Abstract
Yuanhuacine (YC), en daphnane diterpenoid fra blomster av
Daphne genkwa
, viste en potensiell veksthemmende aktivitet mot humant ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler. YC også undertrykt invasjonen og migrasjon av lungekreft celler. Men den presise molekylære mekanismer gjenstår å bli belyst. I denne studien rapporterer vi at YC betydelig aktivert AMP-aktivert protein kinase (AMPK) signalveien og undertrykte mTORC2-mediert nedstrøms signalveien i H1993 humane NSCLC-celler. AMPK spiller en viktig rolle i energiomsetningen og kreft biologi. Derfor kan aktivatorer av AMPK signalveier kunne anvendes til behandling av kreft. YC forbedret uttrykk for p-AMPKα. Samtidig behandling av YC og sammensatte C (en AMPK hemmer) eller metformin (et AMPK aktivator) også bekreftet at YC øker p-AMPKα. YC også undertrykt aktiveringen av mammalian target of rapamycin (mTOR) uttrykk, et nedstrøms mål av AMPK. Videre studier viste at YC modulerer mTORC2-forbundet nedstrøms signalveier med redusert uttrykk for p-Akt, p-protein kinase C alfa (PKCα), p-ras-relaterte C3 botulinumtoksin substrat 1 (Rac1) og trådformede aktin (F- aktin) som er kjent for å aktivere cellevekst og organisere aktin cytoskjelettet. I tillegg, YC hemmet tumorvekst i H1993 celle-xenograft implantert naken mus-modellen. Disse dataene antyder YC kan være en potensiell kandidat for kjemoterapeutika avledet fra naturlige produkter ved å regulere AMPK /mTORC2 signalveien og aktin cytoskjelettet organisasjon
Citation. Kang JI, Hong JY, Lee HJ, Bae SY, Jung C, Park HJ, et al. (2015) Anti-tumor aktivitet av Yuanhuacine ved å regulere AMPK /mTOR signalveien og Actin Cytoskjelett Organization i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 10 (12): e0144368. doi: 10,1371 /journal.pone.0144368
Redaktør: Cong Cao, Suzhou universitet, KINA
mottatt: 10 februar 2015; Godkjent: 17 november 2015; Publisert: 11.12.2015
Copyright: © 2015 Kang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2013R1A1A2012389 og nr 20100024361) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de vanligste sykdommer i verden og den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall [1]. Det er to hovedformer for sykdommen, småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), hvor NSCLC er ca 85% av alle lungekrefttilfeller. Sammen med kirurgi og radioterapi, kjemoterapi er en av de mest vanlige behandlinger for lungecancerterapi. Imidlertid er kjemoterapi fortsatt ikke effektive nok for pasienter med avansert NSCLC med en median overlevelse på rundt ett år [2, 3]. Derfor er utvikling av nye potente legemidler mot kreft fortsatt behov for å behandle sykdommen.
Daphne genkwa plakater (tysbastfamilien) er en velkjent tradisjonell medisinsk plante distribuert hovedsakelig i Korea og Kina, og blomsten har blitt rapportert å vise abort, anti-kreft, hostedempende, vanndrivende, og slimløsende aktiviteter [4]. Flere forbindelser inkludert daphnane-type diterpenes har blitt isolert fra
D
.
genkwa product: [5]. Daphane-type diterpenoids viste ulike biologiske effekter inkludert anti-kreft, transient receptor potensielle kasjon kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1) aktivering, anti-fruktbarhet, plantevernmidler, neurotrophic, kolesterolsenkende, anti-hyperglykemiske, irriterende, tumor-fremme, og anti-human immunsviktvirus (HIV) aktiviteter [6]. Yuanhuacine (YC) er en viktig komponent i daphnane-type diterpenoids isolert fra blomsterknopper av
Daphne genkwa
. YC viste at anti-cancer-aktivitet i forskjellige kreftcellelinjer
in vitro product: [7]. Vi har også rapportert at YC oppviser det forholdsvis selektiv vekst inhiberende aktivitet mot humane A549 lungekreftceller sammenlignet med MRC-5 normale lunge epitelceller [8]. Imidlertid har den underliggende molekylære mekanisme av YC i humane lungekreftceller ikke blitt klarlagt ennå.
AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) er et allestedsnærværende serin /treonin proteinkinase som utgjøres av en katalytisk α subenhet og to regulator subenheter (p og y) [9], og er kjent for å regulere cellulære energimetabolismen [10, 11]. Aktivering av AMPK er forårsaket av cellulært stress slik som oksidativt stress, hypoksi, hypoglykemi og, og det fører til øket forhold mellom celle adenosinmonofosfat (AMP) og adenosin trifosfat (ATP). AMPK også kontrollerer cellevekst, proliferasjon og autophagy gjennom modulering av pattedyr målet for rapamycin (mTOR) aktivitet, som er forenlig deregulert i kreftceller [12]. Det finnes to typer av mTOR, mTORC1 og mTORC2 som er strukturelt og funksjonelt forskjellige multiproteinkomplekser [13]. Vanligvis styrer mTORC1 cellevekst som følge av næringsstoffer og vekstregulerende. I kontrast er mTORC2 en viktig regulator av aktin cytoskjelettet som er korrelert med kreftmetastaser, og styrer fosforylering av Akt i Ser-473 gjennom samspillet mellom rapamycin-insensitive følgesvenn av mTOR (rictor) og mTOR [14, 15].
i denne studien, anti-tumor aktivitet av YC og dens underliggende molekylære virkningsmekanismer ble undersøkt både i menneskelige H1993 lungekreftceller
in vitro
kultur og i H1993-implantert xenograft naken mus modellen
in vivo
.
Materialer og metoder
Reagenser
dimetylsulfoksid (DMSO), bicinchoninic syre (BCA), trikloreddiksyre (TCA), sulforhodamin B (SRB), og katalase ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, føtalt bovint serum (FBS), trypsin-EDTA-oppløsning (1X ), ble antibiotika-antimykotisk oppløsning (100X) og fosfatbufret saltløsning (PBS) (1X) innkjøpt fra HyClone Laboratories, Inc. (South Logan, UT, USA). Anti-p-AMPKα, anti-AMPKα, anti-p-ACC, anti-ACC, anti-p-mTOR, anti-mTOR, anti-p-4EBP1, anti-4EBP1, anti-p-eIF4E, anti-eIF4E, anti-p-P70S6K1, anti-P70S6K1, anti-p-RPS6, anti-RPS6, anti-rictor, anti-p-Akt, anti-Akt, og anti-E-cadherin ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA , USA). Anti-PKC-α, anti-p-Rac1, anti-Rac1, anti-PCNA, anti-β-aktin, og alle sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. (Santa Cruz, CA, USA). Anti-p-rictor ble kjøpt fra Millipore (Temecula, CA, USA). Anti-p-PKC-α, anti-F-aktin, og anti-Ki-67 ble innkjøpt fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Gefitinib ble kjøpt fra Selleckchem (Houston, Texas, USA) og rapamycin ble kjøpt fra Tocris Biovitenskap (Bristol, UK).
Compound
Yuanhuacine (YC, fig 1A) ble isolert og identifisert fra blomster av
Daphne genkwa
som beskrevet tidligere [8]. Forbindelsen ble oppløst i 100% dimetylsulfoksid (DMSO) og fortynnet med medium for prøvepreparering.
(A) Den kjemiske strukturen til YC. (B) H1993-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av YC og gefitinib i 72 timer. Celleproliferasjon ble målt ved SRB-analysen. (C) H1993-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av YC i de angitte tidsrom, og celle proliferasjon ble bestemt ved SRB-analysen. (D) ble det observert morfologiske forandringer formidlet ved behandling av YC i 24 timer under fasekontrastmikroskop.
Cell Culture
humane NSCLC-cellelinjer (H358, H460, Calu-1, H1299, A549, og H1993 celler) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellene ble dyrket i RPMI1640 supplementert med 10% FBS og antibiotika-antimykotika (PSA; 100 enheter /ml penicillin G-natrium, 100 ug /ml streptomycin og 250 ng /ml amfotericin B) i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO
2.
Cell Proliferation Assay
effekten av YC på celleproliferasjon ble evaluert av SRB cellulært protein-farging metode. Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater med forskjellige konsentrasjoner av prøvene og inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Etter 72 timers inkubering ble cellene fiksert med 10% TCA-løsning i 30 minutter og farget cellulære proteiner med 0,4% SRB i 1% eddiksyre-løsning i 1 time. De fargede celler ble oppløst i 10 mM Tris-buffer (pH 10,0). Effekten av prøvene på cellelevedyktighet ble beregnet som en prosentandel i forhold til løsningsmiddel-behandlet kontrollgruppe. IC
50 verdier ble beregnet ved ikke-lineær regresjonsanalyse ved hjelp av tabellen Curve 2D v5.01 programvare (Systat Software Inc., Richmond, CA, USA).
