes til Mcl -1
L [13], [15].
en bryter i den alternative spleising av Mcl-en har så langt vist seg å forekomme i bryst- og eggstokk-kreft, med det foreligger en økning i anti-apoptotisk Mcl-en
L isoform i kreftvev [16]. Til tross for dette, er svært lite kjent om den mekanismen som regulerer bryteren i skjøting eller spleising faktor proteiner involvert i inkludering eller ekskludering av andre exon. Så langt har bare to medlemmer av SR-protein familien, SRSF1 og 3, har blitt identifisert som å påvirke alternativ spleising av Mcl-1 [17]. Som har relevans til denne undersøkelsen en rekke forskjellige spleise faktorer har blitt vist å ha endret ekspresjon i kreftvev [18]; disse inkluderer SRSF1 [19] og SRSF3 [20], som er oppregulert i en rekke kreftformer, og er blitt identifisert som proto-onkogener, og SRSF5 som blir overuttrykt i brystkreft [21].
Formålet med dette arbeidet var å undersøke hvordan Mcl-1 er regulert i kreftceller og identifisere celle spesifikke RNA bindende proteiner (RBPs) som er involvert i å fremme inkludering av andre exon av
Mcl-en
genet. Dette ble oppnådd ved å bruke gen-spesifikk knockdown av en rekke forskjellige RBPs etterfulgt av måling av nivåene av spleise-spesifikke isoformer.
Materialer og metoder
Cell Culture
To forskjellige kreftcellelinjer ble opprinnelig utvalgt for denne undersøkelsen (figur 2), brystkreft adenokarsinom MCF-7-celler (beskrevet som å ha en lav invasjon fenotype
in-vitro
) og choriocarcinoma JAR-celler; en annen brystkreftceller MDA-MB-231-celler (beskrevet som å ha en invasiv fenotype
in-vitro
) ble tilsatt til studien for sammenligning (ATCC, LCG). MCF-7 og MDA-MB-231-celler ble holdt i DMEM (Sigma-Aldrich) inneholdende 10% føtalt kalveserum, L-glutamin og penicillin streptomycin. JAR-celler ble holdt i RPMI-1640 (ATCC, LCG) inneholdende 10% føtalt kalveserum og penicillin streptomycin. Celler ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2. Celler ble behandlet med 20 nM av rapamycin, 35 ug /ml cykloheksimid eller 1 pg /ml proteaseinhibitor (Sigma-Aldrich) er angitt.
(A) indre (mitokondrielle) celledød veien er kontrollert av BCL-2 proteiner familie, inkludert BH3-bare proteiner, anti-apoptotiske Bcl-2 proteiner, Bax, Bak og Bud. (B)
Mcl-en
genet består av tre eksoner; anti-apoptotiske Mcl-en
L og den pro-apoptotiske Mcl-en
S protein isoformene skyldes inkludering og hoppe av ekson 2 (åpen boks), henholdsvis.
Top panelet viser MCL spleise isoformer i kommersielt tilgjengelig JAR cellelysat, MCF-7 celler og JAR celler. Påvisning av western blotting av Mcl-en spleisevarianter, SRSF1-6 og lasting kontroll GAPDH i 40 ug totalt cellelysat fra MCF-7 og JAR celler.
Gene knockdown av RNAi
Alle celler ble omvendt transfektert med Silencer® Velg siRNA (Ambion, tabell 1),
Silencer
® negativ kontroll siRNA (Ambion),
Silencer
® Velg GAPDH positiv kontroll siRNA (Ambion ) og SIPORT ™
NeoFX
™ Transfeksjon Agent (Ambion) med følgende protokoll optimalisert i henhold til produsentens instruksjoner. 5,9 x 10
4 MCF-7-celler og 4 x 10
4 JAR-celler ble sådd ut i hver brønn av en 24 brønns plate. JAR-celler ble transfektert med 4 ul /ml og MCF-7 og MDA-MB-231 celler med to ul /ml SIPORT ™
NeoFX
™ transfeksjon agent; Alle celler ble transfektert med 6 nM siRNA. Celler og siRNA ble inkubert sammen ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2. RNA ble samlet 48 og 72 timer etter transfeksjon og protein samlet 72 timer etter transfeksjon. I alle forsøkene nivåer av knockdown av RNAi ble vurdert på RNA og proteinnivå ved PCR og immunoblotting, som beskrevet.
