Abstract
Bakgrunn
I denne pionerstudie for å den biologiske aktivitet av organometallisk forbindelse Jern (III) -salophene (Fe-SP) de spesifikke effektene av Fe-SP på levedyktighet, morfologi, proliferasjon, og cellesyklusprogresjon på platinaresistent kreft ovarie cellelinjer ble undersøkt.
metodikk /hovedfunnene
Fe-SP vises selektiv cytotoksisitet mot Skov-3 og OVCAR-3 (eggstokkene epiteliale adenokarsinom) cellelinjer ved konsentrasjoner mellom 100 nM og 1 mikrometer, mens levedyktigheten til HeLa-celler ( epitel cervix adenokarsinom) eller primære lunge eller hud fibroblaster ble ikke påvirket. Skov-3 celler i motsetning til fibroblaster etter behandling med Fe-SP avdekket åpenbare kjennetegnene ved apoptose inkludert tett farget atom granulære organer innen fragmenterte kjerner, svært kondensert kromatin og kromatin fragmentering. Fe-SP behandling førte til aktivering av markører for
extrinsic plakater (caspase-8) og
iboende plakater (caspase-9) sti av apoptose så vel som bøddel Caspase-3 mens PARP -1 ble deaktivert. Fe-SP utøves effekter som et anti-proliferativ middel med en IC
50 verdi på 300 nM og forårsaket forsinket progresjon av celler gjennom S-fasen fasen av cellesyklus resulterer i et komplett S-fase arrest. Når intra-peritonealt brukt til rotter Fe-SP ikke viste noen systemisk toksisitet ved konsentrasjoner som i innledende forsøk ble bestemt til å være kjemoterapeutiske relevante doser i en rotte eggstokkreft celle modell.
Konklusjon /Betydning
Denne rapporten antyder at Fe-SP er en potent vekst-undertrykke middel
in vitro
for cellelinjer avledet fra eggstokkreft og en potensiell terapeutisk legemiddel for å behandle slike svulster
in vivo
.
Citation: Lange TS, Kim KK, Singh RK, Strongin RM, McCourt CK, Brard L (2008) Iron (III) -Salophene: en organometallforbindelse med Selektiv cytotoksiske og antiproliferative egenskaper i Platinum-Resistant eggstokkreft celler. PLoS ONE 3 (5): e2303. doi: 10,1371 /journal.pone.0002303
Redaktør: Anja-Katrin Bielinsky, University of Minnesota, USA
mottatt: 25 februar 2008; Godkjent: 11 april 2008; Publisert: 28. mai 2008
Copyright: © 2008 Lange et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Brown University Seed Grant og en NICHD, K12 HD043447 BIRCWH Scholar Grant Dr. Brard
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mineraler og metaller har vært ansatt i ulike former for medisinsk behandling i flere tusen år. I det gamle Egypt og Hellas, i ayurvedisk medisin, asiatisk medisin, eller av aztekerne metaller i elementær form, som salter eller som farmasøytisk aktive forbindelser fra planter ble brukt hovedsakelig på grunn av anti-inflammatorisk virkning knyttet til programmet [1], [2 ]. Metaller funnet sin vekkelse i farmakologiske tiltak under renessansen [2], men ofte med giftige bivirkninger på grunn av heavy metal bruk. Den tidligste rapport om terapeutisk bruk av metaller eller metallholdige forbindelser ikke bare som før i betente forhold, men i kreft og leukemi dateres tilbake til det sekstende århundre [3], [4]. Flere nyere vurderinger har beskrevet hva som kjennetegner ulike metallforbindelser og deres bruk og /eller antatte virknings i moderne kreftbehandling i pre-kliniske og kliniske studier [4], [5], [6].
den nåværende behandling av en rekke forskjellige tumorer, inkludert kreft i eggstokkene, avhengig av organometalliske platinaforbindelser. I USA, er ovarialcancer (EOC) den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer og den fjerde vanligste årsaken til dødsfall på grunn av kreft blant kvinner [7]. Anslagsvis to og tyve tusen nye tilfeller og anslagsvis femten-tusen dødsfall sekundære til eggstokkreft skjedde i år 2007 [8]. Selv om de fleste pasientene i utgangspunktet svare på cytoreduserende kirurgi og adjuvant paclitaxel og platinabasert kjemoterapi, vil de fleste oppleve tilbakefall av sykdommen. Mens re-behandling med en platina-basert medikament er mulig for noen kvinner svarprosenten til dagens andrelinje kjemoterapi er 15-30% på grunn av økningen av motstand mot slike legemidler som krever utvikling av nye medikamenter for å behandle slike svulster [6] [9].