Western Blot og Immunoutfellingsanalyse
for western blot-analyse ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av prøvene ble lysert og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved BCA-metoden. Total proteiner (40 ug) i hvert cellelysat ble utsatt for oppløsning av forskjellige konsentrasjoner (6-15%) av natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) og elektro-overført på PVDF-membraner. Membranene ble inkubert med blokkeringsbuffer (5% bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltvann og Tween 20 (TBST) i 1 time ved værelsestemperatur og deretter ytterligere inkubert med spesifikke antistoffer fortynnet i 2,5% BSA i TBST over natten ved 4 ° C. etter vask med TBST ble membranene inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur og visualisert ved HRP-kjemiluminescens deteksjon kit (Lab Frontier, Seoul, Korea) ved anvendelse av LAS-4000 Imager ( Fuji Film Corp., Japan).
for immunoprecipitation for den kulturelle medium, cellesupernatanten ble filtrert gjennom et 0,2 mikrometer filter, og protease og fosfatase-hemmere (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) var enn lagt . for immunoutfelling av de dyrkede celler, ble cellene lysert i IP-lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, og 0,5% NP-40) inneholdende protease og fosfatase-inhibitorer. Den filtrerte kulturmedium eller like stor mengde av cellelysater ble forbehandlet i 30 minutter ved 4 ° C med protein G Sepharose 4FastFlow (GE Healthcare, Little Chalfront, UK). Etter fjerning av kuler (10 minutter, 12000 rpm, 4 ° C) ble supernatanten inkubert med den indikerte antistoff over natten ved 4 ° C. Den immunologiske kompleks ble samlet opp med glassperler ved 4 ° C i 2 timer. Kulene ble vasket fire ganger med IP-lyseringsbuffer, og de bundne proteinene ble eluert med 2 x Laemmli-prøvebuffer ved 95 ° C i 10 min. De oppsamlede proteinprøver ble underkastet Western blot-analyse.
Immunocytochemistry.
H1993 cellene ble sub-dyrket på dekkglass belagt med poly-L-lysin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i en 12-brønnen kultur parabolen. De behandlede celler ble vasket tre ganger med kald PBS, og ble fiksert i 2% para-formaldehyd i 15 min, etterfulgt av permeabiliseringen med 0,5% Triton X-100 i PBS i 5 min. Cellene ble deretter vasket med 0,1% Triton X-100 i PBS (PBS-T) og inkubert i blokkeringsoppløsning (3% BSA og 1% normalt geiteserum i PBS-T) i 1 time. Primære antistoffer ble tilsatt til den blokkerende oppløsning, og cellene ble inkubert i 1 time ved 37 ° C. Etter vasking med PBS-T tre ganger, ble cellene inkubert med passende sekundære antistoffer i blokkeringsløsning i 45 minutter ved romtemperatur. De merkede cellene ble vasket med PBS-T for seks ganger og ble montert sammen med monterings løsning [100 mg /ml 1, 4-diazabicyklo [2.2.2] oktan (DABCO) i 90% glycerol]. Glassene ble observert med en LSM710 laser scanning confocal mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).
Cell Migration analysen
For å vurdere effekten av YC på celle migrasjon, en sårheling analysen ble utført som beskrevet tidligere [16]. I korthet ble H1993-celler sådd ut i seks-brønns plater og inkubert i 48 timer inntil de nådde 80-90% Confluences. En konfluent monolag av H1993-celler ble kunstig såret med en mikropipette spissen, og de frittliggende cellene ble vasket med serumfritt RPMI 1640 og behandlet med testforbindelser i vekstmedium i 24 timer. Cellene ble vasket to ganger med PBS. Bilder av sårene ble fotografert på 0 og 24 timer under en invertert mikroskop (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan).
Cell Invasion analysen
Effekten av YC på celle invasjon ble utført ved hjelp de H1993-celler som tidligere beskrevet [17]. Cellene ble sådd på toppen kamrene i en 24-brønners Matrigel-belagte polyetylentereftalat-membraninnsatser med 8 um porer (Millipore, Billerica, MA, USA). Platene ble belagt med 10 ul av type I kammer i Matrigel-belagte transwell innsats. Mediet fra de nedre kamre ble også inneholdt 0,1 mg /ml bovint serumalbumin som et kjemotiltrekkende. Cellene ble inkubert i 48 timer ved 37 ° C. Cellene som hadde invadert den ytre overflate av membranen ble fiksert med metanol og farget med hematoksylin og eosin, og fotografert (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan).
