Abstract
Formålet med denne studien var å fastslå den kliniske betydningen av junctional adhesjonsmolekyl A (JAM-A ) hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og den biologiske funksjonen til JAM-A hos NSCLC cellelinjer. Vi viste at JAM-A er overveiende uttrykt i cellemembraner og høy uttrykk for JAM-A skjedde i 37% av lungekreft vevsprøver sammenlignet med tilsvarende normale vev. Høy uttrykk for JAM-A var signifikant korrelert med TNM stadium (P = 0,021), lymfeknutemetastase (P = 0,007), og redusert total overlevelse (p = 0,02), I tillegg observerte vi at stanse JAM-A av små interfererende RNA hemmet tumorcelle-proliferasjon og indusert cellesyklus-stans ved G1 /S-grensen. Western blotting-analyse viste at knockdown av JAM-A redusert proteinnivå cyclin D1, CDK4, 6 og P-Rb. Dermed spiller JAM-A en viktig rolle i NSCLC progresjon
Citation. Zhang M, Luo W, Huang B, Liu Z, Sun L, Zhang Q, et al. (2013) Overuttrykte JAM-A i ikke-småcellet lungekreft korrelerer med tumorprogresjon. PLoS ONE 8 (11): e79173. doi: 10,1371 /journal.pone.0079173
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: May 30, 2013; Godkjent: 23 september 2013; Publisert: 12.11.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr 30972967) og forskningsfond for doktorgradsstudiet for Higher Education of China (No. 20092104110018). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
junctional adhesjonsmolekyl A (JAM-A) er en type jeg transmembrane glykoprotein som tilhører immunglobulin super. JAM-A er vidt fordelt i vev, inkludert placenta, lunge, lever, nyrer, bukspyttkjertel, hjerte, hjerne, tarm, og lymfeknuter [1], [2], [3], [4]. JAM-A uttrykkes hovedsakelig i intercellulære overganger av epiteliale og endoteliale celler, er JAM-A også funnet på overflaten av leukocytter, lymfocytter, blodplater, erytrocytter og [5], [6], [7], [8]. JAM-A er involvert i diverse cellulære prosesser, slik som celle-celle-adhesjon, leukocyttmigrering, blodplateaktivering, angiogenese, og reovirus binding [5], [9], [10], [11]. Den JAM-A-proteinet består av et ekstracellulært domene med to Ig-lignende sløyfer, en enkelt membran-dekkende område, og en kort cytoplasmatisk hale som ender i en PDZ-bindende motiv. JAM-A kan danne homodimerer gjennom denne N-terminal Ig loop. Homofilist samhandling er viktig for den nevnte JAM-En funksjon i celler [12]. Den C-terminale PDZ-bindende motiv kan lette interaksjoner med forskjellige stillas proteiner, slik som ZO-1, AF-6, og PAR-3 [13], [14], [15]. JAM-A dimerisering og PDZ bindende motiver er avgjørende for signalkaskade [16], [17]. Nylig har JAM-A vært innblandet i tumorprogresjon, men rollen JAM-A i tumorvekst og spredning er fortsatt en kontroversiell sak. Naik et al. [18] opprinnelig rapportert at JAM-A kan redusere invasjon og bevegelighet av brystkreft cellelinjer
in vitro Hotell og JAM-A uttrykk hos brystkreftpasienter var negativt assosiert med tumor aggressivitet og metastasering. Ligner clinical- eller
in vitro
dannede data ble rapportert av andre involverer livmorkreft [19] og bukspyttkjertelkreft [20]. Tvert imot, Mc Sherry et al. [21], bruke en større klinisk datasett, rapporterte en positiv korrelasjon mellom JAM-A uttrykk og invasiv brystkreft prognose. Tilsvarende større clinical-,
in vitro
– og
in vivo
dannede datasettene ble nylig rapportert i brystkreft og epidermoid carcinoma [22], [23], [24], [25], [26]. Uttrykket av JAM-A protein i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) vev og forholdet til ulike clinicopathologic faktorer har ikke blitt fullstendig undersøkt. Videre eksakte rolle JAM-A i lungekreft progresjon er uklart. Derfor bestemt vi JAM-A uttrykk hos NSCLC vev ved immunhistokjemi. I tillegg fant vi ut at sammenhengen mellom JAM-A uttrykk og spredning på flere NSCLC cellelinjer. Vi viste at JAM-A er uttrykt relativt høye beløp i NSCLC vev og noen typer NSCLC cellelinjer, og at cellemembran-tilknyttet JAM-A nivåer er korrelert med tumor aggressivitet.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble gjennomført med godkjenning av Institutional Review Board of China Medical University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle NSCLC pasienter og alle kliniske undersøkelser ble gjennomført i henhold til de prinsipper kunngjort i Helsinkideklarasjonen.
