Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen, til tross for å være den mest forferdelige blant gastrointestinal kreft, er dårlig diagnostisert, og videre, har situasjonen blitt forverret på grunn av ervervet resistens mot ett kjent medikamentell behandling. Mens tidligere studier har fremhevet veksthemmende effekten av eldre generasjon fluorokinoloner, har som mål denne studien for å evaluere veksthemmende effekter av nyere generasjon fluoroquinolone, Gatifloxacin, på bukspyttkjertelkreft cellelinjer MIA PACA-2 og Panc-1 samt å belyse underliggende molekylære mekanismer. Heri, rapporterer vi at Gatifloxacin undertrykker spredning av MIA PACA-2 og Panc-1 celler ved å forårsake S og G
2-fase cellesyklus arrest uten induksjon av apoptose. Blokkade i S-fasen av cellesyklusen var assosiert med økt TGF-β1 ekspresjon og translokasjon av Smad3-4 kompleks til kjernen med påfølgende aktivering av p21 på MIA PACA-2-celler, mens TGF-β aliserte attenuerte Panc-1 celler viste S-fase arrest ved direkte aktivering av p27. Imidlertid Gatifloxacin mediert G
2-fase cellesyklus-stans ble funnet å være p53 avhengig i begge cellelinjene. Vår undersøkelse er av interesse fordi fluorokinolonene har evnen til å trenge inn i pankreasvevet som kan være svært effektive i å bekjempe kreft i bukspyttkjertelen som vanligvis er forbundet med tap eller nedregulering av CDK-inhibitorer p21 /p27 samt mutasjonsinaktivering av p53. I tillegg Gatifloxacin ble også funnet å virke synergistisk effekt av gemcitabin, den eneste kjente medikament mot kreft i bukspyttkjertelen, så vel som den bredspektret anticancer medikament cisplatin. Til sammen våre resultater tyder på at Gatifloxacin besitter kreft aktiviteter mot kreft i bukspyttkjertelen og er en lovende kandidat til å bli omplassert fra bredspektret antibiotika til antikreftmiddel
Citation. Yadav V, Sultana S, Yadav J, Saini N (2012 ) Gatifloxacin induserer S og G
2-Phase cellesyklus arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler via p21 /p27 /p53. PLoS ONE 7 (10): e47796. doi: 10,1371 /journal.pone.0047796
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 3 mai 2012; Godkjent: 17 september 2012; Publisert: 25 oktober 2012
Copyright: © 2012 Yadav et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd (NWP-13 og EXP0011) fra Rådet for industriell og teknisk forskning (CSIR), India. VY ble støttet med seniorstipend fra csir. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen, ondartet svulst i bukspyttkjertelen er i dag den femte vanligste årsaken til kreftdød [1]. Til tross for forbedringer i diagnose, forblir prognosen dårlig på grunn av forsinket symptom presentasjon, aggressiv tumorvekst og dyp desmoplastic reaksjons [2]; [3]. Den 5-års overlevelse er ca 15-20%, etter bukspyttkjertel reseksjon i tilfelle av kreft i bukspyttkjertelen [4]. Bortsett fra kirurgi, har adjuvant kjemoterapi med gemcitabin og erlotinib vist seg å forbedre prognosen i resektable bukspyttkjertelkreft [5]. I så fall er det en økning i overlevelse med konvensjonell cytotoksisk kjemoterapi i forhold til kirurgi [6], men likevel er det behov for å utvikle eller identifisere potensielle anticancer stoff med øket selektivitet og redusert toksisitet.
