Abstract
Nye behandlingsformer for sent stadium og kastrering resistent prostatakreft (CRPC) er avhengig av å definere unike egenskaper og veier av celleunderpopulasjoner i stand til å opprettholde netto tilvekst av kreft. En av de beste berikelse ordninger for å isolere den antatte stilk /stamceller fra mus prostatakjertelen er Lin
-; Sca1
+; CD49f
hi (LSC
hi), noe som resulterer i en mer enn 10 ganger berikelse for
in vitro
sfære dannende aktivitet. Vi har vist tidligere at LSC
hi undergruppe er både nødvendig og tilstrekkelig for kreft initiering i
PTEN
-null prostatakreft modell. For ytterligere å forbedre dette berikelse ordningen, søkte vi etter celleoverflatemolekyler oppregulert ved kastrering av murine prostata og identifisert CD166 som kandidat genet. CD166 koder for et celleoverflaten molekyl som kan berike sfære dannende aktivitet av WT LSC
hei og
PTEN
null LSC
hi. Viktigere, CD166 kunne berike sfære dannende evne godartede primære humane prostataceller
in vitro Hotell og indusere dannelsen av tubulære-lignende strukturer
in vivo
. CD166 uttrykk er oppregulert i menneskelige prostata kreft, spesielt CRPC prøver. Selv om genetisk sletting av murine CD166 i
PTEN
null prostatakreft modellen ikke forstyrrer sfære formasjon eller blokkere prostatakreft progresjon og CRPC utvikling, tilstedeværelse av CD166 på prostata stilk /stamceller og kastreringsresistent subpopulasjoner foreslå at det er et celleoverflatemolekyl med potensial for målrettet levering av menneskelige prostata kreftbehandling
Citation. Jiao J, Hindoyan A, Wang S, Tran LM, Goldstein AS, Lawson D, et al. (2012) Identifisering av CD166 som overflaten markør for berikende Prostata Stem /stamfar og kreft initiere Cells. PLoS ONE 7 (8): e42564. doi: 10,1371 /journal.pone.0042564
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 8 mars 2012; Godkjent: 09.07.2012; Publisert: 03.08.2012
Copyright: © Jiao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet delvis av en pris fra Prostate Cancer Foundation (til OW, IPG og HW), Jean Perkins Foundation og Department of Defense (til IPG) og et stipend fra National Institutes of Health (R01 CA107166 og RO1 CA121110 til HW ). Onw er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for fremskritt i tidlig oppdagelse og behandling av prostatakreft, kastrering resistent prostatakreft (CRPC) er fortsatt den nest vanligste årsaken til dødeligheten blant menn i USA [1]. Monterings bevis tyder på at en subpopulasjon av prostataceller kan initiere prostatakreft og kan være ansvarlig for den kastrering motstanden [2], [3], [4], [5]. Derfor er disse kreft initiere celler [6] kan tjene som lovende cellulære mål for prostatakreft og identifisering av denne undergruppe har blitt nødvendig skritt mot fremtidig effektiv behandling.
Opprinnelsen til prostatakreft initierende celler er kontroversielle [7 ], [8]. Normal prostata fra menneske eller mus inneholder tre forskjellige typer av celler, nemlig luminal sekretorisk, basal og nevroendokrine celler. Ettersom human prostata kreft er karakterisert ved tapet av basalceller og utvidelse av luminal celler, flere dyremodeller posit at luminal-spesifikke forløpere er kildene til prostatakreft initiering [9], [10], [11]. Imidlertid, ved hjelp av vev regenerering tilnærmingen, har basale celler vist seg å være mer effektive onkogene mål for både mus og menneske prostata cancer initiering [12], [13]. Interessant, Xin gruppe vist at voksne murine prostata basal og luminal celler er selvbærende linjene som både kan tjene som onkogene mål for prostatakreft initiering [14].