Analyse av legemiddelkombinasjon
cellene (5 x 10
4 celler /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater med forskjellige konsentrasjoner av YC og rapamyacin eller gefitinib. Etter 48 timers inkubering, ble celleproliferasjon bestemt ved anvendelse av SRB-analysen. Kombinasjonen Effekten ble evaluert ved å beregne kombinasjon indeks (CI) verdier som følger: CI = D
1 /(D
x)
1 + D
2 /(D
x)
2, hvor D
1 og D
2 er konsentrasjonene av de kombinerte testforbindelsene som oppnår den forventede effekten, og (D
x)
1, og (D
x )
2 er de konsentrasjonene som oppnår lignende virkninger når testforbindelsene anvendes alene. I denne studien ble 50% inhibering tatt som det effektive nivå. CI-verdier ble sammenlignet med referanseverdiene rapportert av Chou [18].
In Vivo Tumor Xenotransplantat Study
Kvinnelige naken mus [5 uker gamle, BALB /c-v (nu /nu )] ble kjøpt fra Central Laboratory Animal, Inc (Korea) og vedlikeholdes i patogenfrie forhold. Alle dyreforsøk og omsorg ble gjennomført på en måte som samsvarer med retningslinjene for Animal Care og bruk komité Ewha Womans University. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Ewha Womans University. H1993 cellene ble injisert subkutant inn i kolber til musene (1 x 10
7-celler i 200 ul medium), og tumorene ble tillatt å vokse. Når tumorvolumet nådd ca 90 mm
3, medikamentell behandling ble igangsatt. Musene ble randomisert inn i kjøretøyet kontroll- og behandlingsgrupper på fem dyr pr hverandre. YC (0,5 eller 1,0 mg /kg kroppsvekt) eller gefitinib (10 mg /kg kroppsvekt) ble oppløst i et volum på 100 ul av oppløsning (etanol-Tween 80-H
2O, 1: 1: 98) ble administrert oralt en gang om dagen i 21 dager. Kontrollgruppen ble behandlet med et like stort volum bærer av DMSO. Tumorvolum ble overvåket i 21 dager hver 4 ~ 6 dager ved hjelp calipers, og tumorvolumet ble beregnet i henhold til følgende formel: tumorvolum (mm
3) = 3,14 x L x W x H /6, hvor L er lengde, er W bredde, og H er høyden.
Immunohistochemistry av svulster
skåret tumorvev ble fiksert i 4% paraformaldehyde (PFA) og innebygd i parafin. Serie deler av den innebygde prøvene ble deparaffinized, utvannet, og utsatt for antigen gjenfinning. Glassene ble inkubert med antistoffer, som ble detektert ved bruk av LSAB + System-HRP kit (Dako, Glostrup, Danmark) og motfarget med hematoksylin. Fargete snitt ble observert og fotografert under en omvendt fase-kontrast mikroskop.
Ex vivo biokjemisk analyse av tumorer.
En porsjon av den frosne tumorer skåret ut fra hårløse mus ble tint på is og homogenisert ved hjelp av en homogenisator i Komplett Lysis Buffer (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Tumor lysater ble underkastet proteinkonsentrasjonsbestemmelse analyser og aliquoter ble lagret ved -80 ° C.
Statistical Analysis
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard avvik (S.D.). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Student
t-
test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på
* p
0,05,
** p
. 0,01
Resultater
veksthemmende effekter av YC i H1993 dyrkede celler
Vårt tidligere studier har vist at GK har en forholdsvis selektiv veksthemmende aktivitet mot humane lungekreftceller sammenlignet med normale lunge epitelceller [8]. Derfor, i denne studien, utvidet vi å evaluere den anti-proliferative aktivitet av YC i forskjellige NSCLC-cellelinjer. YC oppviste et potensielt veksthemmende aktivitet i dyrkede humane NSCLC-celler (tabell 1). Spesielt ble det H1993 cellelinjen vist seg å være den mest følsomme med IC
50 verdi på 9 nM, etter 72 timers inkubering, og YC syntes å være mer potent enn gefitinib, et anticancer medikament for behandling av NSCLC i klinikk, under samme eksperimentelle tilstand (figur 1B). Ved behandling med forskjellige konsentrasjoner av YC for flere tidspunkter (24, 48 og 72 h), YC hemmet proliferasjonen av H1993-celler i en treringstrinnet og tidsavhengig måte (figur 1C). På grunn av at H1993 cellelinjen var den mest følsomme celle til YC, ble mekanismen handling studien for den anti-proliferative aktivitet av YC utført i H1993 cellene.
De morfologiske endringer av YC-behandlede celler det ble observert under fasekontrastmikroskop etter 24 timers inkubering. Celle tallene ble redusert i en konsentrasjonsavhengig måte, og den polygonale form av kontrollceller ble forandret til snøringen og uregelmessig dendritt-form av celler (figur 1D).