I de senere år eldre generasjon fluorokinolonene som moxifloxacin og Ciprofloxacin besitter bredspektret antibiotisk aktivitet, har vist veksthemmende virkninger ved å indusere apoptose og cellesyklusarrest i forskjellige kreftcellelinjer [7] – [10]. Disse nonantimicrobial aktivitetene har gjort dem unike blant annet bredspektret antibiotika. Gatifloxacin eller 8-metoksy fluoroquinolones er den nyere (fjerde) generasjon fluorquinolon som viser lignende antibiotiske virkninger ved å målrette bakteriell DNA gyrase og Topoisomerase [11] – [13], og er også en potent medikament i flere høyt infeksjonssykdommer slik som den seksuelt overførbare sykdommer, Toksoplasmose og tularemi [14] – [16]. Som andre fluorokinolon familiemedlemmer er det også kjent for å ha visse immunmodulerende effekter
in vitro
i ulike cellelinjer så vel som det er under kliniske forsøk for behandling av pulmonal tuberkulose [17]; [18]. Å ha så mye lignende implikasjoner med andre fluorokinoloner familiemedlemmer, har ingen vekst hemmende aktivitet mot kreftcellelinjer blitt rapportert for Gatifloxacin. Videre er pankreasvevet trengende effektivitet meget godt rapportert [19] i tilfelle av fluorokinolonene som fristet oss til å utforske den mekanismen som Gatifloxacin undertrykker bukspyttkjertelkreft cellevekst. I denne studien undersøkte vi effekten av Gatifloxacin på overlevelse og proliferasjon av bukspyttkjertelcancercellelinjer (MIA PACA-2 og Panc-1) og fant at Gatifloxacin var i stand til å undertrykke proliferasjonen av begge cellelinjer med MIA PACA-2 er mer sensitiv enn Panc-1. Den differensielle utfallet kan være på grunn av forskjellen i funksjons TGF-p-reseptorer i de to cellelinjer med MIA PACA-2 å være følsomme for TGF-β1 og Panc-en være motstandsdyktig som de mangler funksjonell TGF-β type I-reseptor [20]. Vi fant ut at Gatifloxacin arrestasjoner cellene i G
2-fase via inaktivering av cdc2-cyclinB1 komplekset ved fosforylering av cdc2 på Tyr15 gjennom p53-aktivering. Videre viser vi at Gatifloxacin kan indusere p21 og P27 nivåer i MIA PACA-2 og Panc-1 celler henholdsvis dermed forårsaker S-fase arrest. Vi videre viste at Gatifloxacin var i stand til å synergize den antiproliferative aktivitet av gemcitabin og cisplatin i begge cellelinjer.
Resultater
Gatifloxacin undertrykker spredning av bukspyttkjertelen carcinoma celler
In Vitro
for å evaluere anti-proliferativ effekt av Gatifloxacin, brukte vi MIA PACA-2 og Panc-1 bukspyttkjertelen karsinom cellelinjer. Vi først studert effekten av forskjellige doser (0-400 ug /ml) av Gatifloxacin på levedyktigheten av MIA PACA-2 og Panc-1-celler i 24 timer og 48 timer ved hjelp av MTT-analyse. Som vist i figur 1, GFX behandlingen resulterte i tid og doseavhengig reduksjon i celleformering på MIA PACA-2 og Panc-1 celler men ved forskjellige nivåer. Gatifloxacin behandling resulterte i 15-46% (p = 0,002) reduksjon i celleviabilitet i MIA PACA-2 og 1-43% (p = 0,007) reduksjon i celleviabilitet i Panc-1-celler etter 24 timer henholdsvis (figur 1A i) . Vi har observert 19-73% (p = 0,0016) reduksjon i celleviabilitet i MIA PACA-2 og 11-72% (p = 0,00016) reduksjon i celleviabilitet i Panc-1-celler etter 48 timer henholdsvis (figur 1 A ii). Ovennevnte data viser tydelig MIA Paca-2 for å være mer følsomme for Gatifloxacin enn Panc-en ved alle doser. Et slående observasjon fra disse data ble den redusert levedyktighet, å være mer uttalt ved høyere doser (100, 200 og 400 ug /ml) av Gatifloxacin behandling etter 24 timer og 48 timer behandling i begge cellelinjene og dermed vi tok disse konsentrasjonene og tids punkter for å gjennomføre ytterligere forsøk.