Pasienter og Prøvene
åttito NSCLC prøver ble innhentet fra først Affiliated Hospital of China Medical University mellom 2002 og 2009; 42 prøver gikk oppfølgingsstudier. Ingen av pasientene, radioterapi eller kjemoterapi før kirurgisk reseksjon. Den histologiske diagnose og grad av differensiering av svulstene ble definert ved evaluering av hematoxylin og seksjoner eosin-farget vev i henhold til Verdens helseorganisasjon retningslinjer for klassifisering. Alle 82 prøvene ble vurdert på nytt med hensyn til histologisk subtype, differensiering status, og tumorstadium. Plateepitelkarsinom og adenokarsinom ble identifisert i 36 og 46 av de 82 tilfellene, henholdsvis. Lymfeknutemetastaser ble observert hos 31 pasienter. Svulster ble inndelt i trinn I (n = 45), II (n = 30), og III (n = 17) i henhold til p-TNM staging system av International Union mot kreft (7. utgave). Total overlevelse ble definert som den perioden av tid fra første diagnose til død eller dato for siste oppfølging.
Cellelinjer og cellekultur betingelser
HBE, A549, H1299, H157, og H460-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SPC og LK2 cellelinjer ble kjøpt fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Science. Cellene ble dyrket i RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FBS; Invitrogen), 100 IU /ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO, USA), og 100 mg /ml streptomycin (Sigma). Cellene ble dyrket på sterile vev kultur retter og passert hver 2. dag bruker 0,25% trypsin (Invitrogen).
Immunohistochemistry Analyse
Kirurgisk-skåret vevsprøver ble fiksert med 10% nøytral formalin, forankret i parafin, og 4-mikrometer tykke seksjoner ble fremstilt. Farging ble utført ved hjelp av ElivisionTM pluss Polyer HRP (mus /kanin) IHC Kit (Maixin, Fuzhou, Kina). Seksjonene ble deparaffinized i xylen, rehydratisert i gradert alkohol serie, og kokt i 0,01 M EDTA-buffer (pH 9,0) i 20 minutter i en kjele. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved bruk av hydrogenperoksid (0,3%), som ble etterfulgt av inkubasjon med normalt geiteserum for å redusere ikke-spesifikk binding. Vevssnitt ble inkubert med JAM-A kanin monoklonalt antistoff (1:100 fortynning, Abcam, Cambridge, MA, USA). Kanin immunoglobulin, i samme konsentrasjon som den antigen-spesifikke antistoff (Maixin) ble anvendt som en negativ kontroll. Farging for alle primære antistoffer ble utført ved 4 ° C over natten. ElivisionTM pluss Polyer HRP ble brukt som det sekundære antistoff. Etter vasking, ble seksjonene inkubert med 3, 3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid å utvikle peroksidase-reaksjonen. Kontra av delene ble utført med hematoksylin, som så ble dehydrert i etanol før montering. To uavhengige etterforskere undersøkte alle kreft lysbilder tilfeldig. Fem visningene ble undersøkt per lysbilde, og 100 celler ble observert per view på 400X forstørrelse. Farging av JAM-A ble scoret etter en semi-kvantitativ skala ved å evaluere representative tumorområder; intensiteten og prosentandelen av cellemembranene hadde høyere immunofarging enn kontrollcellene. Membranfarging av tumorcellene ble ansett å være positiv farging. Intensiteten av JAM-A membraner farging ble også scoret som 0 (ingen flekker), en (svak), 2 (moderat), og 3 (høy). Prosent skår ble tildelt som følger: 1, 1% -10%; 2, 11% -50%; 3, 51% -80%; og 4, 81% -100% [20]. Poengene for hver tumorprøve ble multiplisert for å gi en endelig score på 0-12 og den totale uttrykk for JAM-A ble bestemt som lav (≤4) eller høy uttrykk ( 4).