PTEN spiller en viktig rolle i menneskelig prostata kreft og CRPC utvikling [15] og inaktiveres i 20% av primær og 60% av metastatiske lesjoner [16]. Den murine
PTEN
prostatakreft modell (
Pb-Cre
+; PTEN
L /L
) rekapitulerer sykdomsutviklingen hos menneske, inkludert CRPC [17], [ ,,,0],18], [19], [20], og deler mange signatur genetiske endringer med sykdom hos mennesker [17]. Viktigere,
Pb-Cre
+, gir PTEN
L /L
modellen et unikt verktøy for å studere svulst initiere celler som de fleste av luminal celler og subpopulasjoner av basal celler har
PTEN
sletting [17], [18]. Ved hjelp av denne modellen, viste vi at
PTEN
sletting fører til en utvidelse av basal og forbigående forsterker subpopulasjoner og påfølgende startfasen
in vivo product: [18]. Vi viste Lin videre
-Sca-en
+ CD49f
hi (LSC
hi) prostata stilk /stamceller fra
PTEN
null prostata er i stand til å initiere en kreft fenotype som etterligner den primære kreft i
PTEN
null prostata modell [19].
Her rapporterer vi identifiseringen av en celleoverflaten markør, CD166 eller Aktivert Leukocytt celleadhesjonsmolekyl (CD166 /Alcam ) som er sterkt oppregulert i menneskelige og murine CRPC prøver. CD166 kan brukes til å berike for stilk /progenitor kule dannende celler fra både WT og
PTEN
null mutante mus prostata. I tillegg kan CD166 skille LSC
hi mus stilk /stamceller i CD166
hi og CD166
lo subpopulasjoner, med LSC
hi; CD166
hi undergruppe ha mye høyere sfære dannende aktivitet. Vi viser videre at CD166 kan brukes som en berikelse maker for å isolere human prostata kule dannende celler og tubulære dannende celler.
Resultater
CD166 Expression er oppregulert i Murine kastrerte prostata Epitel og kan brukes til Berikende Stem /stamceller
gnager prostata inneholder stilk-lignende celler som er beriket i kastrerte prostatakjertelen og kan gjennomgå mer enn 15 sykluser av involusjoner-regenerering svar på androgen uttak og utskifting [21] . Vi tenkte at kastrering kan også føre til oppregulering eller anriking av disse stamcelleoverflatemolekyler som potensielt kan tjene som markør for å isolere stilk /stamceller og for målrettet levering av legemidler. Vi har derfor utvunnet offentlig tilgjengelige databaser som beskriver genekspresjonsprofiler fra murine prostata ved dag 0 og dag 3 etter kastrering [22], [23]. Vi fokuserte på de genene som falt i genet ontologi kategorien «plasma membran «og identifiserte CD166 /Alcam som en av kun to vanlige kastrering-beriket celleoverflatemolekyler (Tabell S1). CD166 betydelig høyere (en hale t-test 0,015) 3 dager etter kastrering i forhold til intakte mus. Mens Cxcl12 er også oppregulert, vi valgte å ikke fokusere på dette genet som det er en chemokin og ikke mottagelig for FACS-mediert stilk /stamceller berikelse.
CD166 er en type jeg transmembrane protein av Ig super som medierer celle-celle interaksjoner via heterofile (CD166-CD6) og /eller homofilist (CD166-CD166) mekanismer [24], [25]. Vi fant at i de intakte mus, er CD166 fortrinnsvis uttrykt i stammen /progenitor-beriket proksimale region [21], men lav i stammen /progenitor fattig distal regionen WT prostata (Figur 1A øverste panelene). CD166 protein nivåer er også oppregulert umiddelbart etter kastrering (figur 1A nedre paneler, idet dag 0 og dag 3 post- kastrering)
(A) Top:. Sammenligning av p63 (rød) og CD166 (grønn) co-IF flekker mellom prostata proksimale region og distal regionen. Bunn: IHC for CD166 uttrykk fra intakte vs. kastrert mus prostata. Skala: 50 mikrometer. (B) Lin
-; CD166
hei, Lin
-; CD166
lo, LSC
hi; CD166
hi, og LSC
hi; CD166
lo celler ble isolert ved hjelp av FACS fra 8- til 12-uker gamle mus. Grafen viser prosentandelen av kule-dannende celler, basert på sfærene fra hver populasjon per 2500-celler belagt etter 8 dagers vekst. Data er vist som gjennomsnitt +/- STD (**, p 0,001, n = 3). (C) Brett endring av LSC
hi; CD166
hi innhold basert på intakt WT fra FACS analyse. (*, P 0,05, n = 3)
Prostata stammen /progenitor cellene er preget av sin evne til å danne kuler