design av nye metallbaserte legemidler er ofte utfordret av fysio-kjemiske egenskaper som utilstrekkelig løselighet eller hydrolytiske ustabilitet som gjør det problematisk å kontrollere sin levering, stabilitet og til slutt deres spesifikke effekter
in vivo
. En fremgangsmåte for å styre cytotoksiske responser av nye metallbaserte forbindelser som er å drive biologisk viktige overgangsmetaller, for eksempel jern (Fe), mangan (Mn), sink (Zn), kobber (Cu), eller kobolt (Co) av forskjellig oksidative stater og deres reaktive mellomprodukter [4], [5]. Denne rapporten beskriver de selektive cytotoksiske effektene av en roman organometallisk kompleks (Iron (III) -salophene Fig. 1A). På platinum-resistent eggstokkreft celler
(A) Syntese av salophene ligand (SP; fra 1,2-fenylendiamin og o-vanillin) og Iron (III) -salophene kompleks (Fe-SP) (se Materialer og metoder). (B) Strukturell karakterisering av Fe-SP ved røntgenkrystallografi (se tabell 1)
Salophenes representerer en klasse av organiske forbindelser som er definert ved to Schiff s-baser som forbinder tre aromatiske grupper. De to ytre aromatiske deler vanligvis har salisaldehydes og den sentrale aromatiske gruppen en
o
fenylen-diamin eller analog. Salophenes vise potent binding med overgangsmetallelementer og er nært knyttet til Salens inneholder Schiffs baser som er konstituert av alifatiske diaminer. Metallosalens falle inn i et antall ikke-platinametallforbindelser, slik som thiosemicarbazone eller hydrazon pharmacophores med mulige anticancer aktivitet [4], [10]. Metallosalophenes har ikke blitt studert med hensyn til applikasjoner i biologiske systemer: tidligere salophene-lantanid-komplekser ble beskrevet for å selektivt bindes til nøytrale sukkere og lipider, inkludert lysofosfatidisk syre, som tjener som en markør for en rekke patologiske tilstander, inkludert eggstokk-kreft [11] og Mn -salophene (EUK178) samt ulike Mn-Salens skjerm CYTO-beskyttende funksjoner i fibroblast kulturer via hydrogen peroxide scavenging [12]. En beslektet forbindelse (kobolt-3,4-diarylsalen) har vist seg å redusere levedyktigheten av forskjellige kreftcellelinjer ved ganske høye konsentrasjoner (≥20 um), og det ble foreslått at den virke aktiviteten ikke var knyttet til oksydativ DNA-skade [ ,,,0],1. 3]. Basert på denne rapporten og videre studier på de selektive cytotoksiske effektene av salophenes når kompleks med overgangsmetaller, ble et patent arkivert. Denne oppfinnelse består av syntesen, biologiske evalueringer, anvendelser og farmasøytiske preparater av metall salophenes (MSPs). Videre omfatter foreliggende oppfinnelse bruk av MSPs som legemidler med terapeutisk anti-neoplastisk, anti-angiogene og anti-kreft-aktivitet, og med andre egenskaper, slik som frie radikaler, dvs. I tillegg gir denne oppfinnelsen metoder som skal anvendes i chemoprevention kjemisk kreftutvikling og endringer av legemiddelmetabolisme involverer epoksider eller frie oksygenradikaler eller mellomprodukter.
Formålet med denne studien var å undersøke potensialet i Fe- SP som et biologisk aktivt legemiddel i en ovarial cancer-celle-modell med hensyn til dose-avhengige og spesifikke virkninger på levedyktighet, morfologi, proliferasjon, og cellesyklusprogresjon. I tillegg til å beskrive den selektive cytotoksisitet av Fe-SP på platinaresistent eggstokkkreftceller gjennomførte vi en studie på den systemiske toksisitet av Fe-SP når de påføres i rotter som et modellsystem. Den foreliggende rapport tyder på at denne nye organometalliske forbindelse viser egenskaper som en potensiell terapeutisk legemiddel og et alternativ til platina reagenser for behandling av eggstokkreft.