kvantitativ real -time PCR (SYBR Grønn Method)
kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp SYBR Grønn PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) i et totalvolum på 20 ul på en 7900HT Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems) som følger: 95 ° C i 30 sekunder; 40 sykluser ved 95 ° C i 5 sekunder; og 60 ° C i 30 sekunder. En dissosiasjon trinn ble utført for å generere en smeltekurve for å bekrefte spesifisiteten til forsterkning. β-aktin ble benyttet som referanse-genet. De relative nivåer av genekspresjon var representert som ΔCt = Ct-gen-Ct referanse og den ganger endring av genekspresjon ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode, hvor ΔΔCt = (Ct
gen-Ct
referanse )
prøve-(Ct
gen-Ct
referanse)
kalibrator. Primer sekvenser av JAM-A var 5′-GTG AAG TTG TCC TGT GCC TAC TC-3 «(fremover) og 5′-ACC AGT TGG CAA GAA GGT CAC C-3» (bakover). Primer sekvenser av β-actin var 5’TGC CTA GAT CAA GAA GCA G -3 «(fremover) og 5’TGC CTA GAT CAA GAA GCA G -3» (bakover). Tre uavhengige eksperimenter ble utført i tre eksemplarer under identiske forhold.
Små interfering RNA Behandling
Liten interfering RNA (siRNA) for JAM-A ble syntetisert ved Genepharma (Shanghai, Kina). Sekvensene til siRNA var som følger: 5′-GAA GAG GUG AAG AAU UCA ATT-3 «(sense); og 5»-UUG AAU UCU CCU UCA CUU CTT-3 «(antisense). Sekvensene til ikke-målsøkende siRNA (negativ kontroll) anvendt som en negativ kontroll var som følger: 5»-GAA UUC UCC CGU GUC ACG UTT-3 «(sense); og 5»-ACG UGA CAC Guu CGG AGA ATT-3 «(antisense). Celler ble sådd ut i en 6-brønners plate 24 timer før transfeksjon eksperimenter. Cellene ble transfektert med 100 pmol JAM-A siRNA eller negativ kontroll siRNA hjelp Lipofectamine2000 (5 ul /brønn; Livet Technologies Corporation, Grand Island, NY, USA) i henhold til produsentens protokoll. Etter transfeksjon ble proteinet og mRNA nivåer av JAM-A vurderes 48 timer senere. Tre uavhengige eksperimenter ble utført under identiske betingelser.
Western Blot analyse
Total protein fra celler som ble ekstrahert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P40, 0,5% natrium deoxycholate, og fenylmetylsulfonylfluorid [PMSF]; Beyotime, Haimen, Kina) og kvantifisert ved hjelp av bicinchoninic syre (BCA) metode (Beyotime). Seksti ug protein ble separert ved SDS-PAGE (10%) og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA), Etter blokkering med 5% BSA i Tris-bufret saltvann-Tween 20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl og 0,05% Tween-20), ble membranene inkubert ved 4 ° C over natten med følgende primære antistoffer: JAM-A (1:1000; Abcam); og anti-P-Rb, anti-P27, anti-P21, anti-cyklin A, anti-cyclin B, anti-cyklin D1, anti-CDK4, anti-CDK6, anti-akt1 /2, og anti-P-AKT thr 308 (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Etter inkubering med peroksidase-koblet anti-mus eller kanin IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) ved 37 ° C i 2 timer, ble bundne proteiner visualisert ved bruk av ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og påvises ved hjelp Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). De relative proteinnivåer ble beregnet på grunnlag av GAPDH som laste kontroll. Tre uavhengige eksperimenter ble utført under identiske betingelser.