Western immunoblotting
Celler ble vasket i iskald PBS og deretter oppsamlet i RIPA-buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% natriumdeoksykolat, og 0,1% SDS) for protein kvantifisering etterfulgt av tilsetning av prøvebuffer, og deretter varme denaturert ved 95 ° C i 5 minutter. Protein lysater ble separert ved anvendelse av 12% SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) geler og overført elektroforetisk til en nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert i 1 time med PBS inneholdende 10% tørrmelk-pulver, og probet med enten mus anti-Mcl-1 (1:500, Santa Cruz), kanin-anti-GAPDH (1:1000, Santa Cruz), mus anti SF2 /ASF (1:1000, SRSF1, Zymed), kanin anti-SC35 (1:100, SRSF2, Abgent), mus anti-SRp20 (1:1000, SRSF3, Zymed), kanin anti-SRp75 (1:500, SRSF4, Abcam), geit anti-SRp40 (1:500, SRSF5, Zymed), kanin anti-SRp55 (1:2000, SRSF6, Aviva Systems Biology) over natten ved 4 ° C. Etter vasking i PBS de aktuelle HRP-konjugerte sekundære antistoffer fortynnet i PBS ble tilsatt. ECL eller Super Signal Femto ECL (Pierce) ble anvendt for proteindeteksjon. Hvor indikert ble densitometrisk analyse utført ved hjelp av en UVP gel dokumentasjonssystem og kvantifisering utført ved hjelp av ImageJ programvare. Data ble deretter analysert ved anvendelse av en enveis ANOVA med Tukeys «multiple sammenligningstest.
RNA Isolation og Semi-kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert med RNeasy spinnkolonner (Qiagen) og behandlet med DNase (Qiagen) følgende produsentens instruksjoner. En mikrogram total RNA ble reverstranskribert ved anvendelse av oligo (DT) primere og Hevet II revers transkriptase (RT) (Invitrogen, Life Technologies). PCR ble utført med cDNA, spesifikke primere (tabell 2) og PCR masterblanding (Promega). Primere for Mcl-1 ble konstruert for å være en av sidene av exon 2, slik at de kan detektere både Mcl-1
S og Mcl-1
L, og skille de to isoformer av størrelse. (Figur 3A). Negative kontroller, som manglet RT under fremstillingen av cDNA ble inkludert for å overvåke genomisk forurensning. CDNA-produktene ble separert ved elektroforese på 1,5% (w /v) agarose geler, visualisert under UV følgende etidiumbromidfarging.
MCF-7-celler ble transfektert med SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G ) og negativ kontroll (NC) sirnas, eller behandlet med bærer (lipid) bare (V), eller forble ubehandlet (UT). (A) Semi-kvantitativ RT-PCR viser begge Mcl-1 spleisede varianter. (B) Semi-kvantitativ RT-PCR viser knockdown av RNA bindende proteiner 48 timer etter transfeksjon med siRNAs. (C) Semi-kvantitativ RT-PCR som viser nivåene av Mcl-1 spleise isoformer (Mcl-1
L og Mcl-1
S) og lastkontrollen GAPDH 72 timer etter transfeksjon med sirnas. (D) Mcl-1
L-nivåene målt ved sanntids-PCR på samme prøve vist i (B). (E) Mcl-1
S nivåer målt ved sanntids-PCR på samme prøve vist i (B). (F Mcl-en
S nivåer i prøven replikerer målt ved real-time PCR (mean (n = 3) ± SEM) ** P≤0.01;.. * P≤0.01
real-Time PCR
real-time PCR ble utført på cDNA ved hjelp inventoried TaqMan® analyser (Applied Biosystems) og TaqMan® Universal Master Mix II (Applied Biosystems). TAQMAN analysene ble valgt som var spesifikke for hver av spleise varianter av Mcl-en som prober ble utformet for å spenne ekson grenser som er spesifikke for hver spleisevariant (Mcl-en
S – ekson grensen 1-3, Mcl-en
L – ekson grensen 1- 2), og Taqman GAPDH-analysen ble valgt som en endogen kontroll. assayet ble utført i kvadruplett, og PCR-amplifisering ble utført ved anvendelse av OneStepPlus real-time PCR-system (Applied Biosystems). Alle forsøk ble utført in triplo med et minimum av tre uavhengige forsøk.