Resultater
spesifikk cytotoksisk effekt av Fe-SP videre menneskelige platina-resistent eggstokkreft kreftcellelinjer
i en første tilnærming til å analysere virkningene av Iron (III) -salophene (Fe-SP) på eggstokkreft celler vi har utført en levedyktighet analysen ansette Skov-3 og OVCAR- 3 (human platina-resistente ovarie epiteliale adenokarsinom) cellelinjer i forhold til HeLa (cervix epitelial adenokarsinom) eller primær lunge (LF) eller hudfibroblaster (BJ) (passasjer 10-13). Cellene ble behandlet i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner (0,1-3 uM) med enten Fe-SP eller ikke-kompleks salophene (SP) som en ytterligere kontroll med ubehandlede celler. Behandling med SP påvirket ikke levedyktigheten til en hvilken som helst av disse cellelinjer i området fra 100 nM til 3 uM (fig 2) eller ved konsentrasjoner så høye som 60 uM (upubliserte data). Fe-SP, ved konsentrasjoner ≥3 uM, som utøves sterkt cytotoksiske effekter på alle cellelinjene. Bemerkelsesverdig, responsen av disse cellene til Fe-SP var ikke bare doseavhengig, men ved konsentrasjoner under 3 um celletype spesifikk (fig. 2). Mens Fe-SP i konsentrasjoner mellom 300 nM og 1 pM viste seg å være svært cytotoksisk til SKOV-3 og OVCAR-3-celler, behandling av HeLa-celler eller primære fibroblaster med 1 mM Fe-SP resulterte ikke i noen endring av levedyktighet. Således viser Fe-SP, avhengig av den cellelinjen som behandles, selektiv cytotoksisitet, med en doseavhengig respons er vist her i to platinaresistent kreft ovarie cellelinjer.
Cytotoksisiteten av Fe-SP på human ovariecancer celler (SKOV-3, OVCAR-3) ble sammenlignet med effekten på HeLa-celler eller primære fibroblaster ved passasjene 11 til 13 (LF1, human lunge; BJ, human forhud). Cellene ble behandlet i totalt 24 timer med forskjellige konsentrasjoner (0,1-3 uM) av Fe-SP eller ikke-kompleks SP (Ctr). MTS levedyktighet analysen ble utført som beskrevet (Materialer og metoder). Eksperimenter ble utført in triplo; Dataene er uttrykt som gjennomsnittet av målinger in triplo (X ± SD) av et representativt eksperiment i% celleviabilitet av ubehandlede celler [= 100%].
Selektive morfologiske endringer og induksjon av apoptose i SKOV -3 eggstokkreft celler etter Fe-SP behandling
for å analysere morfologiske endringer av Skov-3 eggstokkreft celler og primære fibroblaster (BJ) på Fe-SP behandlingen vi gjennomført lys- og fluorescens mikroskopi etter fiksering av celler og farging av kjernefysisk kromatin med DAPI. Populasjonen av ubehandlede SKOV-3 eller celler behandlet med 2 uM av ikke-kompleks SP i 24 timer viste en homogen morfologi med kjerner lett og jevnt farget med DAPI (Fig. 3A) og sporadiske skinn av delende celler i mitose (lys blå farving kromosomer stilt opp langs metafase plate, ikke vist her). I kontrast, etter behandling med 2 mikrometer Fe-SP flertallet av Skov-3 celler vises krymping, svært kondensert kromatin, og ofte tett farget atom granulære organer ( «apoptotiske legemer») innen fragmenterte kjerner, (Fig. 3A). Primære fibroblaster behandlet med Fe-SP eller SP ved samme konsentrasjon viste ingen større endringer i morfologien og heller ikke åpenbare kjennetegn på apoptose som viser selektiv reaksjon av eggstokkreft cellelinje undersøkt for å Fe-SP.