MTT-analysen av MIA PACA-2 og Panc-1-celler etter behandling med Gatifloxacin (0-400 pg /ml) i 24 timer (AI) og 48 t (Aii). Celler ble sådd ut i 96-brønners plater (1 x 10
4 celler /brønn) som ble tillatt å overholde natten over og ble deretter behandlet med økende konsentrasjon av Gatifloxacin etter 24 og 48 timer. Vertikale akse representerer% formeringshastigheten, mens horisontale aksen representerer økende konsentrasjon av Gatifloxacin i ug /ml. Dataene er gjennomsnitt ± SEM tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. * P 0,01 i forhold til kjøretøykontroll. (B) Annexin V-PE binding i MIA PACA-2 (i-v) og Panc-1 (vi-x) etter behandling med Gatifloxacin i 48 timer som vurderes av 7-AAD og AnnexinV farging. (I) og (vi) vehikkelbehandlede kontrollceller, (ii) og (vii) celler behandlet med 100 ug /ml, (iii) og (viii) celler behandlet med 200 ug /ml, (iv) og (ix) -celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin. (V) MIA PACA-2-celler og (x) Panc-1-celler behandlet med curcumin 60 uM i 24 timer som positiv kontroll. Vertikale aksen representerer 7-AAD-positive celler, mens horisontale aksen representerer Annexin V-PE-positive celler. Representative for tre uavhengige eksperimenter er vist med tilsvarende resultater. (C) Western blot analyse av ekspresjonen av Bax protein under innvirkning av Gatifloxacin i en tid (24, 48 h) og dose (0, 100, 200, 400 ug /ml) avhengig måte. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (D) Caspase 3, 8, 9 aktivitet av MIA PACA-2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin i tid (24, 48 h) og dose (0, 100, 200, 400 ug /ml) avhengig måte. Søylediagram representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter
Gatifloxacin induserer cellesyklus arrest på S og G
2 -. Phase i bukspyttkjertelen carcinoma celler uten induksjon av apoptose
neste undersøkt om Gatifloxacin-mediert reduksjon i levedyktigheten til MIA PACA-2 og Panc-1 celler er på grunn av apoptose /nekrose. Vi først sjekket for induksjon av apoptose av annexin-analyse. Som vist i figur 1B vi ikke fant noen signifikante endringer i apoptotiske /nekrotiske befolkningen ved alle doser av Gatifloxacin i forhold til kjøretøy behandlede celler i begge cellelinjer på 24 timer, så vel som på 48 h hhv. For ytterligere å kryss bekrefte våre annexin data, vi neste sjekket ekspresjonsnivået av proteinet proapoptotiske Bax ved western blotting og aktivitet av kaspase -3, -8 og -9 i en dose- og tidsavhengig måte under påvirkning av Gatifloxacin. Vi fant ingen signifikant endring verken i Bax proteinnivå (figur 1C) eller caspase -3, -8 og -9 aktivitet (figur 1D), som viser at Gatifloxacin ikke hindrer levedyktighet av celler. Resultater av Annexin V og Caspase-aktivitet ble også bekreftet ved bruk av en positiv kontroll, curcumin (60 uM i 24 timer).
Vi neste
målt på
cellesykluskinaser
status av MIA PACA-2 og Panc-1 celler i nærvær av 100, 200, 400 mikrogram /ml Gatifloxacin på henholdsvis 24 og 48 timer (figur 2 ). Cellesyklusfordeling analyse viste at Gatifloxacin hemmer cellesyklusprogresjon ved å arrestere cellene i S og G
2-fase i begge cellelinjene. I MIA PACA-2-celler, økning i prosentandelen av celler i S-fasen var fra 9 ± 1,1% (bærerbehandlede celler) til 21 ± 2,1% (400 ug /ml), med samtidig reduksjon i prosentandelen av celler i G
2 fase fra kjøretøyet behandlet 31 ± 2,1% til 18 ± 2,7% (400 ug /ml), og ingen endring i prosentandelen av celler i G
1 fase ble observert i celler eksponert til 24 timer. Men ved 48 timer, cellene begynte å akkumulere i G
2 fase fra 24 ± 3% (bærerbehandlet) på 67 ± 2,5% ved 200 ug /ml Gatifloxacin og denne ble redusert til 40 ± 2% ved 400 ug /ml av Gatifloxacin (figur 2i og øvre panel). I Panc-1, cellene begynte å akkumulere i S-fase fra 8 ± 1% (bærerbehandlet) til 14 ± 1,5% (400 ug /ml), men i motsetning til MIA PACA-2, begynte cellene å akkumulere i G
2- fasen fra 24 timer og oppover fra 29 ± 1% (kjøretøy behandlet) til 56 ± 3% og ble begrenset tilbake til 32 ± 1,05% ved 400 mikrogram /ml (figur 2ii og øvre panel). Ingen økning i SubG1 topp ble observert i begge cellelinjer. Til sammen våre data tyder sterkt på at Gatifloxacin ikke induserer apoptose, men fører til en pågripelse av celler i S og G
2-fase i bukspyttkjertelen carcinoma celler.
Effekter av Gatifloxacin på cellesyklus ble undersøkt ved hjelp av PI ( propidiumjodid) farging. Celler ble behandlet med (0-400 pg /ml) Gatifloxacin i 24 og 48 timer, oppsamlet og farget med PI. Her Pink topp representerer G
1-fase, representerer Green Peak S-fase og blå topp representerer G
2-fase hhv. Øvre panel viser representative for tre uavhengige eksperimenter med tilsvarende resultater og nedre panel representerer stolpediagram av celler i forskjellige faser. Søylediagram representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk. (I) Representative søylediagram for MIA PACA-2, (ii) Representative søylediagram for Panc-1.