miRNA Isolering og real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol®, utfelt med 100% etanol og deretter renset på RNeasy spin kolonner (Qiagen) kun ved hjelp av buffer RPE. Totalt RNA ble eluert fra kolonnene med RNase-fritt vann. Revers transkripsjon reaksjonen ble utført på 10 ng av total RNA, ved hjelp TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), og sekvensen spesifikke RT-primere fra TaqMan® små RNA Analyser (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Separate reverse transkripsjonsreaksjoner ble utført for hver TaqMan® små RNA-analysen på hver RNA-prøve. Real-time PCR ble utført på cDNA ved hjelp inventoried TaqMan® små RNA analyser og TaqMan® Universal Master Mix II (Applied Biosystems). Analysen ble utført in triplo, og PCR-amplifisering ble utført ved anvendelse av OneStepPlus real-time PCR-system (Applied Biosystems).
Apoptose-analysen
MCF-7-celler ble transfektert med omvendt siRNA inn i 96 brønners plater, og deretter inkubert i 48 timer. MCF-7 celler ble deretter behandlet med en topoisomerase-inhibitor, etoposid, som tidligere beskrevet [22]. I korte trekk ble celler inkubert med serum sult medium (1% FCS) i 18 timer, etterfulgt av behandling med 200 pM Etoposid (Sigma Aldrich) i 6 timer [22]. Caspase nivåer ble deretter målt ved hjelp av caspase-Glo 3/7 analyse (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet like volumer av Caspase-Glo 3/7 reagens ble tilsatt til brønnene og inkubert ved romtemperatur i 1 time og deretter luminescens ble målt med et luminometer (BMG).
Resultatene
Mcl -1 skjøte~~POS=TRUNC Isoformer og SR-proteiner i cellelinjer
RBPs som er involvert i kontrollen av alternativ spleising arrangementet i Mcl-1 ble undersøkt i både JAR og MCF-7 celler. Begrunnelsen for å bruke disse to cellelinjene var basert på premisset om at de har forskjellige uttrykksprofiler for Mcl-en
L og Mcl-en
S. JAR cellene produserer både Mcl-en
L og Mcl-en
S, mens MCF-7 celler bare produsere høye nivåer av Mcl-en
L (figur 2, topp panel). Cellelysater fra de samme cellelinjer (figur 2) ble også vurdert for ekspresjon av et utvalg av RBPs (SR proteiner, SRSF1-6), kjent for å være involvert i spleisesetet utvalg og forutsagt å ha putative RNA-bindende områder innen exon 2 av
Mcl-en
genet (https://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder). Sammenligning av ekspresjonsnivåene av disse SR proteiner i MCF-7 og JAR-cellelinjer viste bare en liten økning i SRSF2, 3 og 6 i MCF-7-celler. Selv om det var tilsvarende nivåer av uttrykk, kan disse SR proteiner fortsatt være involvert i alternativ spleising av Mcl-en, som aktiviteten til SR proteiner er styrt av sine samlede kjernefysiske konsentrasjon og aktivisering stater i tillegg til sine samlede protein nivåer.
mRNA nivåer av MCL-1 Splice isoformer etter knockdown av RNA bindende proteiner
for å identifisere de RBPs involvert i inkludering av andre exon av Mcl-en, siRNA ble brukt til å knockdown kandidat proteiner i MCF -7 celler. Den RBPs SRSF1, 2, 5, 6 og SR regulatorisk protein SREK1 (SFRS12) hadde to forskjellige siRNA som målrettet deres rekkefølge mens SRSF3, 4 og Tra2β hadde en siRNA. En viktig faktor var å først verifisere at knockdown av enkelt SRSFs av RNAi ikke påvirker uttrykket av andre familiemedlemmer (Figur S1). Figur 3B viser knockdown av RBPs i MCF7-celler 48 timer etter transfeksjon, og viser at nivåer av mRNA for hver RBP ble redusert med minst en siRNA. En innledende skjermen på effekten av siRNA-mediert knockdown av både semi-kvantitativ PCR (figur 3C) og real-time PCR (figur 3D og 3E) viste at 72 timer etter transfeksjon nivåer av Mcl-en
S øker når cellene ble tappet for SRSF1 (1 og 2) og SRSF5 (1); en svak økning i Mcl-1
S ble også observert når Tra2β nivåene ble redusert med siRNA. Selv om andre siRNA at målrettet SRSF5 (2) ikke produsere en tilsvarende økning i Mcl-en
S, knockdown av SRSF5 var ikke så effektiv som med SRSF5 (1) siRNA. Nivåer av Mcl-1
L RNA ble også målt (figur 3C og 3D), men som uttrykket nivåer av Mcl-1
L mRNA var så høy at små endringer som produseres ved hjelp av bryteren i spleise ble ikke observert hos den totale mRNA uttrykk. Etter det første skjermbildet av siRNAs de knockdowns ble gjentatt med SRSF1 (1 og 2) og SRSF5 (1) sirnas (n = 3), og viser figur 2F betydelig oppregulering av Mcl-en
S mRNA 72 timer etter transfeksjon av disse siRNAs inn i MCF-7 cellelinje.