Ovarian kreftcellene (SKOV-3) eller primære fibroblaster (BJ) ble behandlet i 24 timer med Fe-SP eller ikke-kompleks SP (Ctr.) ved en konsentrasjon på 2 uM før mikroskopisk analyse ved fasekontrast (PC) eller fluorescens-analyse etter kromatin farging (DAPI) som beskrevet (Materialer og metoder). Bilder hentet fra et representativt eksperiment vises. Bar = 10 mikrometer. (B) Analyse av DNA-fragmentering i en TUNEL-analysen. SKOV-3-celler ble behandlet med Fe-SP (0, 0,7, 2 mM) i 24 timer. En TUNEL-analysen ble utført ved ko-farging med fluorescein-12-dUTP (merking av DNA hakk i apoptotiske celler) og av kromatin med propidiumjodid (Materialer og metoder). Co-farging av ubehandlede Skov-3 celler før fiksering og permeabilization tjente som negativ kontroll (sett topplaten). Under fluorescerende mikroskopi, representative bildene ble tatt, apoptotisk flekk (grønn) og kjernekraft flekk (rød) kledde. Tunel positive kjerner på grunn av DNA-fragmentering vises som gule områder. Bar = 10 mikrometer. (C) Western blot-analyse av caspase aktivering. SKOV-3-celler ble behandlet med Fe-SP (0, 1,25 uM, 2,5 uM) i 24 timer. PAGE og Western blot analyse av cellelysatene ble utført. Aktivert Caspase-3, -8, -9 og inaktivert PARP-1, ble visualisert ved hjelp av immunoblotting ved å bruke primære antistoffer utelukkende erkjenner spaltede fragmenter, ikke full lengde pro-formene, til disse proteinene i kombinasjon med et kjemiluminescens påvisningssystem som beskrevet i (Materials og metoder). Et representativt forsøk er vist. Som en indre standard for lik belastning (50 ug totalcelleprotein /kjørefelt) Blottene ble probet med et anti-β-aktin-antistoff.
En vanlig metode for påvisning av DNA-fragmentering i lys av cellulær apoptose hendelser er en TUNEL analysen, som vi ansatt etter behandling av Skov-3 med Fe-SP. Analysen baserer seg på tilstedeværelsen av kutt i DNA av apoptotiske og nekrotiske enkelte celler, som kan identifiseres ved terminal transferase som vil katalysere tilsetning av merket dUTP (her: fluorescein). SKOV-3-celler ble behandlet med enten 0,7 eller 2 uM Fe-SP i 24 timer. Å identifisere cellekjerner, kontra med propidiumjodid (Pi), som skytes inn i DNA, ble gjennomført. TUNEL-positive kjerner ble identifisert av gule flekker som skyldes en overlapping av bildet med apoptotisk flekk (FL-dUTP) og kjernekraft flekk (Pi). Som vist (fig. 3B) ingen celler før behandling (øvre panel), 60% av populasjonen av celler behandlet med 0,7 um (midtre panel), og alle celler på 2 uM Fe-SP (nedre panel) ble TUNEL-positive celler som indikerer fragmentert DNA.
for å definere den cellulære responsen til SKOV-3-celler etter Fe-SP behandling vi analyserte aktivering av kaspaser karakteristisk for induksjon av apoptose samt inaktivering av PARP-1 ved immunblotting. Behandling av SKOV-3-celler med 2,5 mM Fe-SP for 24 timer resulterte i sterk aktivering /spalting av caspase-9, -8, og -3, mens PARP-1 var inaktivert /spaltet etter medikamentbehandling (fig. 3C). Behandling med 1,25 mM Fe-SP avslørte et lignende resultat, med noen aktivering av kaspase-9, og -3, og inaktivering av PARP-1 mens aktiveringen av caspase-8 var like sterk som observeres i 2,5 uM Fe-SP. Angivelig, utbruddet av caspaseaktivering og PARP-1 inaktivering i Skov-3 eggstokkreft celler av Fe-SP resulterte i de morfologiske kjennetegnene ved apoptose observert (fig. 3A).
Anti-proliferativ effekt og cellesyklus arrest etter behandling av Skov-3 eggstokkreft celler med Fe-SP
som beskrevet i forrige avsnitt Fe-SP er en selektiv cellegift (fig. 2) som aktiverer apoptotiske prosesser (fig. 3) i SKOV -3 eggstokkreft celler. For å undersøke om Fe-SP utøver anti-proliferative effekter og forstyrrelser av cellesyklusprogresjon vi utført en BrdU-inkorporering assay. Fe-SP behandling i 24 timer doseavhengig redusert celleproliferasjon (fig. 4) med en IC
50 verdi på 300 nM. I motsetning til dette ble ikke-komplekserte SP ikke redusere SKOV-3 spredning i betydelig grad, selv ved konsentrasjoner på 3 uM. Ved sub-cytotoksiske medikament konsentrasjon på 100 nM Fe-SP (se levedyktighet, figur 2) ble BrdU-inkorporering i DNA redusert med 40% (Fig. 4).