Flow Cytometry Assay
Cellene ble trypsinert og 1 x 10
6-celler ble vasket to ganger med kald inkubasjonsbuffer (2% BSA i PBS) og sentrifugert, deretter ble cellene resuspendert i 100 ul inkuberingsbuffer og inkubert med eller uten FITC-konjugert mus-anti-humant JAM-A-antistoff (1:100; Biolegend, San Diego, CA, USA) eller FITC-konjugert mus lgG1 , κ isotype kontrollantistoff (1:100; Biolegend) på is i 30 min i mørket. Cellene ble deretter vasket to ganger med inkuberingsbuffer og behandlet for flowcytometrisk analyse. Data ble analysert ved hjelp av FlowJo 7.6.1 programvare. Tre uavhengige eksperimenter ble utført in triplo under identiske betingelser.
Cell Proliferation Test
En celle proliferasjonsanalyse ble utført ved anvendelse av MTT (Sigma) i henhold til produsentens protokoll. Kort, H1299 og A549 celler ble transient transected med JAM-A siRNA eller negativ kontroll siRNA. Etter 24 timer ble cellene trypsinisert og sådd ut ved en konsentrasjon på 3 x 10
3 celler /100 ul /brønn i 96-brønners kulturplater over natten. Hver etterfølgende dag ble cellene behandlet med 20 ul (5 mg /ml) /brønn av MTT-løsning i løpet av de siste 4 timer av kulturen. Dyrkningsmediet ble erstattet med DMSO (150 ul /brønn). Den optiske tetthet av brønnene ble målt ved 490 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Tre uavhengige eksperimenter med 5 innvendige replikater per eksperiment ble utført under identiske betingelser.
Colony Forming Assay
For koloni formasjons analysene ble celler transfektert med JAM-A eller negativ kontroll siRNA i 48 timer, deretter sådd ut i 6-brønners kulturplater (1000 per brønn) og inkubert i 12 dager. Platene ble vasket med PBS og farget med Giemsa. Antallet kolonier med 50 celler ble tellet. Koloniene ble tellet manuelt ved hjelp av et mikroskop. Tre uavhengige eksperimenter ble utført in triplo under identiske betingelser.
Cell Cycle Analysis
celler (100 000) ble utsådd i 6-brønners kulturplater, synkronisert etter serum sult i 24 timer, deretter transfektert med de angitte mengder av siRNA. Celler ble høstet, fiksert i 75% etanol i 48 timer etter transfeksjon, vasket med PBS og farget i 5 mg /ml propidiumjodid i PBS supplert med RNase A (Roche, Indianapolis, IN, USA) i 30 minutter ved romtemperatur. Data ble samlet inn ved hjelp BD-systemer. Tre uavhengige eksperimenter ble utført under identiske betingelser
Statistical Analysis
SPSS (versjon 16.0 for Windows, SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Ble brukt for alle analyser. Chi-squared test ble benyttet for å bestemme sammenhengen mellom JAM-A uttrykk og clinicopathologic egenskaper. Kaplan-Meier-kurver ble brukt for overlevelsesanalyse, og log-rank ble fastsatt basert på forskjellene. T-test ble brukt til å sammenligne andre data. P-verdier var basert på tosidig statistisk analyse, og en p. 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans
Resultater
Expression og distribusjon av JAM-A i NSCLC Vev
Vi analyserte uttrykket og distribusjon av JAM-A i 82 NSCLC prøvene og tilsvarende normale vev ved hjelp av immunhistokjemi. JAM-A ble hovedsakelig uttrykt i cellemembraner; høy uttrykk for JAM-A ble funnet i 37% av lunge vevsprøver (tabell 1), som var mye høyere enn bronkial epitel og pneumocytes i tilsvarende ikke-tumor lunge vev (Fig. 1). Vi har undersøkt forholdet mellom ekspresjonen av membranen JAM-A og clinicopathologic parametere. Basert på univariat analyse, ble høyt uttrykk av membran JAM-A signifikant korrelert med TNM stadium (P = 0,021) og lymfeknutemetastaser (P = 0,007), men ikke med alderen (P = 0,818), kjønn (P = 0,96), differensiering (P = 0,174), tumorstatus (P = 0,105), og tumorhistologi (P = 0,818, tabell 1). Vi evaluerte forholdet mellom ekspresjonen av membranen JAM-A og total overlevelse i 49 NSCLC. Etter Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, fant vi at pasienter med høyt uttrykk av membran JAM-A hadde signifikant lavere overlevelse (median overlevelse = 50 ± 8,92 måneder, 95% konfidensintervall [CI], 32.56-67.48 måneder) enn pasienter med lav uttrykk for membran JAM-A (median overlevelse = 61 ± 4,31 måneder; 95% CI, 52.56-69.45 måneder, P = 0,02, fig. 2).