for å vurdere hvilke RBPs er involvert i dette alternativ spleising hendelse i JAR-celler, ble den samme panel av siRNAs brukes til knockdown de RBPs i disse cellene. Figur 4A viser knockdown oppnådd med disse sirnas i JAR cellene 48 timer etter transfeksjon. Bryteren i skjøting ble vurdert ved måling av mRNA-nivåer av Mcl-1 ved semi-kvantitativ PCR (figur 4B) og real-time PCR (figur 4C og 4D) etter 72 timer. Resultatene viser en stor økning i nivået av Mcl-en
S etter SRSF1 hadde blitt slått ned av enten SRSF1 (1) eller SRSF1 (2). MCL-en
L nivåer ble også målt i skjermen, men som de MCF-7 celler ingen endring ble observert på grunn av høye nivåer av MCL-en
L mRNA til stede. For å validere resultatene av det første skjermbildet de knockdowns med SRSF1 (1 og 2) ble gjentatt (n = 3) og viste en signifikant økning i nivåene av Mcl-en
S mRNA etter knockdown av SRSF1 (figur 4E).
JAR celler ble transfektert med SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G) og negativ kontroll (NC) sirnas, eller behandlet med kjøretøy (lipid) bare (V), eller ble ubehandlet (UT) . (A) Semi-kvantitativ RT-PCR som viser knockdown av RNA-bindende proteiner 48 timer etter transfeksjon med sirnas. (B) Semi-kvantitative RT-PCR som viser nivåene av Mcl-1 spleise isoformer (Mcl-1
L og Mcl-1
S) og lastkontrollen GAPDH 72 timer etter transfeksjon med sirnas. (C) Mcl-1
L-nivåene målt ved sanntids-PCR på samme prøve vist i (B). (D) Mcl-1
S nivåer målt ved sanntids-PCR på samme prøve vist i (B). (E) Mcl-en
S nivåer i prøven replikerer målt ved real-time PCR (gjennomsnitt (n = 3) ± SEM). * P≤0.01.
Protein nivåer av MCL-1 Splice isoformer etter knockdown av RNA bindende proteiner
For å fastslå om bryteren i spleising observert i mRNA ble oversatt til proteiner, immunoblotting ble brukt til å definere uttrykket mønster av Mcl-en
L og Mcl-en
S i MCF-7 og JAR celler. Det er verd å merke seg at nivåene av Mcl-en
S og Mcl-en
L-proteiner kan ikke visualiseres, for kvantifisering formål, på samme eksponeringstid (figur S4) på grunn av lave nivåer av endogen Mcl- 1
S. Knockdown av SRSF1 og SRSF5 i MCF-7-celler er vist i figur 5A, sammen med den resulterende produksjon av små mengder av Mcl-1
S, replikerende observasjoner som ble gjort av Mcl-1
S mRNA-nivåer (figur 3B og 3D). Protein nivåer av Mcl-en
L er også vist etter knockdown. Nivåene av Mcl-1
L etter behandling med SRSF5 siRNA ikke endrer seg vesentlig fra kontrollene, noe som er konsistent med mRNA-nivåene av Mcl-1
L etter SRSF5 knockdown (figur 3B og 3C). Interessant, nivåene av Mcl-en
L ble betydelig redusert etter SRSF1 ble slått ned i forhold til kontrollene i MCF-7 celler. Denne reduksjonen observert i proteinnivåer ble ikke observert i Mcl-1