eggstokk-kreft-celler (SKOV-3) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0,1-10 uM) av Fe-SP eller ikke-kompleks SP (Ctr.) i 24 timer. En kolorimetrisk analyse (basert på BrdU-inkorporering detektert av en BrdU-antistoff-konjugat) ble utført som beskrevet (materialer og metoder). Fargeintensiteten ved 450 nM korrelerer direkte med mengden av BrdU innlemmet i DNA, som i sin tur representerer spredning. Eksperimenter ble utført in triplo; Dataene er uttrykt som gjennomsnittet av målinger in triplo (X ± SD) i% av absorpsjonen av triplikate prøver av ubehandlede celler [= 100%].
I tillegg til den celleproliferasjonsanalyse, celle- syklus analyse av propidiumjodid- farget Skov-3 celler ved flowcytometri ble gjennomført. Fe-SP, i motsetning til den ikke-kompleksforbindelsen, viste en økning i antallet av sub-diploidal /2n-celler (sub-G0 /G1, fig. 5a) i en tids- og doseavhengig måte (tabell 1) . Med hensyn til sykkel celler, fører Fe-SP en tids- og doseavhengig arrest av SKOV-3 i S-fase, og således en reduksjon av celler i G0 /G1 fase: Ubehandlede celler eller SKOV-3 behandles med ikke- -complexed SP i denne ikke-synkrone befolkningen mens dyrket
in vitro
er ~71-75% i G0 /G1 og ~21-24% i S-fasen (fig. 5B, tabell 1). Behandling med Fe-SP ved økende konsentrasjoner (0,4, 0,8, 1,6 pM) i 24 eller 48 timer forårsaket en økning av celler i S-fase med en topp på 75% (1,6 uM /24 timer) og 87% (1,6 uM /48 h ) av den totale befolkningen (fig. 5B, tabell 1). Følgelig er antallet celler i G0 /G1 avtar til 25% (1,6 uM /24 timer) og 13% (1,6 uM /48 h) av den totale populasjonen, mens på dette Fe-SP-konsentrasjonen uten flere celler i G2 /M kan påvises. Ved en konsentrasjon på 0,8 uM Fe-SP i 24 timer og 48 timer en økning av celler i G2 /M (23% /24 h, 16% /48 h) over grunnivået (3% /24 timer, 9% /48 h) kan observeres som indikerer en forsinkelse av denne fasen sammen med en utvikling av arrestasjonen av celler i S-fase.
eggstokkreft celler (Skov-3) ble behandlet med 0, 0,4, 0,8 og 1,6 mikrometer Fe-SP eller SP (Ctr.) for 24 eller 48 timer. Cellesyklusanalyse ved FACS basert på propidium-jodid innskyting i det cellulære kromatin ble utført som beskrevet (materialer og metoder). Data er presentert som (A) relativ fluorescens intensitet i en to-dimensjonal FACS-profil (ModFit LT programvare; svarte linjer = datalinje og modell tilpasset linje av hele populasjonen; skraverte områdene = modellkomponenter /subpopulasjoner av G0 /G1, S, G2 /M, apoptotiske celler), eksempel er vist i 48 timer behandling med 0,8 uM forbindelse, eller som (B) omfattende søylediagram av alle data. Standardiserte gating ble anvendt for alle prøver. Ti tusen hendelsene ble analysert for hver prøve.
Cytotoksisitet av Fe-SP i rotter som et modellsystem
For å undersøke om Fe-SP forårsaker systemisk toksisitet
in vivo
vi valgte rotter som modellsystem. I innledende det kjemoterapeutiske relevante doser av Fe-SP i en dyrecelle kreft i eggstokkene modell ble bestemt til å være ≤1 mg /kg kroppsvekt (Lange et al., Under forberedelse). I disse prøve studiene rotteeggstokkkreftceller (Nutu-19) var intra-peritonealt (IP) injisert i rotter og 3 uker etter utvikling av tumorer (for å etterligne den situasjonen etter cytoreduktiv kirurgi) Dyrene ble behandlet daglig med Fe-SP via IP-injeksjoner . Varighet av behandling varte i 12 dager, og var basert på tumorbyrde hos kontrolldyrene. Dyrene ble overvåket for ubehag og smerte per IACUC protokoller. Mens kontrolldyrene viste et konsistent høyt mengde av hemoragisk ascites, er Fe-SP (1 mg /mL) behandlede dyr viste betydelig mindre hemoragisk ascites volum, og mindre omental tumorvekt. Videre i denne foreløpige behandling rettssaken, observerte vi en komplett respons i 40% av behandlede dyr (10 rotter behandlet).