Gatifloxacin bevirker aktivering av TGF-β1 /SMAD Kompleks /p21 på MIA PACA-2 og aktivering av p27 i Panc-1
Nyere studier har vist at en av de fluorquinolon, undertrykker ciprofloxacin tykktarmskreft celleformering ved å arrestere dem i S-fase gjennom TGF-β1 og TGF-β1 er også meget godt kjent for årsaken cellesyklus arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler [21]; [22]. Til
undersøke
om Gatifloxacin-
indusert
S-fase arrestasjonen var
TGF
-β
avhengig
vi sjekket nivåene av TGF-β1 på transkripsjons så vel som translasjonelle nivåer. Vi har funnet Gatifloxacin behandling (100, 200, 400 ug /ml) for å øke TGF-β1 ekspresjon i en doseavhengig måte ved 1,5-2 ganger (p 0,01) på transkripsjonsnivået og 1.3-2 ganger (p 0,01) hos translasjonsforskning nivå etter 48 timer i MIA Paca-2 celle, men ikke i Panc-1 celler (Figur 3AI, 3BI). Siden vi
funnet signifikant økning i
TGF-β1 uttrykk nivå på 400 mikrogram /ml, gjorde vi tidsforløpet studier og observerte at TGF-β1 startet økende transcriptionally innen 4 h (p = 0,023) med behandling og nådd maksimum av 12 timer (p 0,01) og deretter flatet ut på 16 timer (Figur 3Aii). Men translatorisk, blir TGF-β1 aktivert innen 8 h (p = 0,039) bare og nådde sin maksimale uttrykk ved 16 timer (p 0,01) (figur 3Bii), som vurderes av real time PCR og Western blotting. Det er økende bevis for at Smad transkripsjonsfaktorer megle veksthemmende virkning av transformerende vekstfaktor-β1 (TGF-β1) i mange celletyper [23]. For å undersøke den relative bidrag fra hvert Smad proteiner til TGF-β1 signalering, ble protein ekspresjon av Smad2 og Smad3 analysert ved western blotting av celle-ekstrakter etter 48 h fra Gatifloxacin behandling (100, 200, 400 ug /ml) på MIA PACA-2- celler. Som vist i figur 3Ci, observerte vi signifikant økning i fosfor-Smad3 (
pSmad3 på Ser 423
), mens det var ingen endring i nivåene av
fosfor Anmeldelser –
Smad2
(
pSmad2 på Ser 467
) etter 48 h av Gatifloxacin behandling ved alle doser i MIA PACA-2 celler. Videre er økningen i fosfo
Smad3 plakater (
pSmad3
) ble funnet å være i en doseavhengig måte (1,3-2,4 ganger, p = 0,0127) sammenlignet med bærerbehandlede celler. Nok bevis er der for å støtte at aktivert Smad2 eller Smad3 dimerizes med Smad4 og translocates til kjernen, hvor den aktiverte komplekser forbinder med Smad bindende element (SBEs) i arrangører av mange gener som fører til deres induksjon [24] – [26]. p21
Waf1 /Cip1 er et slikt gen som er kjent for å være involvert i TGF-β1 medierte regulering av celleproliferasjon [27]. For å bestemme hvorvidt Smad3 translocates som reaksjon på TGF-β1 stimulering på MIA PACA-2-celler, bedømmes vi den subcellulære fordelingen av Smad3 /4 og som forventet, ble det observert signifikant reduksjon i Smad-3 og Smad-4-protein ekspresjon i cytosoliske fraksjon, og det ble samtidig økning i den Smad-3 og Smad-4-protein-ekspresjon i atomfraksjonen i Gatifloxacin behandlet MIA PACA-2-celler i en dose- og tidsavhengig måte (figur 3Cii). Samtidig vi også analysert ekspresjonen av p21