(A) Sterk JAM-A uttrykk i lunge adenokarsinom (400X). (B) Svak JAM-A uttrykk i lunge adenokarsinom (400X). (C) Sterk JAM-A uttrykk i lunge plateepitelkarsinom (400X). (D) Svak JAM-A uttrykk i lunge plateepitelkarsinom (400X). (E) Svak misfarging i normal bronkiale epitel i ikke-kreft lungevev (400X). (F) Negative kontroller for JAM-A farging med ikke-immune kanin IgG antistoff (400X).
Pasienter med lav uttrykk for JAM-A hadde bedre total overlevelse enn gjorde pasienter med høyt uttrykk av JAM -A, som definert av log-rank test (P = 0,02).
JAM-A uttømming hemmer Lung Cancer Cell Proliferation
Vi oppdaget JAM-A uttrykk i normale bronkial epitelceller (HBE) celler og seks lunge kreft cellelinjer ved Western blot og real-time PCR-analyse. H1299 og A549 celler utstilt høye nivåer av uttrykk for JAM-A, HBE celler viste moderate nivåer av uttrykk for JAM-A, og H157, H460, SPC, og LK2 viste lave nivåer av uttrykk for JAM-A (Fig. 3A, B ). Fordi JAM-A er en type jeg transmembrane glykoprotein, vi deretter analysert cellemembran-forbundet JAM-A nivåer ved hjelp av en flowcytometri analyse i relativt høye endogene JAM-A cellelinjer (H1299 og A549) og relativt lave endogene JAM-A cellelinjer (H460 og H157). Som vist på fig. 3C, ekspresjon av overflate JAM-A på H1299 og A549-celler som var mye høyere enn H157 og H460-celler. Derfor brukte vi H1299 og A549 celler i tap-av-funksjon studier.
JAM-A uttrykk i et panel av menneskelige luftveiscellelinjer utvunnet vurdert av Western blot er Viste data som representative Western blot eksperimenter. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger uavhengig med lignende resultater. (B) Relativ uttrykk for JAM-A mRNA i et panel av menneskelige luftveiscellelinjer utvunnet vurdert av real-time PCR. Den relative mengden av JAM-A mRNA, normalisert til p-aktin, ble sammenlignet med H157 celler basert på ligningen RQ = 2
-ΔΔCt. Kolonner, mener av RQ av tredoble verdier i et representativt eksperiment; barer, max /min RQ. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger, uavhengig av hverandre, og utført i tre eksemplarer med lignende resultater. (C) Overflate ekspresjon av JAM-A i et panel av humane luftveis-avledede cellelinjer vurderes av en strømningscytometri-analyse. Konfluente celler ble trypsinert og flowcytometri assay-analyser ble utført som beskrevet i metodedelen. Data er vist som representative histogrammer (topplaten), mener fluorescens intensitet tredoble verdier i et representativt eksperiment, Columns, mener; barer, SD. (Nederst panel). Forsøkene ble uavhengig gjentas 3 ganger i tre eksemplarer med lignende resultater.