Derfor gjennomførte vi 28-dagers kronisk toksisitetsstudier (OECDs retningslinjer for testing av kjemikalier (§-4, nr-407)) i albinorotter med Fe-SP konsentrasjoner i området fra 0,25 mg /kg til 4 mg /kg kroppsvekt. Denne studien var designet for å undersøke de toksikologiske effektene av gjentatt IP administrasjon av Fe-SP (i DMSO: destillert vann i forholdet 1:04 på 5 dager /uke i en periode på 28 dager). Dyr i en lav dose (0,25 mg /kg kroppsvekt), middels dose (1,0 mg /kg kroppsvekt), og høy dose (4,0 mg /kg kroppsvekt) viste ingen patologiske forandringer sammenlignet med kontroll gruppe av dyr. Ingen dødelighet eller toksiske symptomer ble observert i test- og kontrollgrupper av dyr unntatt ruffled pels i gruppen med høy dose. Ingen signifikante forskjeller ble observert i kroppsvekt /tap mønster, organvekt, hematologiske eller biokjemiske parametere (se Materialer og Metoder) av alle testgruppene sammenlignet med kontrollgruppen. Alle parametre falt innenfor de aksepterte grensene for normale variasjoner for albinorotter. Mikroskopisk undersøkelse av histopatologiske lysbilder fra de lave, middels og høye dosegruppene viste ingen signifikante endringer bortsett fra mild degenerasjon av hepatocytter i tre dyr (ved høye doser) og lunge mononukleære celler infiltrerer i to dyr (høy dose).
diskusjon
En lav 5-års total overlevelse på bare 53% for kvinne som lider av ovarial cancer er knyttet til utvikling av resistens av tumorceller til standard kjemoterapeutiske midler, særlig platina analoger og dermed nye anti-kreft medikamenter må utvikles [6], [7], [8]. For den foreliggende rapport valgte vi å studere mulighetene for en ny organometalliske komplekset, jern (III) -salophene (Fe-SP) som en kandidat middel for behandling av eggstokkreft. I forbindelse med avklaring, er det nevnt at begrepet salophene, mer enn et århundre siden, har blitt brukt til 4-acetamidofenyl salicylat, et analgetikum, og febernedsettende medikament produsert siden tidlig på 1900-tallet av Bayer farmasøytiske produkter (Leverkusen, Tyskland) [14 ] og er ikke relatert til «Salophen» oppdaget som en superoksid gatefeier i E. coli når kompleks med mangan (III) [15] som ligner organometallforbindelsen studert i denne rapporten.
til dags dato ingen forskning på de spesifikke effekter av salophenes på levedyktigheten av kreftceller har blitt publisert. I en tidligere studie av de cytotoksiske effektene av bicykliske aryl thiazolines på forskjellige humane kreftcellelinjer, vi kommet frem til området for kolorimetrisk celle-levedyktighet test som benyttes ved anvendelse av jern (III) -salophene (ikke relatert til thiazolines) ved 60 uM som en negativ kontroll [16]. Påfølgende sammenlignende studier på effekten av overgangsmetall salophenes (Zn (II) -, Mn (II) -, Cu (II) -, Co (III), Fe (III) -SP) og ikke-kompleksert salophene (SP) ved lavere konsentrasjoner viste at under en konsentrasjon på 10 uM bare Fe (III) -SP viste signifikante cytotoksiske effekter i forskjellige kreftcellelinjer (Lange et al., under forberedelse). For å teste den selektive cytotoksiske potensialet i Fe-SP på eggstokkreft celler, vi valgte to cellelinjer som er multiresistent sammen med primær lunge eller hud fibroblaster cellelinjer. OVCAR-3-celler (ovarie epitelial adenokarsinom) er resistente mot klinisk relevante konsentrasjoner av adriamycin, melfalan og cisplatin. SKOV-3-celler (eggstokk-adenokarsinom) er resistente overfor flere cytotoksiske medikamenter, inkludert Cisplatin og adriamycin (se ATCC, Manassas, VA, www.atcc.org). I likhet med disse to ovarian cancer-cellelinjer, kontrollcellene som brukes i den foreliggende rapport, primære fibroblast ved tidlige passasjer og HeLa-celler, inneha en høy metabolisme og vekst. Vi viser her at Fe-SP vises selektiv og doseavhengig cytotoksisitet mot SKOV-3 og OVCAR-3-celler ved konsentrasjoner mellom 100 nM og 1 pM, mens levedyktigheten av HeLa-celler (epitelial cervix adenokarsinom) eller primær lunge- eller hud- fibroblaster (ved passasjer 10-13) ved disse konsentrasjonene ble ikke påvirket. Den relative motstand av de tre kontrollcellelinjene til Fe-SP støttet ideen om å teste denne forbindelsen en
in vivo
eggstokkreft dyr kreft modell. Ikke-komplekserte salophene påvirket ikke levedyktigheten av enten cellelinje, selv ved konsentrasjoner opp til 60 uM, heller ikke 60 uM Fe (III) alene [ferriklorid tilsettes] eller ferriklorid i kombinasjon med ikke-kompleks salophene tilsatt til cellekulturen medier [Lange et al., i fremstillingen] indirekte bekrefter stabiliteten av komplekset og dermed spesifikk cytotoksisk effekt i henhold til celledyrkningsbetingelser.
