Abstract
Hypoksi er en viktig miljøendringer i mange kreftformer. Hypoksiske nisjer kan være okkupert av kreft stamme /progenitor-lignende celler som er assosiert med tumorprogresjon og motstand mot radioterapi og kjemoterapi. Men det er ennå ikke fullstendig klarlagt hvordan hypoksi påvirker stilk-lignende egenskaper av prostata kreft celler. I denne rapporten har vi undersøkt effekten av hypoksi på menneskelige prostata kreft cellelinjer, PC-3 og DU145. I forhold til normoxia (20% O
2), 7% O
2 induserte høyere uttrykk for HIF-1α og HIF-2α, som var assosiert med oppregulering av Oct3 /4 og Nanog; 1% O
2 indusert enda større grad av disse faktorene. Den oppregulert
Nanog
mRNA uttrykk i hypoksi ble bekreftet å være overveiende retrogene
NANOGP8
. Lignende vekstrater ble observert for celler dyrket i henhold hypoksisk og normoksisk betingelser for 48 timer; imidlertid den kolonidannelse analysen viste at 48 timer etter hypoksisk forbehandling førte til dannelsen av flere kolonier. Behandling med 1% O
2 også utvidet G
0 /G
en scene, noe som resulterer i flere sidebefolknings celler, og indusert CD44 og ABCG2 uttrykk. Hypoksi også økt antall celler som var positive for ekspresjon ABCG2, som ble hovedsakelig funnet å være CD44
lyse celler. Tilsvarende er sortert CD44
lyse-celler uttrykte høye nivåer av ABCG2, Oct3 /4, og Nanog enn CD44
dim-celler, og hypoksiske forbehandling betydelig økt uttrykk for disse faktorene. CD44
lyse cellene under normoxia dannet vesentlig flere kolonier og kuler sammenlignet med CD44
dim celler, og hypoksisk forbehandling også økt denne effekten. Våre data tyder på at prostatakreftceller under hypoksi har større stilk-lignende egenskaper
Citation. Ma Y, Liang D, Liu J, Axcrona K, Kvalheim G, Stokke T, et al. (2011) Prostate Cancer Cell Lines under hypoxi viser større Stem-lignende egenskaper. PLoS ONE 6 (12): e29170. doi: 10,1371 /journal.pone.0029170
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 1 august 2011; Godkjent: 22 november 2011; Publisert: 28.12.2011
Copyright: © 2011 Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Den norske Radiumhospitalets Forskningsstiftelse med tilskudd nummer 333005 til ZS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Somatiske svulster, inkludert prostatakreft, inneholder en liten undergruppe av stamceller-lignende celler, kalt kreftstamceller, med kapasitet for selvfornyelse, differensiering, og oppstart av nye svulster. Det er blitt vist at kreft stamceller kan flykte fra radioterapi og kjemoterapi, og er i stand til å danne metastatiske tumorer i andre organer [1], [2]. Cancer stamceller fortrinnsvis ligge i bestemte hypoksiske mikro-nisjer, ofte eksisterende inni svulster [3], [4]
hypoksi induserbare faktorene (HIFs) er viktige regulatorer funnet i pattedyrceller ved lavere oksygen spenning.; de er involvert med flere funksjoner, som for eksempel celleoverlevelse, angiogenese, og stamcelle vedlikehold, og spiller en avgjørende rolle i cellulær homeostase og systemisk respons på hypoksi [5]. HIFs er heterodimerer;
HIF1A plakater (HIF-1α) og
EPAS1 plakater (HIF-2α) er de to viktigste isoformene av α-subenheten, og deler en høy grad av sekvenshomologi. Oct3 /4 (også kalt POU5F1) og Nanog er embryonale stamcellemarkører som er viktige for transkripsjon og opprettholde selvfornyelse av embryonale stamceller og primordial kjønnsceller. De har også blitt identifisert i ulike somatiske svulster, inkludert hode og hals, lunge, tykktarms, eggstokkreft og prostatakreft [6] – [11]. Relativt, uttrykk for disse genene er nedregulert i alle differensierte somatiske celletyper,
in vitro
samt
in vivo product: [12], [13].