in vitro product: [26]. Vi utførte sfæren dannende analysen bruker sortert CD166
hi og CD166
lo celler og funnet ut at CD166
hi celler har betydelig høyere sfære dannende aktivitet sammenlignet med CD166
lo celler (figur 1B, venstre ). Siden vi tidligere hadde utviklet LSC
hi anrikning ordningen [26], som gir 10-gangers anrikning av WT kule-dannende celler, testet vi om CD166 kan bli benyttet for videre berikende sfære dannende aktivitet. Vi gated LSC
hi celler i henhold til deres CD166 uttrykk og funnet ut at LSC
hi; CD166
hi celler har fem ganger høyere sfære dannende aktivitet i forhold til deres LSC
hi; CD166
lo motstykke (figur 1B, til høyre). Derfor kan CD166 brukes som en markør for å berike kuledannende celler i WT prostata. Seriell aging av sfærene generert fra LSC
hi; CD166
hi-celler viste at denne forbedrede kuledannende aktivitet kan opprettholdes
in vitro
gjennom minst tre passasjer (fig S1A). I kontrast, ble mindre kuler generert fra LSC
hi; CD166
lo celler (P0-P2) og kan ikke gjennomgå kontinuerlig passasje på grunn av begrenset celle nummer. Vi observerte ingen signifikant forskjell i sfæren størrelsesfordelingen mellom LSC
hi; CD166
hi generert kuler og LSC
hi; CD166
lo generert sfærer (Figur S1B og S1C). Ligner på LSC
hi undergruppe [26], kastrering fører også til betydelig forbedring av LSC
hi;. CD166
hi sub-populasjon (figur 1C)
CD166
hi human prostata celler har høyere Sphere Forming og Regeneration Potential
Visse celleoverflatemarkører, for eksempel Sca-1, er bare uttrykt i mus og kan derfor ikke benyttes for isolering av humane stilk /stamceller. CD166, på den annen side, er uttrykt i ulike organer og oppregulert på humane kreftformer, inkludert prostata kreft [27]. For å avgjøre om CD166 kan anvendes for å anrike human prostata stilk /progenitorceller, vi først undersøkt dets ekspresjon og funnet at CD166 er sterkt uttrykt i det fremkallende human fetal prostata epitelet (figur 2A, venstre panel) og fokalt uttrykkes i benign voksen prostata, som overlapper med en undergruppe av TROP2 og CD49f -. positive celler (figur 2, midtre og høyre panel)
(A) IHC farging av CD166 på menneskelig foster prostata vev og pasient prostata kreft vev. Skala: 50 mikrometer. (B) Totalt dissosiert prostataceller, ble CD166
hi og CD166
lo populasjoner isolert ved FACS fra 6 pasientprøver. Grafen viser prosentandelen av kule-dannende celler, basert på sfærene fra hver populasjon per 5.000 cellene forgylte etter 7 dagers dyrking. Viste data som gjennomsnitt +/- STD (**, p 0,001). (C) CD166
hi, og CD166
lo populasjoner ble isolert ved FACS fra 3 pasientprøver. CD166
hi og CD166
lo celler (2 × 10
5) ble implantert subkutant i NOD-SCID /IL2rγ null mus, i kombinasjon med 2 × 10
5 rUGSM induktiv mesenchymalceller. Grafts ble høstet, faste og analysert etter 8-16 uker. Venstre, viser grafen at CD166
hi menneskelige prostata celler kan danne flere tubuli i pode regenerering analysen sammenlignet med CD166
lo menneskelige prostata celler. Høyre, H E farging av representant pode. Skala: 100 mikrometer. (D) Venstre, FACS tomter vise porter trukket for sortering av LTC (TROP2
hi; CD49f
hi) CD166
hei og LTC; CD166
lo subpopulasjoner fra en pasient. Høyre, viser representative graf som LTC; CD166
hi menneskelige prostata celler kan danne flere tubuli i pode regenerering analysen i forhold til LTC;. CD166
lo menneskelige prostata celler
Vi deretter vurdert om CD166 kan brukes som en markør for å berike human stilk /stamceller. Godartede regioner av prostatavevet ble samlet inn fra flere pasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi og dissosiert til enkeltceller. I samsvar med våre tidligere studier [13], [28], hvor mange prosent av CD166
+ celler variere fra pasient til pasient (data ikke vist). Imidlertid var de fleste av sfæren dannende aktivitet identifisert i CD166
hi populasjonen (figur 2B), lik våre funn med murine prostataceller. Data er vist fra 6 representative pasienter.