Gitt den nåværende forskning på feltet metallorganiske forbindelser slik som salophenes eller Salens (relatert sammensatte, se innledningen), kan vi bare spekulere fra begrensede kilder om mulig mekanisme (r) av cytotoksiske virkningen av Fe-SP. Et bemerkelsesverdig trekk ved Salens, ennå ikke undersøkt for salophenes, er deres affinitet til en rekke aromatiske nøytrale molekyler slik som pyridin, pyridin-N-oksyd, isokinolin og benzylamin [17], [18]. Salens når kompleks med overgangsmetaller fungere som kunstige nukleaser. Deres reaktivitet i plasmid DNA-spaltningsseter assays kan kontrolleres ved konjugering eller ved typen og ladning av den sentrale kjerne metallionet [18], [19], [20]. For eksempel, Ni (II) – eller Mn (II) -salens ble funnet å effektivt indusere DNA-kjede spalting men ikke Cr (II) – eller Cu (II) – [18], [20], eller Fe (II) -salens hvis ikke ytterligere hydroksylgrupper lette deres oksydasjon til Cu (III) eller Fe (III) arter [21]. Det har blitt hevdet at Fe-Sälen i samarbeid med kinin-systemet muliggjør dannelsen av jern (III)
.O
2
– arter å produsere frie hydroksyradikaler ansvarlig for DNA cleavage [21]. Imidlertid, (III) -salen er DNA-spaltning aktivitet av Fe høyere enn for Fe (II) -salen som tyder på at den økede vann-oppløselighet, og ansvaret for Fe (III) -ionet er dominerende spaltningen potensialet av strukturen [22] som sannsynligvis gjelder jern (III) -salophene, så vel. I tillegg til forfatterne bundet DNA spaltning aktivitet av Fe (III) -salen
in vitro
til den observasjon at denne forbindelse førte atom fragmentering og induksjon av apoptose (via mitokondrie sti /cytokrom c frigivelse) i HEK293-celler ved en konsentrasjon på 50 uM [22].
Selv om mekanismen (e) av virkningen av Salens eller Fe-SP på celler i kultur eller
in vivo
gjenstår å undersøkes, selektiv morfologisk endringer i kreftcellelinjer og induksjon av apoptose etter medikamentell behandling
in vitro
er en første indikator for potensielle selektive effekter på tumormetastase og cellefysiologi
in vivo
. Denne studien viser at Fe-SP ved konsentrasjoner på 2 mikrometer i Skov-3 eggstokkreft celler, men ikke i grunnskolen fibroblaster forårsaket atom fragmentering, kromatin kondens, fragmentering DNA som er alle klassiske kjennetegnene ved apoptose [23]. Western blotting bekreftet aktivering av effektor caspase-3 og inaktivering av PARP-1 (som er involvert i DNA-reparasjon) [24] under utførelsen av apoptose i SKOV-3-celler etter Fe-SP behandling. Videre ble det tydelig at Fe-SP indusert både store signalveier (
intrinsik, ekstrinsik
) er beskrevet for programmert celledød [25], [26]. Vi observerte sterk spalting /aktivering av initiator caspase-8, typisk for involvering av
extrinsic
apoptotiske sti [27], [28], på Fe-SP behandling av Skov-3 celler.