Nanog
, også kalt
NANOG1
, har flere pseudo, og blant dem
har NANOGP8
senere blitt bekreftet å være en retrogene. Begge
NANOG1 Hotell og
NANOGP8
uttrykk har blitt identifisert i ulike kreftcelletyper [14], [15], inkludert prostata kreft celler [16].
En rekke overflatemarkører er benyttet for å isolere antatte kreft stilk /stamceller. I prostata kreft, blir de tidlige stamceller i forbindelse med flere spesifikke overflatemarkører, for eksempel CD44, CD133, og CXCR4 [17] – [19]. Side befolkning teknologi har også blitt brukt for å isolere kreft stamceller med evne til å pumpe ut Hoechst 33342 [20]. Utstrømning av fargestoffet er knyttet til medlemmer av ATP-bindende kassett familie, slik som ABCG2 (brystkreft motstand protein, BCRP). Den oppregulering av ABCG2 er også ansvarlig for kjemoterapeutisk motstand i enkelte kreftceller [21]. I bryst og prostata kreft, har tidligere studier identifisert CD44
+ eller CD117
+ /ABCG2
+ celler med stilk-lignende egenskaper, for eksempel økt klonogene /tumorigene egenskaper, høyere uttrykk for stemness gener, og sterkere evnen til å danne svulster i dyremodeller [19], [22], [23].
Hypoksi hjelper embryonale stamceller for å opprettholde stemness og høyere oksygen spenninger drivceller til proliferasjon og differensiering, som er mer utsatt for konvensjonell behandlingsmetoder [24], [25]. Lignende resultater har blitt observert hos voksne celler, som adipocytter, fibroblaster, og flere typer kreftceller [26] – [28]. Men virkningen av hypoksi i prostatakreftceller er ikke fullstendig klarlagt. Derfor, i denne studien undersøkte vi prostatacancercellelinjer PC-3 og DU145 ved forskjellige oksygen spenninger for bedre å forstå virkningen av hypoksi på stammen lignende egenskaper av cellene. Stemness faktorer, Oct3 /4 og Nanog, ble uttrykt ved høye nivåer i cellene under hypoksiske dyrking og disse cellene viste forhøyet kolonidannelse potensial i forhold til de cellene under normoksiske tilstand. Videre oppregulert
Nanog
mRNA til uttrykk under hypoksi ble bekreftet i hovedsak hentet fra retrogene
NANOGP8
. I disse prostatakreftcellelinjer, hypoksi også økt brøkdel av siden befolknings celler, utvidet G
0 /G
en scene, og resulterte i høyere nivåer ABCG2 og CD44 uttrykk. Andre eksperimenter viste at CD44
lyse celler viste signifikant større stemness, som bekreftet av kolonidannelse analysen, sfære vekstanalyse, og stemness faktor uttrykk analyser.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelige prostatacancercellelinjer, PC-3 og DU145, ble anskaffet fra ATCC (American Type Culture Collection, USA) og holdt i vårt laboratorium for denne studien. For konvensjonelle cellekultur, ble cellene sådd ut i kulturflasker med RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Kulturer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator i en atmosfære av 20% O
2, 5% CO
2, og 75% N
2.
Xvivo Lukket Inkubering system (Xvivo system 300 C, BioSpherix, New York, USA) ble anvendt i denne studien for å nøyaktig opprettholde forskjellige oksygen spenninger i forskjellige kamre. Etter 24 timers dyrking ved konvensjonell cellekultur (slik celler til å feste på kolbene) ble cellene overført til forskjellige kamre med 1% O
2, 5% CO
2, og 94% N
2; 7% O
2, 5% CO
2, og 88% N
2; eller 20% O
2, 5% CO
2 og 75% N
2 for variable perioder før de ble høstet for ytterligere analyse.
semikvantitativ revers transkripsjon-PCR (RT PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra de dyrkede celler ved hjelp RNeasy Kit (Qiagen, CA, USA) i henhold til produsentens anvisninger. For å eliminere en hvilken som helst DNA, ble DNase I anvendt i RNA isoleringsprosedyren. RNA prøve konsentrasjoner ble kvantifisert ved hjelp av et spektrofotometer (Nanodrop ND-1000, USA) ved OD260 /280.