Waf1 /Cip1, nedstrøms effektor av TGF-β1 som er kjent for å være en viktig regulator av cellesyklusprogresjon. Som p21, er p27 en cyclin avhengig kinase inhibitor som regulerer G
1-S-fasen av cellesyklusprogresjon, derav vi sjekket uttrykket av p21 og p27 av western blot analyse [28]. Vi har observert signifikant økning (1,4-1,7 ganger, p = 0,038) i nivåene av p21 og signifikant reduksjon (0,57 til 0,35 ganger, p = 0,012) i nivåene av p27 på en doseavhengig måte etter 48 h fra Gatifloxacin behandling sammenlignet til kjøretøy behandlede celler (figur 4Ai). Interessant økning i p21 ble kun observert etter TGF-β1 aktivering, dvs. etter 12 timer (p = 0,035), på MIA PACA-2-celler (Figur 4Aii). Men i tilfelle av Panc-1 celler som mangler funksjonell TGF-β1 vi fant ikke aktivering av p21, men vi finner aktivering av p27. Vi har observert signifikant økning (1,8-2,3 ganger, p = 0,021) i nivåene av p27 på en doseavhengig måte etter 48 timer med Gatifloxacin behandling, sammenlignet med bærerbehandlede celler (figur 4Ai). Samtidig vi også sjekket nivåene av Skp2 som formidler ubiquitinering og degradering av p27 /p21 i begge cellelinjene MIA PACA-2 og PANC-1 i respons til Gatifloxacin behandling (0, 100, 200 og 400 ug /ml) [29] . Vi fant signifikant økning (2.7 til 4.3 ganger, p = 0,008 i MIA PACA-2 celler og 04.03 til 06.03 fold p = 0,005 i Panc-1) i Skp2 nivåer i begge cellelinjene. Som forventet fant vi invers korrelasjon mellom Skp2 og p27 /p21 (figur 4Ai). Til sammen denne studien indikerer at TGF-β1 /Smad3 /p21, er en av de veier som fører til S-fase arrest i MIA PACA-2 celler og p27 spille avgjørende rolle i S-fase arrestasjonen av Panc-1 celler.
(A) (i) real Time PCR-analyse av TGF-β1 ekspresjon i MIA PACA-2 og PANC-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en doseavhengig måte, (ii) real Time PCR-analyse av TGF-β1 ekspresjon på MIA PACA-2-celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin på en tidsavhengig måte. 18S rRNA ble anvendt for å normalisere resultatene. (B) Western blot-analyse av TGF-β1 ekspresjon i MIA PACA-2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en doseavhengig måte (i) Western blot analyse av TGF-β1 ekspresjon i MIA PACA-2-celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin i en tidsavhengig måte (ii). Dataene er representative for typiske eksperiment gjentatt tre ganger med lignende resultater. Søylediagram representerer middelverdien ± SEM. (C) (i) Effekt av Gatifloxacin på reseptormedierte Smads (pSmad-2 og pSmad-3) når vurdert i hel-celle-lysat i MIA PACA-2-celler. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (Ii) translokasjon av Smad 3-4 komplekset fra cytoplasma til kjernen under påvirkning av Gatifloxacin i en dose (0, 100, 200, 400 ug /ml) og tidsavhengig måte (0, 6, 12, 18, 24 timer) ble vurdert ved western blotting. Nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner ble separert som beskrevet i avsnittet «Materialer og metoder» -delen. Lamin B (Nuclear bestemt protein) og α-Tubulin (Cytoplasmatiske bestemt protein) ble brukt som laste kontroller.