For å vurdere om CD166 kan berike menneskelige prostata vev gjenfødelse kapasitet
i
vivo
, ble godartede menneskelige prostata cellene dissosiert og sortert etter celleoverflate CD166 uttrykk nivåer. Samme antall levedyktige CD166
hi og CD166
lo celler (2 × 10
5) ble implantert subkutant i NOD-SCID /IL2rγ null mus, i kombinasjon med 2 × 10
5 rUGSM induktiv mesenchymale celler. Etter 8-16 uker, ble grafts høstet, fast og i parafin for kvantifisering og analyser. CD166
hi celler har mer vev regenerering kapasitet som gjenspeiles av økt antall tubulære liknende epitelceller strukturer funnet i grafts, som er sjelden sett i CD166
lo grafts (Figur 2C). Videre analyser viste at de tubulære-lignende strukturer initiert av CD166
hi cellene inneholder CK5 og p63 uttrykker basal celler, CK8 luminal celler og AR positive celler (figur S2).
Kombinasjon av markører TROP2 og CD49f kan separate avstamning-negative menneskelige prostata epitelceller i ulike subpopulasjoner, med TROP2
hi; CD49f
hi (Lin
-T
HIC
hi eller LTC) celler som innehar den høyeste sfære dannende evne
in vitro product: [29]. I tillegg kan LTC celler utvikle kreft-lignende fenotype
in vivo
følgende onkogene transformasjon [13]. Vi testet om CD166 kan videre skille dette LTC befolkningen. FACS analyse av godartede menneskelige prostata celler indikerte at mer enn 50% av LTC stilk /stamceller også uttrykke CD166 overflaten markør (figur 2D, venstre og midtre panelet). Videre undersøkte vi om forskjeller i regenerering potensial eksisterer mellom disse to undergruppene. Sortert LTC; CD166
hei og LTC; CD166
lo celler ble injisert subkutant i NOD-SCID /IL2rγ
– null mus med 2 × 10
5 rUGSM celler og analysert 8-16 uker senere. Vår
in vivo
data tyder på at LTC; CD166
hi celler kan indusere flere tubulære-lignende strukturer, mens LTC;. CD166
lo cellene har mindre regenerering kapasitet (figur 2D, panel høyre)
CD166 kan brukes til å berike tumor Sphere dannende celler i
PTEN
Null prostatakreft Modell
for å undersøke om CD166 kan berike kreft initiere celler etter kastrering, vi sammenlignet prosent~~POS=TRUNC av CD166
hi undergruppe mellom intakte og kastrerte
PTEN
mutante mus og observerte utvidelsen av CD166
hi undergruppe etter kastrering (figur 3A). Deretter sammenlignet vi sfære formasjons egenskapene LSC
hi; CD166
hei, LSC
hi; CD166
lo, LSC
lo; CD166
hi, og LSC
lo; CD166
lo subpopulasjoner på pre-kreft PIN (6 uker) og kreft stadier (11 uker). Vi fant ut at LSC
hi; CD166
hi undergruppe har mye høyere sfære dannende evne, og nesten alle sfære dannende aktivitet i kreft stadium bor i LSC
hi; CD166
hi undergruppe (Figur 3B). I samsvar med vår forrige observasjon at
PTEN
mutante kuler er større enn WT kontrollsfærer [19], begge LSC
hi; CD166
hi og LSC
Hei, CD166
lo subpopulasjoner danne store prostata sfærer (Figur S3). Vår tidligere studie antydet at
PTEN
sletting fremmer utbygging av LSC
hi prostata stilk /stamceller [18], [19]. Innenfor LSC
hi befolkningen, observerte vi selektiv utvidelse av LSC
hi; CD166
hi celler.