iboende
vei formidler apoptotiske responser på stress-signaler som narkotika, DNA-skade eller vekstfaktor deprivasjon og er initiert av mitokondrieskade. Det resulterer i den mitokondrielle frigjøring av cytokrom C som aktiverer initiatoren caspase-9 [28], [29], og ble vist å bidra til celledød av HEK293 (human nyrecellelinje) på Fe (III) -salen behandling [22] og også i den foreliggende undersøkelse for SKOV-3-celler på Fe (III) -salophene behandling. Til dags dato har ingen andre studier som beskriver morfologi eller apoptotiske signal av eventuelle cellelinjer etter behandling med forbindelser som tilhører klassen av jern Salens eller -salophenes blitt publisert.
På samme måte, ingen publikasjoner som undersøker endring i celle syklusprogresjon etter behandling med enten et salen eller salophene metallocomplex eksisterer. Mens en publikasjon observert en forandring i levedyktigheten og morfologi av hud-fibroblaster i kultur etter behandling med et Cr (III) -salen komplekset ved høye konsentrasjoner på 50 uM, ble de følgende cellesyklus studier gjennomføres kun med et etylendiamin-Cr (III) – kloridet av høyere cytotoksisitet [30]. Vi viser her at Fe-SP doseavhengig redusert spredning av Skov-3 eggstokkreft celler (IC
50 300 nM). Selv på de sub-cytotoksiske konsentrasjoner (100 nM Fe-SP) BrdU-inkorporering i DNA ble redusert som tyder på at Fe-SP utøver effekter som en anti-proliferativ og dermed et potensielt anti-cancermiddel. Ekstra celle-syklusanalyse av SKOV-3 etter Fe-SP behandling, som allerede indikert i det TUNEL-analysen, viste en økning i sub-populasjon diploidal som representerer celler med betydelig DNA-skade, noe som indikerer et sent stadium apoptotiske. Med hensyn til sykkel cellene, Fe-SP på 1,6 pM forårsaket en fullstendig arrest av SKOV-3 i S-fase sammen med reduksjon av celler i G0 /G1 og et totalt tap av celler i G2 /M. Tilsynelatende, Fe-SP behandling påvirket cellesykluskontrollpunkter i S-fase forårsaker en dose- og tidsavhengig reduksjon av cellesyklus-progresjon. Til dags dato, er dette den første rapporten om regulering av syklusen av eventuelle cellelinje ved behandling med enten metallosalen eller metallosalophene forbindelser. Videre er bare noen få data om virkningen av overgangsmetall-komplekser generelt på cellesyklus finnes, som for eksempel arrest av en neuroblastom-cellelinje i G1-fase når den behandles med et isatin-Schiff-base kobber (II) kompleks [31].
Selv om ikke målet med denne rapporten, kan videre studier analysere effektene av Fe-SP på celle-syklus sjekkpunkter i synkroniserte Skov-3 kulturer og annen kreft og ikke-transformerte cellelinjer. Målretting av slike kontrollposter er blitt foreslått som en alternativ tilnærming til anti-kreft terapier [32], [33]. Regulatorer av cellesyklus-maskiner er ofte endres i human kreft og tilsynelatende transformerte celler kan være mer følsomme for den cyklin-avhengige kinaser (CDK) hemming [34], [35]. Med hensyn til S-fase hendelser begge musemodeller og studier på kreft-avledede celler viste at akkumulering av cyklin D1 /CDK4 komplekser utløser DNA re-replikasjon [36], og således kan bli spesielt rettet i kreftceller. Som ett eksempel, Guggulsterone, en plante-avledet stoffet, forårsaket cellesyklusarrest i S-fasen ved undertrykkelse av cyclin D1 og cdc2 og økt cyklin-avhengig kinase inhibitor p21 og p27-ekspresjon i en rekke humane tumorcelletyper [ ,,,0],37]. Basert på den spesifikke arrestasjonen av Skov-3 celler ved Fe-SP i S-fase observert i denne studien, i fremtidige studier vil vi analysere virkningene av denne romanen organometallforbindelse og potensiell kreft terapeutiske på bestemt celle-syklus regulatorer (CDK-tallet, cykliner) og replikering-start og -progression signaler om S-fasen [38], [39] i platina-resistent eggstokkreft celler.
for å sette scenen for videre undersøkelser av Fe-SP som en potensiell