L mRNA (figur 3B og 3C), og derfor reduksjonen i SRSF1 kan påvirke den oversettelse eller stabiliteten av Mcl-1, så vel som alternativ spleising hendelsen. Innledende data fra immunoutfellingsstudier eksperimenter tyder på SRSF1 kan binde til Mcl-1 mRNA i MCF-7-celler (figur S3 og Metoder S1); Denne observasjonen er i overensstemmelse med foregående bevis for at SRSF1 protein: Mcl-1 RNA komplekser eksistere [17]
(A) MCF-7-celler ble transfektert med SRSF1 (1 og 2), SRSF5 (1 og 2. ), GAPDH (G) og negativ kontroll (NC) sirnas, eller behandlet med bærer (lipid) bare (V), eller var ubehandlet (UT). SRSF1, 5, ble Mcl-1 og GAPDH proteinnivåer bestemt ved immunoblotting 72 timer etter transfeksjon med sirnas, ved hjelp av 30μg av totalt cellelysat. Histogrammene viser densitometrisk analyse av Mcl-en
L og Mcl-en
S protein uttrykk. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. ** Indikerer P≤0.01; * Viser P 0,05. (B) JAR-celler ble transfektert med SRSF1 (1 og 2), GAPDH (G) og negativ kontroll (NC) sirnas, eller behandlet med bærer (lipid) bare (V), eller var ubehandlet (UT). SRSF1, Mcl-1 og GAPDH-proteinnivåer ble bestemt ved immunoblotting 72 timer etter transfeksjon med sirnas, ved anvendelse av 30 ug av totalt cellelysat. (C) Etter transfeksjon med SRSF1 (1) og NC siRNA MCF-7-celler ble behandlet med 200 uM etoposid eller DMSO kontroll i 6 timer. Induksjon av apoptose ble vurdert ved å måle caspase3 /7 aktivitet * viser P .. 0.05
Figur 5B viser effekten på proteinnivå Mcl-en etter behandling med SRSF1 siRNA i JAR celler. I samsvar med mRNA-resultatene, reduksjoner i SRSF1 nivåer resulterte i en økning i proteinnivået av Mcl-1
S. I motsetning til dette, Mcl-1
L proteinnivåene øker etter behandling med SRSF1 siRNA, mens de tilsvarende mRNA-resultatene viste ingen forandring i nivåer etter knockdown (figur 4B og 4C). Følgelig, til forskjell fra MCF-7 cellelinje, Mcl-1
L proteinnivåene øker som respons på SRSF1 siRNA snarere enn å redusere denne økningen var ikke statistisk signifikant (figur 4B). Disse funnene tyder på at SRSF1 kan være involvert i andre aspekter av Mcl-en regulering som translasjonsforskning kontroll eller protein stabilitet i JAR celler. Protein nivåer av Mcl-en
L og Mcl-en
S ble også undersøkt etter knockdown med de andre RBPs brukes i RNA-skjermen i både MCF-7 og JAR celler, men ingen endringer ble observert (data ikke vist).
Vi neste undersøkt om knockdown av SRSF1, noe som resulterte i en dramatisk endring i Mcl-en
L og Mcl-en
S protein ratios i MCF-7 celler, kunne påvirker induksjon av apoptose. Vi først gjennomført en MTT analyse for å utelukke muligheten for at celledeling og celle levedyktighet kan påvirkes av knockdown av SRSF1 i MCF-7 celler (Figur S2 og metoder S2). Apoptose ble indusert i både den negative kontroll og SRSF1 (1) siRNA behandlede celler ved behandling med etoposid (200 pM), og målt ved å vurdere den resulterende caspase 3/7 aktivitet (figur 5C). Den prosentvise økningen i caspase 3/7 aktiviteten var noe høyere etter knockdown av SRSF1 demonstrerer en større induksjon av apoptose.