For å avgjøre hvorvidt JAM-A deltar i moduler kreft celle vekst lunge, vi brukte siRNA til knockdown JAM-A uttrykk i H1299 og A549-cellelinjer. Sammenlignet med negativ kontroll siRNA-transfekterte cellelinjer, JAM-A-spesifikke siRNA effektivt undertrykt totale JAM-A protein nivåer (fig. 4A), JAM-A mRNA nivåer (Fig. 4B), og overflaten uttrykket nivåer (fig. 4C) i de to testede cellelinjer. Celleveksthastigheten ble bestemt ved MTT-analyse. H1299 og A549 celler transfektert med JAM-A-spesifikke siRNA hadde redusert vekstrater i forhold til negativ kontroll siRNA (Fig. 5A). Vi gjennomførte en uavhengig metode (kolonidannelse analyse) for å validere anti-proliferativ effekt av JAM-A hemming i lungekreftceller. Etter avtale med MTT resultater, JAM-A knockdown effektivt reduseres kapasiteten til kolonidannelse av de 2 testede lungekreft cellelinjer (negativ kontroll vs. JAM-A siRNA, H1229:231 ± 19 vs. 55 ± 7, p 0,01 ; A549:420 ± 31 vs. 273 ± 21, p analyserer figur 5B)
(A) Western blot av JAM-A uttømming effektivitet i kreftceller, 0,01… Data er vist som representative Western blot (venstre panel). Densitometry verdi analyse av 3 uavhengige Western blot eksperimenter, ble data normalisert mot GAPDH, Columns, mener; barer, SD, ** p 0,01 (høyre panel). (B) Real-time PCR-analyser av JAM-A uttømming effektivitet i kreftceller, Den relative mengden av JAM-A mRNA, normalisert til p-aktin, ble sammenlignet med den negative kontroll siRNA-transfektert gruppe basert på ligningen RQ = 2
-ΔΔCt. Kolonner, mener av RQ i et representativt eksperiment; barer, max /min RQ. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger uavhengig av hverandre i tre eksemplarer med lignende resultater. (C) Flowcytometri analyse analyser av JAM-A overflate uttrykk uttømming effektivitet. H1299 og A549 celler ble transient transected med negativ kontroll siRNA eller JAM-A siRNA; Etter 48 timer ble cellene trypsinert og flowcytometri assay-analyser ble utført som beskrevet i metodedelen. Data er vist som representative histogrammer (øvre panel), betyr fluorescens-intensiteten av triplikate verdier i et representativt eksperiment, kolonner, bety; barer, SD. ** P 0,01 (nedre panel). Forsøkene ble uavhengig gjentas 3 ganger i tre eksemplarer med lignende resultater.
(A) MTT analysen ble utført etter JAM-A siRNA behandling. Absorbansen ved 490 nm ved forskjellige tidspunkter ble observert. Data er vist som gjennomsnitt ± SD av representative eksperimenter, * p 0,05; ** P 0,01. 3 uavhengige eksperimenter med 5 interne replikater per eksperiment ble utført med lignende resultater. (B) Vurdering av klonogene potensialer av JAM-A-utarmet kreftceller. Komplett felt per plate ble fotografert og presentert. Data er vist som representative kolonidannelse assay (venstre panel), antallet av kolonier av triplikate verdier i et representativt eksperiment ble tellet, kolonner, middelverdi; barer, SD. ** P 0,01 (høyre panel). 3 uavhengige eksperimenter i tre eksemplarer ble utført med lignende resultater.