PTEN
muterte musene har mer enn en 3-dobling i andelen LSC
hi;. CD166
hi undergruppe, sammenlignet med WT kullsøsken (Figur 3C)
( A) FACS blotter viser økt Lin
-CD166
hi befolkningen etter kastrering av
PTEN
mutante mus sammenlignet med intakte
PTEN
mutante mus. (B) Fire subpopulasjoner (LSC
hiCD166
hei, LSC
hiCD166
lo, LSC
loCD166
hei, LSC
loCD166
lo) ble isolert fra
PTEN
mutant prostata fra enten 6 uker eller 11 uker gamle mus. Grafen viser prosentandelen av kule-dannende celler. Data fra flere forsøk ble samlet. Data er vist som gjennomsnitt +/- STD (*, p 0,05, n = 3). (C) Venstre: søylediagram viser fold endring av
PTEN
mutant LSC
hiCD166
hi innhold sammenlignet med WT; høyre, FACS blotter viser utvidelsen av LSC
hi CD166
hi celler i LSC befolkning på
PTEN
mutant i forhold til WT. (D) RNA ble isolert fra ikke-LSC, LSC
hiCD166
hi, og LSC
hiCD166
lo fraksjoner i dupliserte eksperimenter. RNA ble syntetisert til cDNA og underkastet QRT-PCR. Grafen viser fold-berikelse i løpet av de ikke-LSC celler for hvert gen. GADPH ble brukt som referanse genet (*, p 0,05; **, p 0,01; ns, ikke signifikant).
For ytterligere å studere LSC
hi; CD166
hei undergruppe, vi isolert RNA fra LSC
hi; CD166
hei, LSC
hi; CD166
lo subpopulasjoner og cellefraksjon utarmet av LSC celler (ikke-LSC
hi) og sammenlignet deres genekspresjon ved RT-PCR-analyse. LSC
hi; CD166
hi undergruppe uttrykker tilsvarende nivåer av basalcellemarkører
CK5 Hotell og
p63
som LSC
hi; CD166
lo undergruppe (Figur 3D, venstre panel). Men LSC
hi; CD166
hi undergruppe uttrykker mye høyere nivå av luminal markør
Ck8 Hotell og
Trop2
, en ny epitelial overflate markør vi nylig identifisert for berikende stamcelle aktiviteter i både murine og humane prostata [13], [29] (figur 3D, høyre panel). Videre undersøkelse av flere andre epiteliale celle stamceller markører [10], [30], [31], [32], [33] viste at LSC
hi; CD166
hi celler har betydelig høyere
CD44 Hotell og
Nkx3.1
uttrykk i forhold til LSC
hi; CD166
lo celler. Selv sammenlignet med ikke-LSC befolkningen, LSC
hi; CD166
hi celler uttrykker mindre
Nkx3.1
. Ingen signifikante forskjeller ble funnet i
CD117
, og
CD133
uttrykk mellom disse to populasjonene (figur 3D, panel til høyre).
CD166 Expression er oppregulert i Human Kastrering Resistant Prostate kreft
etter å ha funnet ut at CD166 kan brukes til å berike for menneske LTC celler og mus svulst i itiating celler, vi deretter undersøkt forholdet mellom CD166 uttrykk og menneskelig prostata kreft progresjon. I klinisk kommenterte data for 218 prostatakreft [34], CD166 genekspresjon korrelerte signifikant med økende prostatakreft aggressivitet, som indikert ved Gleason stillingen, med den høyeste ekspresjon i metastase prøvene (figur 4A). Vi videre kartlagt CD166 uttrykk på menneskelige prostata kreft vev mikromatriser, som består av 14 kastrering resistente (CRPC) metastaseprøver og 98 hormonet naive primære kreftprøver fra pasienter som fikk enten neoadjuvant hormonbehandling (NHT) for ulike perioder eller mottar ingen behandling. CD166 er betydelig forbedret i CRPC prøver (figur 4B for representative bilder). Sammenlignet med den dominerende membran lokalisering av CD166 i hormon naive primære kreftprøver, observerte vi intens cytoplasma lokalisering av CD166 i CRPC bein metastaseprøver (figur 4B, høy forstørrelse). CD166 uttrykk nivåer ble scoret og p-verdiene er beregnet ved Mann-Whitney test. CD166 protein uttrykk nivået er betydelig høyere i CRPC prøvene sammenlignet med primære kreft med (p 0,0001) eller uten (p 0,02) NHT (Figur 4C). Disse data tyder på at CD166 er en kastrering-beriket markør for både mus og menneske prostatakreft.