Komplementær DNA (cDNA) ble deretter syntetisert fra 5 mikrogram total RNA bruker Multiscribe revers transkriptase (Applied Biosystems, Foster city, CA). Betingelsene for revers transkripsjon var: 25 ° C i 10 minutter, 37 ° C i 12 minutter, 85 ° C i 5 minutter, etterfulgt av oppbevaring ved 4 ° C. cDNA ble lagret ved -70 ° C for senere PCR-analyser
PCR-amplifisering av cDNA ble utført ved anvendelse av en PCR-system (DOPPIO VWR, UK) og følgende program:. innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter; etterfulgt av 30 sykluser (28 sykluser for GAPDH) av annealing ved 60 ° C i 30 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder; fulgt av avslutning med en 10 minutters forlengelse trinn ved 72 ° C. Primerne benyttet for RT-PCR var: for Nanog, F 5′-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 «og 5′-R AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3′, amplifisering av et 66-bp-fragment; for Oct3 /4, F 5»-ACATGTGTAAGCTGCGGCC-3 «og 5′-R GTTGTGCATAGTCGCTGCTTG-3′, amplifisering av en 297-bp-fragment; for HIF-1α, F 5»-AGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAA-3 «og 5′-R CTGAGGTTGGTTACTGTTGGTATCA-3′, amplifisering av en 113-bp-fragment; for HIF-2α, F 5»-GACCAGCAGATGGACAACTTGTAC-3 «og 5′-R CAGAAAGATCATGTCGCCATCTT-3′, amplifisering av et 84-bp-fragment; og for GAPDH, F 5»-CCTCAAGATCATCAGCAATGC-3 «og 5′-R TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3», amplifisering av et 101 bp-produkt. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger
De amplifiserte PCR-produktene ble separert ved 7,5% polyakrylamidgelelektroforese, farget med GelRed (Molecular Probes, Invitrogen), og visualisert med et Syngene bildesystem (G:. BOX Syngene , USA).
mRNA uttrykk for
NANOG1 Hotell og
NANOGP8
ble målt ved kvantitativ PCR hjelp av en Taqman ABI 7900 Sequence Detector System (Applied Biosystems). De publiserte spesifikke primere og prober [29] ble anvendt i denne studien. For
NANOG1
: forover primer var 5′-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT -3 «, revers primer var 5′-AGAAGCCGTCTCTGGCTATAGATAA -3», og sonden var CTGCTAAGGACAACATTGAT; for
NANOGP8
: forover primer var 5′-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT-3 «, revers primer var 5′-ACGAGTTTGGATATCTTTAGGGTTTAGAATC-3», og sonden var CCTTGGCTGCCGTCTCTG. Alle primere og prober merket med FAM-MGB ble oppnådd fra Applied Biosystems. GAPDH ble brukt som en intern kontroll og Ct-verdier på 20% O
2 ble brukt som kalibratorer for evaluering
NANOG1 Hotell og
NANOGP8
uttrykk nivåer i respons på hypoksi. Forsøkene ble utført i duplikat. Uttrykket nivåer av
NANOG1
og
NANOGP8
ble analysert gjennom ΔΔCt metoden [29].