JAM-en knockdown Resultater i G1 arrest og Vekst Hemming av lungekreft celler
neste søkt å undersøke mulige mekanismer der JAM -En knockdown kan redusere celleproliferasjon. Vi analyserte cellesyklus ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), og viste at prosentandelen av celler i G1 fasen ble øket (H1299, negativ kontroll vs. JAM-A siRNA, 57,8 ± 2,8 vs. 68,1 ± 2,5, p A549 negativ kontroll vs. JAM-A siRNA, 57,12 ± 2,77 vs. 65.96.1 ± 2,52, s 0,05, fig. 6), mens celler i S-fasen ble redusert i celler behandlet med JAM-A knockdown sammen å kontrollere celler (H1299, negativ kontroll vs. JAM-A siRNA, 30,49 ± 2,8 vs. 24,1 ± 2,74, p 0,05; A549 negativ kontroll vs. JAM-A siRNA, 29,33 ± 2,61 vs. 23.49.1 ± 2,49, p 0,05; ** P. 0,01 (høyre panel)
(A) Western blot analyse av et panel av proteiner ble gjennomført på siNC- eller siJAM-A-transfektert H1299 cellelinjer (venstre panel) og A549 -cellelinjer (høyre panel). Data er vist som representative Western blot. Tre uavhengige eksperimenter ble utført med lignende resultater. (B) Densitometry analyse av 3 uavhengige Western blot eksperimenter, ble data normalisert mot GAPDH, Columns, mener; barer, SD, * p 0,05; ** P. 0,01
PI3K-Akt-β-catenin Signal Cascade er ikke hemmet av høye nivåer av Expression of Surface JAM-A i lungekreftceller
Publiserte studier indikerer at JAM-A begrenser intestinal epitelceller (IEC) spredning ved å hemme PI3K-Akt-β-catenin signalkaskade aktivering [27]. For å utforske hvorvidt denne signalveien er også effektiv i lungekreftcellelinjer, vi også testet den totale og fosforylerte nivåer av Akt i jam-tap-av-funksjon studier. Western blot analyse viste at knockdown av JAM-A ikke endre de aktive nivåer av Akt, noe som antyder at høye JAM-A nivåer i H1299 og A549 celler ikke påvirker PI3K-Akt-β-catenin kaskade aktivering (fig. 7).
Diskusjoner
JAM-A er uttrykt i flere typer svulster og er involvert i tumorprogresjon. Uttrykket av JAM-A protein i NSCLC vev og forholdet til ulike clinicopathologic faktorer er ikke fullt ut undersøkt. Videre eksakte rolle JAM-A i lungekreft progresjon er uklart. I denne studien undersøkte vi mønsteret av uttrykk og den biologiske funksjonen til JAM-A i NSCLC. Vi viste at JAM-A hovedsakelig er lokalisert i cellemembraner, og uttrykk for JAM-A i lungekreft vev er høyere enn tilsvarende normal lunge vev. Det høye nivået av uttrykk for membran JAM-A ble signifikant assosiert med avansert pTNM stadium, lymfeknutemetastaser, og redusert total overlevelse i lungekreftpasienter. Til sammen våre resultater viste at JAM-A er en potensiell onkogene protein i NSCLC og kan tjene som en negativ prediktor for overlevelse hos NSCLC pasienter.
For å undersøke mulighetene funksjon av JAM-A i lungekreftceller videre brukte vi siRNA til knockdown JAM-A uttrykk i H1299 og A549 cellelinjer som uttrykker relativt høye nivåer av overflate JAM-A. Spredning og kolonidannelse i de to cellelinjene ble undertrykte betydelig etter stanse JAM-A. De fleste av de proliferative faktorer påvirker cellevekst ved å påvirke cellesyklusprogresjon, og dermed vi analyserte cellesyklusen og viste at JAM-en knockdown-celler hadde høyere nivåer av G1 fase og lavere S-fasen enn kontrollceller. Dermed JAM-A stanse hemmet G1 til S overgang i cellesyklusprogresjon, noe som kan belyse mekanismen av JAM-A på kreft celle lunge spredning. For å bestemme den potensielle mekanisme JAM-A på cellesyklusregulering, undersøkte vi effekten av JAM-A knockdown på celle-syklus relaterte molekyler. Vi analyserte ekspresjonen av cyklin A, cyclin B, cyklin D1, CDK4, CDK6, P21, P27 og P-RB, og fant at nivåene av ekspresjon av cyclin D1, CDK4, CDK6, og P-RB ble redusert etter JAM -En knockdown. Det har tidligere blitt vist at P-RB er ansvarlig for en stor G1 kontrollpost, blokkering S-fase inngang og cellevekst ved fysisk å assosiere med E2F-faktorer og blokkerer aktivering av gen-ekspresjon som koder for produkter som er nødvendige for S-faseprogresjon. Den proteinkompleks består av cyclin D1, CDK4 og CDK6 vil fosforylere P-RB og fremme P-RB inaktivering. Fortsatt fosforylering på P-RB av forskjellige CDK fører til frigjøring av E2F, for derved å lette aktivering av gener kritiske for S-faseprogresjon [28], [29], [30]. Tatt sammen, våre resultater indikerer at JAM-A positivt styrer NSCLC celleproliferasjon ved å regulere ekspresjon av cellesyklusrelaterte molekyler, slik som cyklin D1, CDK4, CDK6, og P-RB.