(A) CD166 genekspresjon fra 147 humane prostatakreft ble analysert ved å sammenligne ulike Gleason score grupper til normal /godartet (NL /BN) prostata. (B) Representant IHC farging av CD166 uttrykk fra menneske prostata TMA. Top: hormon naive primære prostatakreft; Lav: kastrering resistent prostatakreft viser svært intensiv farging. Skala: 100 mikrometer (venstre); 10 mikrometer (til høyre). (C) Dataene fra 112 prøvene ble beregnet og statistisk analyse av CD166 ekspresjon av human TMA utført. NHT: neoadjuvant hormonbehandling; CRPC: kastrere resistent prostatakreft. Kolonne, mener CD166 flekker i NHT og CR vev. Prøvene ble gradert 0-3 representerer området fra ingen farging av tung flekker ved visuell scoring. Feil bar: standard feil. Immunreaktiviteten CD166 er vesentlig høyere i CRPC gruppen sammenlignet med ubehandlet gruppe (p 0,021) eller NHT med ulike behandlingstider (p 0,0001).
Tap av CD166 ikke forstyrrer WT Prostata Utvikling og prostata Sphere Dannelse
uttrykkes i en lang rekke vev, er CD166 vanligvis begrenset til undergrupper av celler som er involvert i dynamisk vekst og /eller migrering, herunder neural utvikling, forgrening utvikling organ, hematopoiese og immunrespons [27] . For å teste om CD166 spiller en iboende rolle i å regulere prostata stilk /stamceller, analyserte vi
CD166
knockout mus (
CD166
– /-
). Genetisk sletting av
CD166
genet ble oppnådd ved å erstatte sin første exon med en cDNA som koder EGFP [35].
CD166
null mus er fenotypisk normale og fruktbar [35]. Vi undersøkte prostata 8 og 20 ukers alder, og fant ingen forskjell i brutto anatomi og histologi blant WT (data ikke vist),
CD166
+/- Hotell og
CD166
– /-
mus prostata (figur 5A)
(A) Top: brutto anatomi av prostata av
WT Hotell og
CD166 – /-
mus på. 8 ukers alder, skala bar: 2 mm. Bunn: HE farging av DLP-delen fra WT og
CD166
– /- mus ved 8 ukers alder, skala bar: 200 mikrometer. (B) Sammenligning av sfære formasjon fra total usorterte prostataceller (5000 per 12-brønn) mellom
CD166
+/- Hotell og
CD166
– /-
prostata. Data som er representert som gjennomsnitt +/- STD (p 0,05, n = 3). (C) Sammenligning av LSC
hi innhold mellom
CD166
+/- Hotell og
CD166
– /-
prostata på 8-12 uker alder (p 0,05 , n = 5).
for ytterligere å undersøke om tap av CD166 har noen effekt på prostata stilk /stamceller, sammenlignet vi sfære formasjons aktiviteter
CD166
+/-
og
CD166
– /-
prostata epitel og fant det ikke er noen signifikant forskjell (figur 5B). I tillegg kuler generert fra
CD166
– /-
prostata har lignende størrelsesfordeling i forhold til de fra
CD166
+/-
prostata epitel (data ikke vist). Tilsvarende FACS analyse viste at tap av CD166 ikke påvirker LSC
hi innhold av prostata isolert fra
CD166
– /-
mus (figur 5C), noe som tyder på at CD166 ikke spiller en viktig rolle i normal prostata utvikling eller prostata stammen /progenitor antall og funksjon.