Immunoblotting
Celler ble raskt skylles med is- kald fosfat-bufret saltvann (PBS) og skrapet inn i RIPA-buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM NaCl, 1% NP40, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS; Thermo Scientific Pierce, Tyskland), med proteasehemmere (0,1 uM aprotinin, 1,0 mM PMSF, 1 uM leupeptin, 1 uM pepstatin) ble tilsatt umiddelbart før bruk. Prøvene ble sentrifugert ved 15000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C og supernatantene ble overført til nye rør. Proteinkonsentrasjonene ble målt med et Bio-Rad proteinanalyse i henhold til produsentens instruksjon. Prøvene ble oppvarmet med en bord- varmeapparat (Model 111 002, Boekel Scientific, USA) ved 100 ° C i 5 minutter i SDS-ladningsbuffer (500 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glyserol, 2% SDS, 0,6 M DTT, 0,05% bromfenolblått), og deretter en lik mengde protein (50 ug) per prøve ble utsatt for 10% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid overføringsmembran (Bio-Rad, USA). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig tørrmelk i TBS-Tween i 60 minutter ved romtemperatur og deretter inkubert med primære antistoffer med optimal fortynning i TBST /5% melk over natten ved 4 ° C. Den optimaliserte antistoffene som anvendes i denne studien inkluderte: HIF-1α (1 pg /ml MAB1536, R D) og Nanog (geit, 5 mikrogram /ml, katalognummer: AF1997, R D)
Etter nok en skylling med DAKO. vaskebuffer, mus /kanin EnVision FLEX + Linker-reagens ble tilsatt, og prøvene ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med seg FLEX + HRP i 30 minutter ved romtemperatur. Prøver med primære antistoffer fra geit ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med muse-anti-geite-IgG før tilsetningen av mus EnVision FLEX + Linker-reagens og ser FLEX + HRP som beskrevet ovenfor. Seksjonene ble skylt, farge reaksjon utviklet med DAB reagens, kontra i hematoksylin i 20 sekunder, dehydrert, og monteres under glassdeksel slips i forberedelse til evaluering ved mikroskopi.
Celletelling (celledeling rate)
Celleproliferering ble evaluert ved å telle antall celler ved hjelp av elektronikk grevinne Automated celleteller (Invitrogen, USA). Etter trypsinering ble de flytende cellene oppsamlet for å lage en cellesuspensjon som inneholdt ingen åpencellegrupper. I hvert preparat, ble 10 ul cellesuspensjon blandet med 0,4% trypan-blått fargestoff (01:01) før den blir applisert på en celle tellekammer lysbilde for celletelling. Antall levedyktige celler som var i stand til å utelukke fargestoff ble tellet for hver eksperimentell tilstand. For hver prøve ble celle nummer telles minst tre ganger.
Colony formasjon analysen
Ved hjelp av seks-brønns plater, ble 500 celler per brønn opprettholdt i oksygen spenninger på 1%, 7% , og 20% i 48 timer. Alle platene ble deretter anbragt i en inkubator med 20% O
2 i 2 uker for observasjon av kolonidannelse. Kolonier ble fiksert med 4% bufret formalin i 15 minutter, og deretter farget med 1% krystallfiolett i 30 min. Platene ble vasket forsiktig med PBS og tørket før mikroskopisk evaluering koloni. Kolonier som inneholdt mer enn 30 celler ble tellet. Kolonidannelse effektivitet ble beregnet som følger: kolonidannelse effektivitet = kolonier /input celler × 100%. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Cell syklus analyse
Etter inkubasjon under ulike oksygen spenninger, inkludert 1% eller 20% O
2, PC-3 og DU145 cellene høstet og fiksert med metanol ved -20 ° C over natten. Disse cellene ble anvendt for å fremstille en enkeltcelle-suspensjon til hvilken det ble tilsatt 1,5 ug /ml Hoechst 33258 før cellene ble holdt på is i 30 minutter. Etter det ble prøvene analysert med en LSRII flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
Side befolkningen analysen
Celler vokst til 80% samløpet (ca 1 × 10
6 celler) ble høstet og suspendert i forvarmet RPMI 1640 medium inneholdende 2% føtalt bovint serum og 2 mM HEPES-buffer. Hoechst 33342 fargestoff (stamløsning av 1 mg /ml; Sigma) ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml, og blandingen ble inkubert med intermitterende rysting i 90 minutter ved 37 ° C, i nærvær eller fravær av verapamil (50 uM; Sigma). Deretter ble cellene vasket med iskald HBSS med 2% FBS, sentrifugert ved 4 ° C og resuspendert i iskald HBSS inneholdende 2% FBS. Propidiumjodid ble tilsatt til de suspenderte cellene til en sluttkonsentrasjon på 2 ug /ml, for å avdekke levedyktige celler. Før analyse ble cellene filtrert gjennom et 70 mikrometer celle sil for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Celle Aggregatene ble fjernet fra analysene av dublett diskriminering og enkeltceller ble analysert på en LSRII strømningscytometer (BD Biosciences). Hoechst 33342 fargestoff var spent på 350 nm og sidebefolknings celler ble visualisert ved bruk av rød (rød, 660/10 nm) vs. blå (blå, 424/44 nm) deteksjon.