(A) (i) Western blot analyse av p21, p27 og Skp2 uttrykk i MIA Paca -2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en doseavhengig måte. β-aktin ble benyttet som lastekontroll for p21 og p27, mens Lamin B ble anvendt som lastekontroll for Skp2, (A) (ii) Western blot-analyse av p21-ekspresjon i MIA PACA-2-celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin på en tidsavhengig måte. Dataene er representative for typiske eksperiment gjentatt tre ganger med lignende resultater. Søylediagram representerer middelverdien ± SEM. * P 0,01, # p 0,05 versus kontroll. Gatifloxacin mediert S-fasen rest er TGF-β1 avhengige i MIA PACA-2 (B) (i) MTT-analysen av MIA PACA-2 og Panc-1 celler i nærvær av rekombinante TGF-β1 i 48 timer. Vertikale akse representerer% formeringshastigheten, mens horisontale aksen representerer økende konsentrasjon av rekombinante TGF-β1 i ng /ml. Dataene er gjennomsnitt ± SEM tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. * P 0,01, # p 0,05 versus kontroll. (B) (ii) Avvikling av S-fase arrest i MIA PACA-2-celler som vurdert ved PI (propidium jodid) farging. Celler transfektert med TGF-β1 siRNA (48 h) og egge siRNA alongwith ikke-transfekterte celler ble behandlet fra 100 ug /ml til 400 ug /ml Gatifloxacin (24 h) etter 24 timer etter transfeksjon, oppsamlet og farget med PI. Venstre panel representerer søylegraf hvor den vertikale aksen representerer% DNA-innholdet i S-fase og horisontal akse representerer Gatifloxacin konsentrasjon i pg /ml. Søylediagram representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk. * P 0,01, # p 0,05 versus kontroll. Høyre panel viser Western blot for knockdown effektiviteten av TGF-β1 siRNA. (1) representerer ikke-transfekterte kontrollceller, (2) TGF-β1 siRNA transfekterte celler, (3) TGF-β1 siRNA transfekterte celler med 400 ug /ml Gatifloxacin, (4) siRNA transfekterte celler, (5) siRNA transfekterte celler med 400 ng /ml Gatifloxacin. Gatifloxacin mediert S-fasen arrest er p21 avhengige i MIA PACA-2 og p27 avhengige i Panc-1 celler. (C) Avvikling av S-fase arrest i MIA PACA-2-celler transfektert med p21 siRNA (i) og Panc-1 celler transfektert med p27 siRNA (ii), henholdsvis som bedømt ved PI (propidium jodid) farging. Celler transfektert med p21 /p27 siRNA og egge siRNA (48 h) alongwith ikke-transfekterte celler ble behandlet med 100 pg /ml til 400 ug /ml av Gatifloxacin (24 h) etter 24 timer etter transfeksjon, oppsamlet og farget med PI. Venstre panel representerer søylegraf hvor den vertikale aksen representerer% DNA-innholdet i S-fase og horisontal akse representerer Gatifloxacin konsentrasjon i pg /ml. Høyre panel viser western blot for knockdown effektiviteten av p21 eller p27 siRNA. (1) representerer ikke-transfekterte kontrollceller, (2) p21 /p27 siRNA transfekterte celler, (3) p21 /p27 siRNA transfekterte celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin, (4) egge siRNA transfekterte celler, (5) kryptert siRNA transfekterte -celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin. Søylediagram representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk. * P 0,01, # p. 0,05 versus kontroll
Gatifloxacin mediert S-fase Arrest er TGF-β1 /p21 Dependent i MIA PACA-2 og p27 Dependent i Panc-1 celler
å bekrefte rollen til TGF-β1 i å undertrykke proliferasjon, ble rekombinant TGF-β1 transfektert med forskjellige doser (0-100 ng /ml) på MIA PACA-2 og Panc-1-celler i 48 timer og MTT-analysen ble utført . Vi har observert at i løpet av ekspresjon av TGF-β1 undertrykte betydelig MIA PACA-2 celle-proliferasjon på en doseavhengig måte. Vi har observert signifikant reduksjon (35%, p 0,05, figur 4Bi) i celleproliferasjonen ved en konsentrasjon på 100 ng /ml på MIA PACA-2-celler, men ikke i Panc-1 celler. Våre funn er i samsvar til resultatene av Francisco j Nicolas
et al
som tyder Panc-en for å være motstandsdyktig mot TGF-β1 indusert vekst arrest. Videre for å bekrefte rollen til TGF-β1 i mediering av S-fase rest indusert ved Gatifloxacin på MIA PACA-2, stilnet vi TGF-β1 ekspresjon ved hjelp av siRNA og gjorde cellesyklusanalyse. Som vist i fig 4Bii, ble S-fase rest fullstendig avskaffet ved alle de tre doser av Gatifloxacin anvendt i TGF-β1 siRNA transfekterte celler sammenlignet med egge siRNA transfekterte celler eller ikke-transfekterte celler. Følgelig neste søkte vi å finne ut hvilken rolle p21 og p27 på S-fase arrest i TGF-β1 sensitive MIA Paca-2 eller resistente Panc-1 celler henholdsvis. Vi fant ut at p21 siRNA transfekterte MIA Paca-2 (figur 4CI) og p27 siRNA transfekterte Panc-1 celler (figur 4Cii) sterkt hemmer Gatifloxacin induserte S-fase arrest i forhold til egge siRNA på alle doser. siRNA mediert knock down av TGF-β1, p21 og p27 ble også bekreftet ved hjelp av western blot analyse (figur 4Bii, Ci og Cii). siRNA mediert knockdown resultater tyder på at S fase arrestasjon av Gatifloxacin er TGF-β1 /p21 avhengige i MIA PACA-2 og p27 avhengige i Panc-1 celler.