Publiserte undersøkelser tyder på at JAM-A begrenser IEC spredning ved å hemme PI3K-Akt-β-catenin aktivering [27]. For å undersøke om høye nivåer av overflate JAM-A av de to testede cellelinjer eller ikke negativt påvirker celleproliferasjon på samme måte som IEC, vi også testet de aktive (fosforylering) nivåer av Akt i jam-tap-av-funksjon studier . Western blot analyse viste at knockdown av JAM-A i H1299 og A549 celler endret ikke de aktive nivåer av Akt, noe som indikerer at høye nivåer av JAM-A i H1299 og A549 celler ikke påvirker PI3K-Akt-β-catenin signalkaskade aktivering.
rollen JAM-A i tumorvekst og spredning er fortsatt en kontroversiell sak. Naik et al. [18] opprinnelig rapportert at JAM-A uttrykk er negativt forbundet med brystkreft aggressivitet og metastase i 12 tumorer, og den tilsvarende ikke-neoplastisk vev, så vel som 50 ondartet og tilsvarende metastatisk lymfeknute prøver. Imidlertid Mc Sherry et al. [21], bruke større kliniske datasett (en 270 pasient invasiv brystkreft vev microarray [TMA] og en uavhengig datasett av genekspresjon informasjon fra 295 pasienter med primær brystkreft), viste en positiv sammenheng mellom JAM-A uttrykk og invasiv brystkreft prognose, noe som ble ytterligere bekreftet ved sin annen publisert rapport ved hjelp av et større datasett [24]. Nylig, Murakami et al. [22], ved bruk av TMA av 444 pasienter med invasiv brystkreft, også rapportert en lignende sammenheng. I sammenheng med invasiv brystkreft, tar hensyn til større datasett, sammenhengen mellom clinicopathologic data og overlevelsesdata analysert av McSherry et al. [21], [24] og Murakami et al. [22], bør høy JAM-A uttrykk være en negativ prognostisk faktor for pasientens utfall. Den mekanisme som kreftceller opprettholde høy JAM-A i løpet av tumorprogresjon gjenstår å bli definert. Gotte et al. [25] viste at MIR-145, som mål og nedregulerer JAM-A, er nedregulert i brystkreftceller. Disse dataene kan forklare de høye nivåene av JAM-A i denne type svulst [22]. Men om ikke MIR-145 spiller samme rolle i NSCLC i brystkreft trenger videre forskning. Det bør bemerkes at negative, men ikke positive effekter av JAM-A på tumorprogresjon ble også rapportert basert på kliniske datasett som involverer livmorkreft [19] og bukspyttkjertelkreft [20], noe som tyder på at rollen JAM-A i tumorprogresjon kan være celletype-avhengig. Publiserte data har fokus på mekanismer for JAM-A regulerende tumorprogresjon, selv om kontroversielt, ville bedre avklare dette spørsmålet. Positiv [21], [22], [23], [24], [25], [26] og negative [18], [19] effekter av JAM-A på tumorprogresjon er rapportert
in vivo <