ABCG2 /CD44 fenotype og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS)
Etter 48 timers inkubering ved oksygentrykk på 1% og 20%, PC-3 og DU145-celler ble trypsinert, talt opp, vasket med kald FACS-buffer ( PBS + 0,03% BSA), og resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 10
6 celler /ml. Cellene ble på forhånd blokkert med 5% BSA i 30 minutter på is før de ble farget med primære antistoffer (anti-CD44 monoklonalt antistoff direkte konjugert med APC (allophycoyanin) og anti-ABCG2 monoklonalt antistoff direkte konjugert med FE (phycoerythin); BD Pharmingen Company) på is i mørket i 30 minutter. Cellesuspensjoner ble vasket to ganger, resuspendert i 400 ul FACS-buffer, og filtrert gjennom en 70 um nylonnett. Prøvene ble analysert på et strømningscytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) for påvisning av ABCG2 og CD44, og en FACS DiVa cellesorterings ble brukt for cellesortering. Etter dyrkning ved 1% eller 20% O
2 til 48 timer ble de PC-3 og DU145-celler sortert på grunnlag av CD44 ekspresjon. For de CD44 positive celler, ble bare de beste 10% uttrykker celler valgt (kalt CD44
lys); for de CD44-negative celler, ble de nederste 10% uttrykkende celler isolert (kalt CD44
dim). For hver prøve ble levedyktige og enkeltceller gated; APC Mus IgG2b (BD Pharmingen, USA) og FE Mus IgG2b (BD Pharmingen, USA) isotype kontroller ble brukt som negative kontroller.
Sphere-analysen
Analysen brukes var basert på tidligere beskrevet fremgangsmåter [30]. Etter at CD44
lyse celler ble sortert med fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, enkelt CD44
lyse og CD44
dim-celler ble sådd ut ved en tetthet på 300 celler per brønn, i ultralav feste seks-brønners plater (Ultra lave klase plater, biovitenskap). Disse cellene ble dyrket i serumfritt DMEM /F12-medium (Invitrogen) supplert med 20 ng /ml EGF og 20 ng /ml bFGF i ti dager under normoxia betingelser før kulene ble evaluert under inverse miscopy og telles (mer enn 30 celler i et sfære ble ansett for å være en fullstendig kule). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter
Statistiske analyser
For hvert forsøk, data er vist som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter.; SPSS (versjon 16,0) ble anvendt for dataanalyser. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av enveis ANOVA test og Student
t
-test (
P
0,05 ble ansett statistisk signifikans).