Gatifloxacin hemmer Pakt og forårsaker G
2-fase arrest i p53 avhengig måte i begge cellelinjer
Forskjellige studier har vist at p53 kan aktivere ekspresjon av p21 som deretter hemmer cyklin-avhengige kinaser og fører til cellesyklus-stans [30]. Tilsvar pakt har også vist seg å være en viktig regulator av celleoverlevelse og cellesyklusprogresjon bortsett fra negativ regulering av p53 [31]. Således vi ved kontrollert ekspresjon av p53, total AKT og pakt i nærvær eller fravær av varierende doser av Gatifloxacin. Figur 5A og 5B viser aktivering av p53 på begge transkripsjonelle og translasjonelle nivåer. Vi fant Gatifloxacin behandling på 100 og 200 mikrogram /ml dose øker p53 uttrykk ved 1,4 til 2 ganger (p 0,01) transcriptionaly og 1,8 til 2,45 ganger (p 0,01) translatorisk i MIA PACA-2 celler og 1,75 til 2,5 ganger (p 0,013) transcriptionaly og 1,4-2,0 ganger translatorisk i Panc-1 celler etter 48 timer (Figur 5Ai, 5Bi) sammenlignet med kjøretøy behandlede celler. Vi fant ikke noen endring i p53 mRNA nivå /protein nivå i begge cellelinjer på 400 mikrogram /ml Gatifloxacin (figur 5B). Siden vi fikk maksimal ekspresjon på 200 ug /ml, gjorde vi tidsforløpet eksperiment på 200 ug /ml Gatifloxacin og observert at p53-ekspresjon begynte å øke i løpet av 8 timer fra Gatifloxacin behandling, transcriptionaly (p = 0,032) samt translationaly (p = 0,022) i PANC-1-celler, men det ble forsinket økning i p53-ekspresjon på MIA PACA-2-celler som utløser seg i betydelig grad bare etter 24 timer transcriptionaly (p = 0,034) samt translationaly (p = 0,048) og nådde maksimum ved 40 h (p 0,01) og utover i begge cellelinjer (figur 5Aii, 5Bii). Som vist i fig 5Bi, Gatifloxacin (100, 200, 400 ug /ml) behandling forårsaket signifikant reduksjon i pakt (Ser 473) nivåer på en doseavhengig måte 0,86 til 0,51 ganger (p = 0,027) i MIA PACA-2 og 0,89 -0,41 fold (p 0,01) i Panc-1-celler med henholdsvis uten noen endring i total AKT nivåer. Vår tid-retters Forsøket viste at opp til 16 timer var det ikke mye nedgang i p-Akt (Ser 473) nivåer, men etter 16 timer var det
betydelig
nedgang på Pakt nivåer (p 0,01) i MIA Paca -2 celler. I PANC-1 celler, opp til 24 timer var det ingen reduksjon i pakt nivå og reduksjonen ble betydelig fra 32 timer (p 0,01). Og oppover, i nærvær av 400 ug /ml Gatifloxacin behandling (figur 5Bii)
(A) (i) real Time PCR-analyse av p53-ekspresjon på MIA PACA-2 og PANC-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en doseavhengig måte, (ii) real Time PCR-analyse av p53-ekspresjon på MIA PACA-2 og Panc-1-celler behandlet med 200 ug /ml Gatifloxacin på en tidsavhengig måte. 18S rRNA ble anvendt for å normalisere resultatene. (B) (i) Western blot-analyse av p53, AKT og pakt uttrykk i MIA PACA-2 og PANC-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en doseavhengig måte, (ii) Western blot-analyse av p53, AKT og pakt ekspresjon i MIA PACA-2 og PANC-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en tidsavhengig måte. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. Dataene er representative for typiske eksperiment gjentatt tre ganger med lignende resultater. Søylediagram representerer middelverdien ± SEM. * P 0,01, # p 0,05 sammenlignet med kontroll
Neste, for å undersøke om arrestasjonen indusert av Gatifloxacin er p53 avhengige, transkripsjon inhibitor ActinomycinD (ActD) og proteinsyntese inhibitor Cycloheximide. (CHX) ble anvendt, og cellesyklusanalyse ble utført. Som vist i figur 6A, i nærvær av 200 ug /ml Gatifloxacin var det fullstendig G