Genetisk Sletting av
CD166
blokkerer ikke prostate Cancer Progresjon
Det har blitt hevdet at CD166 funksjoner som en celleoverflate-sensor for celletetthet og styrer overgangen mellom lokal celleproliferasjon og vev invasjon i løpet av melanom progresjon [36]. For å undersøke om CD166 spiller en avgjørende rolle i prostatakreft utvikling, spesielt i svulsten initiere celler, vi krysset
CD166
– /-
mus med
PTEN
betinget knockout mus [17 ]. Histopatologiske analyse indikerte at tap av CD166 ikke vesentlig endrer kinetikken av prostatakreft utvikling i
PTEN
null modell og alle
Pb-Cre
+; PTEN
L /L; CD166
– /-
musene adenokarsinom rundt 9 ukers alder (Figur 6A og data ikke vist). Vi observerte lignende nivåer av Ki67
+ celler mellom
Pb-Cre
+, PTEN
L /L, CD166
+ /+ og Pb-Cre
+; PTEN
L /L; CD166
– /-
prostata (Figur 6A). SMA flekker også vist at tap av CD166 ikke blokkerer prostatakreftceller fra lokal utbredelse (figur 6A, høyre panel).
(A) Evaluering av
CD166
sletting på prostatakreft progresjon (HE flekker, skala bar: 200 mikrometer), celleproliferasjon (Ki67 flekker, skala bar: 100 mikrometer), og prostata tumorinvasjon (SMA flekker, skala bar: 100 mikrometer) ved å sammenligne alder matchet
Pb-Cre
+ , PTEN
L /L, CD166
+ /+ Hotell og
Pb-Cre
+, PTEN
L /L, CD166
– /- prostata vev ved 20 ukers alder. (B) Sammenligning av sfære formasjon fra total usorterte prostataceller (5000 per 12-brønn) mellom
Pb-Cre
+, PTEN
L /L, CD166
+/- Hotell og
Pb-Cre
+, PTEN
L /L, CD166
– /-
prostata (9 uker gamle). (C) En representant FACS blot viser LSC innhold mellom
Pb-Cre +, PTEN
L /L, CD166
+/- Hotell og
Pb-Cre
+, PTEN
L /L, CD166
– /-
. (D) Undersøkelse av protein nivåer av CD166, P-AKT og GFP blant annet prostatavevet med angitte genotype ved Western blotting. GADPH inngår som en likeverdig lasting kontroll
Vi deretter sammenlignet sfæren dannelse mellom
Pb-Cre
+;. PTEN
L /L; CD166
+/- Hotell og
Pb-Cre
+; PTEN
L /L; CD166
– /-
prostata og funnet ut at tap av CD166 ikke forstyrrer med sfære dannende aktivitet av
PTEN
null epitel (figur 6B). Videre
CD166
– /-
prostata har lignende LSC
hi innhold i forhold til
CD166
+/- PTEN
null prostata (figur 6C). Siden PI3K /AKT sti Aktivering er en pådriver for celledeling og prostatakreft progresjon i
Pb-Cre
+; PTEN
L /L
prostatakreft [17], [20], vi deretter undersøkt om det er noen endring av AKT aktivering etter genetisk sletting av
CD166
. Western blot analyse viste at
Pb-Cre
+; PTEN
L /L; CD166
– /-
prostata har ingen CD166 uttrykk, men har lignende P-AKT nivåer sammenlignet med
Pb-Cre
+; PTEN
L /L; CD166
+ /+ Hotell og
Pb-Cre
+; PTEN
L /L; CD166
+/-
prostata (figur 6D). Vi ytterligere bekreftet at det ikke er noen negativ seleksjon mot
PTEN
– /-; CD166
– /-
celler siden lik intensitet av Knockin-GFP protein kan påvises i alle kohorter unntatt
CD166
+ /+
mus.
Siden vi se betydelig overekspresjon av CD166 i menneskelige CRPC prøver, ved siden undersøkte vi om CD166 ville påvirke utviklingen av CRPC i
PTEN
null prostatakreft modell.