Resultater
hypoksi induserer ekspresjon av HIF-1α, HIF-2α, Oct3 /4 og Nanog
HIF-1α og HIF-2α, de store transkripsjonsfaktorer som svarer på hypoksi, ble undersøkt i menneskelige prostata kreft celler PC- 3 og DU145 som ble utsatt for forskjellige oksygentrykk for variable tidsperioder. Ved 20% O
2 spenninger, HIF-1α og HIF-2α ble svakt uttrykt både på mRNA og protein nivåer; relativt høyere nivåer av HIF-1α og HIF-2α uttrykk ble observert på 7% O
2 spenning, og de høyeste nivåene ble sett ved 1% O
2 spenning (figur 1A). Ved redusert oksygen spenningsnivåer, ble disse to faktorene allerede oppregulert etter 6 timer med dyrking. Deres uttrykk nådde det høyeste nivået på 12 timer med dyrking på 7% O
2 spenning, men nådde høyeste nivå bare 6 timer med dyrking på 1% O
2. Proteinekspresjon etter 48 timer med dyrking ved forskjellige oksygentrykk ble også studert ved immunocytokjemi (figur 1B). Uttrykk for HIF-1α og HIF-2α var gjennomgående høyere i hypoksi-behandlede celler, i forståelse med de funnene som oppnås ved RT-PCR og immunoblotting.
(A) I forhold til cellene dyrket ved 20 % O
2, cellene dyrket i 7% O
2 viser høyere nivåer av HIF-1α og HIF-2α, og cellene ble dyrket ved 1%, O
2 viser de høyeste nivåene av HIF-1α og HIF-2α av både RT-PCR og immunblotting. (B) Immunocytochemistry avslører høyere nivåer av HIF-1a og HIF-2α uttrykk i cellene dyrkes under 7% O
2 og de høyeste nivåene av HIF-1a og HIF-2α uttrykk i cellene dyrkes under 1% O
2 for begge cellelinjer. Bryst karsinom seksjonene ble brukt som positive kontroller for både HIF-1α og HIF-2α. Alle bildene ble opprinnelig tatt på 200 × og alle innfellinger ble tatt på 400 ×.
Oct3 /4 og Nanog blir ofte brukt som markører for udifferensierte celler og spiller en viktig rolle i å opprettholde kapasitet selvfornyelse hos voksne stamceller [31], [32]. Uttrykkene for disse transkripsjonsfaktorene ble også undersøkt i PC-3 og DU145 celler som ble dyrket ved forskjellige oksygentrykk. At både mRNA og proteinnivå (Figur 2A), svake uttrykk for Oct3 /4 og Nanog ble avdekket i disse to cellelinjer dyrket ved 20% O
2 spenning, mens deres uttrykk ble oppregulert i celler dyrket underkant av 7% og 1% O
2 forhold. I begge cellelinjene, har uttrykkene for disse to faktorene var høyere ved 1%, O
2 enn 7% O
2. Som det også ble observert i immunoblottingforsøk analyser (figur 2A), Oct3 /4 og Nanog begynte å øke så tidlig som 6 timer etter at cellene ble overført til 1% O
2, og nådde maksimumsnivåer etter 12 timer for begge celle linjer. Når cellene ble plassert i 7% O
2, uttrykkene for disse to faktorene ble også betydelig forhøyet etter 6 timer og nådde de høyeste nivåene i 12 timer dyrking; Men disse uttrykk nivåer var svakere enn de som ble observert i celler eksponert for 1% O
2. Lignende resultater ble også oppnådd ved immunocytokjemi (figur 2B). Etter eksponering for hypoksisk tilstand, forbedret Oct3 /4 og Nanog uttrykk som ble observert i både PC-3 og DU145-celler.
(A) I forhold til cellene dyrket ved 20% O
2, cellene dyrket på 7% O
2 viser høyere nivåer av Oct3 /4 og Nanog uttrykk, og cellene dyrket på 1% O
2 viser de høyeste nivåene av Oct3 /4 og Nanog uttrykk i PC-3 og DU145 celle linjer ved både RT-PCR og immunoblotting. (B) Immunocytochemistry avslører tilsvarende høyere nivåer av Oct3 /4 og Nanog uttrykk på 7% O
2 og de høyeste nivåene av Oct3 /4 og Nanog uttrykk på 1% O
2, i forhold til cellene dyrket på 20% O
2 for begge cellelinjer. Humane seminom vevssnitt ble benyttet som positive kontroller for disse to antistoffer. Alle bildene ble opprinnelig tatt på 200 × og alle innfellinger ble tatt på 400 ×.