2-fase rest, som ble opphevet i nærvær av CHX (2 ug /ml) og ActD (1 pg /ml) etter 48 h i begge cellelinjene. Høyre panel av figuren viser effekten av CHX og Act D i å redusere p53-nivåer. Våre resultater antydet at Gatifloxacin forårsaker G
2-fase arrest i en p53 avhengig måte. Vi kunne ikke bruke siRNA her fordi det er godt dokumentert at både MIA PACA-2 og Panc-en har mutasjon i p53 [32]. For å bekrefte rollen p53 i Gatifloxacin indusert G2 arrest videre, en sammenligning mellom svarene i isogen HCT116 villtype p53 + /+ og mangelfull p53 – /- cellelinjer ble gjort. Vi behandlet begge cellelinjer med Gatifloxacin (100, 200, 400 ug /ml) i 24 timer, og fant betydelig økning i p53-protein-nivå i vill-type HCT116 p53 + /+ som var lik MIA PACA-2 og Panc-1. Denne induksjon ble imidlertid ikke observert i p53 mangelfull HCT116 p53 – /- celler som ble behandlet under de samme betingelser (fig 6Bi). Vi sammenlignet også den cellepopulasjon arrestert i G2-fasen etter Gatifloxacin behandling av begge cellelinjer HCT116-cellelinjer. Våre data viste signifikant økning i G2-fase arrest fra 27% til 41% i HCT p53 + /+ cellelinje, men ingen endring i G2-fase undergruppe i HCT p53 – /- cellelinje og dermed peker mot vår teori om p53 som et mål på Gatifloxacin (figur 6Bii). Vi har da også bekreftet effekten ved samtidig å kontrollere ekspresjonen av p53-proteinet i en doseavhengig måte (Gatifloxacin 0, 100, 200, 400 ug /ml) i to andre p53-positive cellelinjer MCF7 (2-3,08 gangers økning, p = 0,0078 ) og A549 (2.1 til 4.8 ganger økning, p = 0,0085) henholdsvis (figur 6C).
(A) Venstre panel viser Cell syklus analyse av MIA PACA-2 og Panc-1 celler når dyrket i tilstedeværelse eller fravær av p53 transkripsjonen inhibitor ActinomycinD (1 pg /ml) eller translasjonell inhibitor cykloheksimid (2 ug /ml) sammen med 200 ug /ml Gatifloxacin i 48 timer og høyre panel viser p53-protein ekspresjon i MIA PACA-2 og Panc- 1 celler i nærvær eller fravær av 200 ug /ml Gatifloxacin med eller uten 2 ug /ml CHX eller 1 pg /ml ActD. % Her viser prosentandelen av G
2 fase undergruppe. (B) (i) Western blot-analyse for p53-ekspresjon i HCT116 p53 + /+ og P53 – /- cellelinjer behandlet med Gatifloxacin på en doseavhengig måte i 24 timer. (Ii) cellesyklusanalyse av HCT116 p53 + /+ og P53 – /- behandlet med Gatifloxacin (0-400 pg /ml) i 24 timer. % Her viser prosentandelen av G
2 fase undergruppe. (C) Western blot-analyse av p53-protein ekspresjon i MCF 7 og A549-celler behandlet med Gatifloxacin på en doseavhengig måte. Søylediagram representerer middelverdien ± SEM. * P. 0,01, sammenlignet med kontrollgruppen
Gatifloxacin reduserer nivåene til S og G
2-fase Regulatoriske CDK og Cykliner i begge cellelinjer
For å dissekere den biokjemiske hendelser som styrer overgangen fra en cellesyklus fase vi undersøkte nivåene av flere cellesyklusproteiner etter behandling med Gatifloxacin. Cyklin A, cyklin E og CDK2 regulerer normal S-faseprogresjon [33]; [34], og vi har funnet Gatifloxacin å betydelig redusere ekspresjonsnivåene til disse proteinene i begge cellelinjene på en doseavhengig måte etter 48 timer (figur 7A). På lignende måte Gatifloxacin behandling i begge cellelinjene også skyldes nedregulering av syklin B1 uttrykk, som er involvert i G
2-faseprogresjon. Imidlertid fant vi økning i ekspresjon av hemmende fosforylering av cdc2 ved Tyr-15, så vel som total CDC-2 nivåer i begge cellelinjene, mens det var ingen forandring i ekspresjon av Cdc25c.
(A ) effekt av Gatifloxacin på S og G
2-faseregulerings Cykliner og CDK som vurdert ved western blot-analyse på MIA PACA-2 og Panc-1-celler (B) Gatifloxacin (100 ug /ml) synergizes den antiproliferative effekt av gemcitabin