Effekt av SRSF1 knockdown på stabilitet og Oversettelse av Mcl-en
L
Mcl-en inneholder flere aminosyrerester i den N-terminale område som kan gjennomgå posttranslasjonell modifikasjon, slik som ubiquitinering og fosforylering [23]. Disse modifikasjonene kan påvirke stabiliteten av Mcl-1-proteinet. Derfor gikk vi videre for å vurdere stabiliteten av Mcl-1 protein etter knockdown av SRSF1 i de to cellelinjer. Cycloheximide behandling ble brukt til å blokkere proteintranslasjon og Mcl-1
L-proteinnivåer ble bestemt i løpet av de følgende 7 timer. Figur 6A viser en svært lik tapshastigheten for Mcl-1
L i MCF-7-celler etter behandling med SRSF1 siRNA sammenlignet med negativ kontroll siRNA. Dette tyder på at det ikke er noen forandring i stabilitet i Mcl-1
L etter knockdown av SRSF1 i MCF-7-celler. I motsetning til behandling av glasset celler med cycloheximide (figur 6B) resulterte i litt langsommere tap av Mcl-en
L etter knockdown av SRSF1, noe som indikerer at det kan være en liten økning i Mcl-en
L proteinstabilitet.
(A), MCF-7 og (B) JAR-celler ble transfektert med SRSF1 (1 og 2) og negativ kontroll (NC) siRNA. Tre dager etter transfeksjon ble cellene behandlet med 35 ug /ml cykloheksimid og proteinprøver ble samlet etter 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5 og 7 timer for å vurdere proteinstabilitet. MCL-en
L proteinnivåer ble deretter målt ved immunoblotting. (C) MCF-7-celler ble transfektert med SRSF1 (1 og 2), GAPDH (G) og negativ kontroll (NC) siRNA, eller behandlet med bærer (lipid) bare (V), eller var ubehandlet (UT). 48 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 20 nM rapamycin i ytterligere 24 timer. Western blotting ble deretter brukt til å vurdere proteinnivåer SRSF1, Mcl-1
L og GAPDH. (D) mir-29B nivåer målt ved real-time PCR i JAR og MCF-7 cellelinjer (gjennomsnitt (n = 3) ± SEM), ** P≤0.01. Knockdown av SRSF1 i MCF-7-celler (E) og JAR-celler (F) ble undersøkt ved semi-kvantitativ RT-PCR i SRSF1 (1) og negativ kontroll (NC) siRNA (øvre panel). Nivåer av mir-29b ble målt ved real-time PCR i SRSF1 (1) og negativ kontroll (NC) siRNA behandlet MCF-7 celler fra (E) og JAR celler fra (F) sammen med GAPDH (G) siRNA, kjøretøy ( lipid) bare (V), og ubehandlede (UT) celler (nedre paneler) (gjennomsnitt (n = 3) ± SEM).
Som nedgang i nivåene av Mcl-en
L i MCF-7 celler etter SRSF1 knockdown ser ikke ut til å påvirke stabiliteten av proteinet, kan det være en translatorisk kraft. SRSF1 har allerede blitt vist å være involvert i mTOR translasjonsinitiering, hvor dens tilstedeværelse på RNA resulterer i forbedret rekrutteringen av mTOR komplekset til mRNA [24], [25], [26], [27], [28]. I tillegg har Mcl-1 har også vist seg å være translatorisk styrt av mTOR og mTOR-signalveien [24], [25], [26], [27], [28]. For ytterligere å undersøke dette, ble MCF-7 celler behandlet med mTOR-hemmer rapamycin. Figur 6C bekrefter reduksjon i Mcl-en
L etter behandling med rapamycin og viser denne reduksjonen i Mcl-en
L å være lik den som er observert etter SRSF1 knockdown. Videre fikk tillegg av rapamycin til SRSF1 knockdown cellene ikke medføre noen ytterligere reduksjon i nivåene av Mcl-en
L.