For å finne ut om de forhøyede
Nanog
uttrykk ble hentet fra
NANOG1
eller
NANOGP8
, analyser kvantitativ RT-PCR ble videre utført, med de tilsvarende cellene dyrkes under normoxia som kalibratorer. Det ble gjentatte ganger bekreftet at
NANOG1
uttrykk i cellene i henhold normoxia var på svært lavt nivå, med gjennomsnittlig Ct verdier 37,24 og 37,37 for PC-3 cellers og DU145 cellene, henholdsvis. Men
NANOGP8
uttrykk i cellene under normoxia var relativt høy, med gjennomsnittlig Ct verdier 33,56 og 33,51 for PC-3 cellers og DU145 cellene, henholdsvis. Selv om høyere nivåer
NANOG1 Hotell og
NANOGP8
uttrykk kunne observeres i begge cellelinjene etter hypoksi, den forhøyede
Nanog
uttrykk ble bekreftet overveiende
NANOGP8
, med opp til seks ganger og 10 ganger økning i uttrykk i PC-3 og DU145 cellene under 1% O
2, henholdsvis (figur 3). Siden
NANOG1
uttrykk i cellene under normoxia var ekstremt lav, 2,6 ganger og 3,1 ganger økning i uttrykket av dette genet i PC-3 og DU145 cellene under 1% O
2 representert fortsatt ganske lavt uttrykk nivå.
i forhold til de cellene under normoxia, er det forhøyede
NANOG1 Hotell og
NONOGP8
uttrykk i cellene under 7% O
2 for begge cellelinjer, med opptil 1,8 ganger økning
NANOG1
uttrykk og opp til 2,5 ganger
NONOGP8
økning i begge cellelinjer; cellene under 1% O
2 uttrykke enda høyere nivåer av
NANOG1 Hotell og
NONOGP8
, med 2,6 ganger og 3,1 ganger økning i
NANOG1
uttrykk i PC-3 og DU145 cellelinjer, henholdsvis, og med seks ganger og 10 ganger økning i
NONOGP8
uttrykk i PC-3 og DU145 cellelinjer, henholdsvis.
hypoksi øker kolonidannelse evne og strekker G
0 /G
en scene
Siden hypoksi øket ekspresjon av stemness faktorer, ved siden undersøkte vi hvorvidt hypoksi påvirket proliferasjonen av disse cellene. PC-3 og DU145-celler ble dyrket i henhold til normoxia (20% O
2) eller hypoksi tilstander (1% O
2 og 7% O
2) i 48 timer for proliferasjonsanalyse. Som vist i figur 4A, for hver cellelinje var der ingen statistisk signifikante forskjeller i proliferasjon av de cellene dyrket på forskjellige oksygentrykk (
P
0,05), selv om cellene vokste noe langsommere i henhold til hypoksi enn normoxia. Deretter spurte vi om hypoksi-forbehandling kan påvirke clonogenicty i disse cellene. Cellene ble først utsatt for forskjellige oksygentrykk i 48 timer, etterfulgt av overføring til en normoksisk kammeret (20% O
2) i 14 dager for kolonidannelse analysen. Sammenlignet med de celler som ble jevnt kultivert ved 20% O
2, ble flere kolonier observert i celler som ble forbehandlet ved 7% O
2, og enda flere kolonier ble observert i cellene forbehandlede ved 1% O
2 (figur 4B). Sammenlignet med de cellene alltid dyrkes under normoxia, statistisk signifikant høyere kolonidannelse effektivitet ble identifisert i den hypoksi-forbehandlet PC-3 og DU145 alen (figur 4C). Cellecyklus analyser viste en forlenget G
0 /G
1 stadium i celler som ble utsatt for 1% O
2 i 48 timer sammenlignet med cellene dyrket ved 20% O
2 så kontroller (
P
0,05). (Figur 4D og E), som indikerer flere celler i en hvilende status etter hypoksi
(A) celleproliferasjon kurvene viser ingen statistisk forskjell for cellevekst i henhold forskjellige oksygen spenninger (
P 0,05
). (B) kolonidannelse assay for begge cellelinjer viser flere kolonier i cellene forbehandlet ved 7% O
2 i 48 timer og enda flere kolonier i cellene forbehandlet på under 1% O
2 (C ) Histograms for kolonidannelse effektivitet viser statistisk høyere effektivitet i cellene pre-behandlet i henhold til hypoksi (7% eller 1% O
2) for begge cellelinjene (
P
0,0001). (D) Strømningscytometri viser forlenget G
0 /G
en scene for begge cellelinjer som er blitt dyrket på under 1% O
2 til 48 timer, sammenlignet med cellene alltid holdes under normoxia. (E) Statistiske analyser viser betydelig utvidet G
0 /G
en scene i cellene dyrkes under hypoksi for begge cellelinjer (
P
0,05).