Pb-Cre
+; PTEN
L /L; CD166
+/- Hotell og
Pb-Cre
+; PTEN
L /L; CD166
– /-
hanner ble kastrert på 12 uker og prostata ble isolert 8 uker senere. Som vist i figur 7, tillater delesjon av CD166 ikke i betydelig grad påvirker dannelsen av CRPC, som gjenspeiles av lignende pathohistology (figur 7A), CK5 /CK8 markør fordeling, BrdU puls merking og SMA farging i begge gruppene (figur 7B). Tatt sammen, vår genetiske studier indikerer at CD166 har begrenset iboende funksjon i prostata, selv i svulsten initiering av cellene.
Pb-Cre
+, PTEN
L /L, CD166
+/- Hotell og
Pb-Cre
+, PTEN
L /L, CD166
– /- mus ble kastrert i en alder av 12 uker med standard teknikker. Ved 8 uker etter kastrering ble mus intraperitonealt injisert med en enkelt dose på 100 ul (1 mg) BrdU-løsning og avlivet 4 timer senere for analyse. Evaluering av effektene av
CD166
sletting på (A) kastrering resistent prostatakreft progresjon (HE), og (B) celle avstamning sammensetning (CK5 /CK8), celleproliferasjon (BrdU) og prostata tumorinvasjon (SMA ) Var fremført. Skala:. 50 mikrometer
Diskusjoner
Få overflatemarkører er for tiden tilgjengelig for berikende både murine og humane prostata vev stilk /stamceller og for å identifisere prostatakreft initiere celler. Ved å søke etter disse celleoverflatemolekyler som er oppregulert i kastrert murine prostata og kastreringsresistent prostatakreft (CRPC) av mus og menneskets opprinnelse, identifiserte vi CD166 som en overflate markør for berikende både murine og humane prostata vev stilk /stamceller basert på
in vitro
sfære forming og
in vivo
vev gjenfødelse analyser. Viktigere, oppregulert CD166 uttrykk og utvidelse av CD166
hi celler korrelerer med
PTEN
null CRPC progresjon, samt menneskelig CRPC utvikling, selv om genetisk sletting av
CD166
ikke forstyrrer normal murine prostata utvikling eller
PTEN
null prostatakreft progresjon. Sammen vår studie antyder CD166 kan brukes som en potensiell overflate markør for å identifisere kastreringsresistent tumor celler for målrettet levering av legemidler.
CD166 uttrykk har blitt foreslått som en prognostisk markør for flere kreftformer, herunder brystkreft [37], prostata [38], eggstokk [39], bukspyttkjertel [40], tykktarm [41], oral cancer [42], melanom [36] og gastrisk kreft [43]. Viktigere, vår microarray og TMA studier viser foreningen av økt CD166 uttrykk med menneskelig prostata kreft metastasering og CRPC utvikling. Videre innenfor både mus og menneske prostata, viser vi at CD166-høy uttrykke undergruppe omfatter prostata stilk /progenitor og kreft initiere celler.
For å undersøke menneskelige prostata vev stilk /stamcelleegenskaper, evaluert vi voksent menneske prostata epitelet dissosiert fra godartet prostata, snarere enn cellelinjer og xenotransplantater. Fordelen med denne fremgangsmåte er å opprettholde den opprinnelige heterogeniteten i humane prostata prøver ved å unngå virkningen av langtids
in vitro
valg. Det synes imidlertid å være større variabilitet blant pasientprøver i vev regenerering analyser. Dette kan være på grunn av forskjellen i prøven variabilitet (dvs. iskemi tid forut for behandling vev og celle gjenfinning), individuell variasjon i CD166 uttrykk, og tekniske utfordringer knyttet til vevet restitusjon analyser ved anvendelse av humane prostataceller. Derfor er analyse av tilstrekkelig pasientprøver nødvendig for å trekke en gyldig konklusjon. I denne studien ble 6 humane prøver utnyttes til
in vitro
sfære forming og ytterligere 6 prøver ble brukt for
in vivo
regenerering analyser. Ved hjelp av dette systemet, har vi tidligere definert TROP2
hi; CD49f
hi som en kreft initiere celle (celle opprinnelsesland) for human prostatakreft [13]. Skala: 50 mikrometer.