En fersk rapport har også foreslått en annen mekanismen som SRSF1 kan styre oversettelse gjennom behandling av mirnas [29]. En av de mirnas identifisert som blir oppregulert etter overekspresjon av SRSF1 var mir-29b. Denne miRNA har allerede blitt vist å være involvert i den translatoriske inhibering av Mcl-1 [30]. I lys av dette en hypotese vi økningen observert i Mcl-en
L protein nivåer i glasset cellene kan delvis skyldes redusert nivå av mir-29b. Som knockdown av SRSF1 i MCF-7 celler viste ikke en tilsvarende økning i nivåene av Mcl-en
L protein, men faktisk en nedgang, ville vi ikke forvente mir-29b for å være involvert i reguleringen av Mcl -1
L i MCF-7 celler. Som et resultat av de opprinnelige nivåene av mir-29b kan forventes å være høyere i JAR-celler sammenlignet med MCF-7 celler. For å undersøke dette mir-29b ble målt i ubehandlet JAR og MCF-7 celler ved real-time PCR (figur 6D). Dette viste, mot formodning, at nivåene av mir-29b var signifikant høyere i MCF-7 celler i forhold til JAR celler. For å vurdere om knockdown av SRSF1 påvirket nivåene av mir-29b, som over-uttrykk har tidligere vist seg å gjøre dette [29], siRNA ble brukt til å knockdown SRSF1 i MCF-7 celler (Figur 6E) og JAR-celler (Figur 6F). Knockdown ble opprinnelig utført på MCF-7-celler, siden de viste de høyeste opprinnelige nivåene av mir-29b (figur 6D). Selv om behandling med transfeksjon reagens alene syntes å føre til en reduksjon i mir-29b i MCF-7 celler, knockdown av SRSF1 hadde liten effekt på nivåene av mir-29b i begge celletyper sammenlignet med negativ kontroll siRNA transfekterte celler ( Figur 6E og 6F).
Regulering av Mcl-en ved SRSF1 og 5 ble også undersøkt i en andre brystkreftcellelinje ved hjelp av MDA-MB-231 celler, som beskrives som å ha en invasiv fenotype
in vitro
. Endogene Mcl-1-proteinnivåer ble bestemt ved Western-blotting (figur 7A), noe som viser at MDA-MB-231-celler uttrykker hovedsakelig Mcl-1
L-protein isoform, men ved mye lavere nivåer enn MCF-7-celler. For å avgjøre om de samme RBPs er involvert i spleising av Mcl-1 i MDA-MB-231 celler siRNA mot SRSF1 og 5 ble brukt til å utarme celler av disse to proteiner. Figur 7B viser en reduksjon i RNA-nivåer av SRSF1 og 5 etter 48 timer, og en påfølgende økning i nivåene av Mcl-en
S mRNA etter 72 timer. Real time PCR-analyse av gjentatte transfections også viser en signifikant oppregulering av Mcl-en
S mRNA 72 timer etter transfeksjon med både SRSF1 og 5 sirnas. Protein nivåer ble også målt ved immunoblotting etter knockdown av SRSF1 og 5. Figur 7C viser slå ned av SRSF1 og 5 proteiner 72 timer etter transfeksjon. På grunn av de lave nivåer av Mcl-en
L og Mcl-en
S i MDA-MB-231 cellelinje Super Signal Femto ECL ble brukt til å oppdage de to isoformer, men denne klarte ikke å vise noen signifikant endring i de to isoformer etter knockdown av SRSF1 eller fem, selv om det var en liten nedgang i Mcl-1 protein etter knockdown av både SR proteiner (Figur 7C). Som mTOR vei synes å være viktige i reguleringen av Mcl-1 i MCF-7-celler denne ble også undersøkt i MDA-MB-231-celler. Rapamycin ble anvendt for å hemme mTOR-reaksjonsveien i denne cellelinjen, men den dramatiske reduksjon som ble observert i MCF-7-celler med rapamycin behandling og SRSF1 knockdown var ikke mindre tydelig med MDA-MB-231-celler.
(A) Påvisning av Mcl-1-spleisevarianter og GADPH proteiner i MCF-7 og MDA-MB-231 ved bruk av 40 ug av totalt cellelysat fra begge celletyper. Histogrammene viser densitometrisk analyse av Mcl-en
L og Mcl-en
S protein uttrykk. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. (B) Semi-kvantitativ RT-PCR viser knockdown av RNA bindende proteiner 48 timer etter transfeksjon med siRNAs. MDA-MB-231-celler ble transfektert med SRSF1, GAPDH (G) og negativ kontroll (NC) sirnas, eller behandlet med bærer (lipid) bare (V), eller forble ubehandlet (UT). Semi-kvantitativ RT-PCR som viser nivåene av Mcl-1 spleise isoformer (Mcl-1
L og Mcl-1
S) og lastkontrollen GAPDH 72 timer etter transfeksjon med sirnas. MCL-en
S nivåer i prøven replikerer målt ved real-time PCR (gjennomsnitt (n = 3) ± SEM).