Hypoksi øker fraksjonen av celler med stilk-lignende fenotype
Side populasjonsceller, antas å inneholde antatte prostatakreft stamceller, er kjent for å pumpe ut fargestoffet Hoechst 33342 [20], [33]. Celler som utviser denne aktiviteten ble videre undersøkt under dyrking på ulike oksygen spenninger. Høyere fraksjoner av disse side populasjons celler ble observert i kulturer som ble holdt ved 1% O
2 spenning i 48 timer i forhold til cellene dyrket ved 20% O
2 (figur 5A og B).
PC-3 og DU145-celler ble dyrket i 1% O
2 og 20% O
2 coditions i 48 timer for å analysere stilk-lignende fenotype ved strømningscytometri-analyse. (A) De representative bildene viser at siden befolknings celler ble indusert i begge cellelinjene etter hypoksisk behandling. (B) Statistisk analyser viser signifikant forskjell i side befolkningen. (C) Strømningscytometri-analyser viser høyere nivåer av ekspresjon ABCG2 intensitet i begge cellelinjene under hypoxi. (D) Histogram viser statistisk signifikant forskjell i ABCG2 uttrykk. (E) Strømningscytometri analyser viser høyere CD44 ekspresjon intensitet i begge cellelinjene under hypoxi. (F) Histogram viser statistisk signifikant forskjell i CD44 uttrykk.
ABCG2 og CD44 har blitt beskrevet som prostata kreft stamceller lignende markører basert på kliniske undersøkelser og studier i prostatakreft cellelinjer [19], [ ,,,0],33]. Derfor ABCG2 og CD44 uttrykk i PC-3 og DU145 cellene som ble inkubert ved 1% eller 20% O
2 spenninger i 48 timer ble undersøkt med flowcytometri. Som vist i figurene 5C og D, kastet var 1,20 ganger og 1,42 ganger økning i ABCG2 ekspresjon i PC-3 og DU145-celler på under 1% O
2, henholdsvis, i forhold til cellene alltid dyrkes under normoxia. Likeledes var det 1,50-fold og 1,45-gangers økning i CD44 ekspresjon i PC-3 og DU145 celler under 1% O
2, henholdsvis, i forhold til cellene alltid dyrkes under normoxia (figurene 5E og F).
Siden hypoksi kan indusere både ABCG2 og CD44 uttrykk i begge cellelinjene, vi videre undersøkt forholdet mellom CD44 og ABCG2. Dobbel farging av disse to overflatemarkører avslørte at hypoksi-indusert ABCG2
+ celler var primært CD44
lyse celler og CD44
dim cellene under den samme kulturen tilstanden var for det meste negative for ABCG2 uttrykk (Figur 6A ).
(A) Double farging av CD44 og ABCG2 overflatemarkører med flowcytometri analyse viser høyere nivåer uttrykk for disse faktorene i begge cellelinjene under hypoxi i 48 timer.