Effekter av YC på AMPK signalveien
for ytterligere å belyse anti-proliferative mekanisme YC, regulering av celle signaltransduksjonsbane assosiert med kreft celle vekst ble analysert ved hjelp av Western blot. AMPK er ansett som en viktig molekyl som kontrollerer cellevekst, proliferasjon, og autophagy. Etter 24 timers behandling med YC, proteinnivået p-AMPK ble betydelig øket, og nivået av p-acetyl-CoA-karboksylase (ACC), en nedstrøms mål for AMPK, ble deretter redusert i en konsentrasjonsavhengig måte (fig 2A ). Siden AMPK aktivering er et meget tidlig begivenhet [19, 20], ble aktivering av AMPK ved YC også overvåkes i løpet av en kort tidsperiode. P-AMPK nivået ble målt opp til 8 timer etter behandling av YC (1 uM). Proteininnholdet av p-AMPK ble signifikant økt etter 2 timers inkubering på en tidsavhengig måte i dyrkede YC-behandlede H1993 celler (figur 2B). Aktiveringen av AMPK ved YC ble ytterligere bekreftet med forbehandling av forbindelse C (en spesifikk hemmer av AMPK) eller metformin (en AMPK aktivator). De H1993 cellene ble forbehandlet med forbindelse C (20 uM) eller metformin (10 mM) i 1 time og deretter ko-behandlet med YC (1 uM) i ytterligere 2 timer. Forbindelse C undertrykket ekspresjon av aktivert AMPK (p-AMPK), men samtidig behandling av gjenvunnet YC den AMPK aktivering. Tilsvarende YC også betydelig forbedret metformin-mediert aktivering av AMPK (Fig 2C). I tillegg, YC aktivert effektivt p-AMPK nivå i forskjellige NSCLC-cellelinjer (figur 2D). Disse funnene antyder at AMPK kan være et målprotein i den anti-proliferative aktiviteten til GK i humane NSCLC-celler.
(A) H1993-celler ble behandlet i 24 timer med de angitte konsentrasjoner av YC, og proteinet var uttrykkene målt ved Western blot-analyse. (B) H1993-celler ble behandlet i forskjellige kort tidspunkter med 1 uM av YC og protein uttrykkene ble målt ved Western blot-analyse. (C) H1993-celler ble forbehandlet i 1 time med 20 uM av forbindelse C, som er en velkjent for AMPK-inhibitor eller 10 mM av metformin som er en AMPK aktivator. Deretter, 1 uM av YC ble behandlet eller ko-behandlet i 2 timer, og proteinet uttrykkene ble målt ved Western blot-analyse. (D) H358, H460, Calu-1, H1299, H1993 og A549-celler ble behandlet i 2 timer med 1 uM av YC og protein uttrykkene ble målt ved Western blot-analyse.
Effekter av YC på mTOR signalveien
det er vel kjent at AMPK regulerer negativt mTOR signalveien. Siden AMPK ble aktivert ved YC i H1993 cellene, vi videre undersøkt om YC påvirker også mTOR signalveien. Vi fant ut at YC downregulated aktivering av mTOR (p-mTOR (Ser2448)). Derfor mTOR-forbundet nedstrøms protein uttrykk ble videre bestemt. Siden YC ikke modulere nivåene av mTORC1-relaterte proteiner som 4E-bindende protein 1 (4EBP1), eukaryote translasjonsinitieringssete faktor 4E (eIF4E), p70S6 kinase-1 (p70S6K1), og ribosomalt protein S6 (RPS6) (fig 3A) , YC ble ytterligere analysert med hensyn til virkning på en annen mTOR kompleks, mTORC2, en modulator av aktin cytoskjelettet organisasjon. Som et resultat, YC trykkes mTOR autofosforylering ved Ser2481, en molekyl biomarkør for mTORC2 aktivitet (figur 3B). For å undersøke om YC hemmet mTORC2 aktivitet ved å påvirke foreningen av mTOR med rictor ble rictor immunopresipitert fra YC-behandlede celler, og mTOR og rictor antistoffer ble oppdaget av immunblot hhv. Som vist i figur 3C, YC forstyrret foreningen av mTOR og rictor, og disse hendelsene senere undertrykte aktivering av mTORC2-forbundet nedstrøms mål inkludert Akt, protein kinase C alfa (PKC-α), ras-relaterte C3 botulinum toxin substrat 1 (Rac1), og trådformede aktin (F-aktin) med YC behandling (figur 3B). YC aktivert også ekspresjonen av et celleadhesjonsmolekyl E-cadherin, en negativ regulator av F-aktin i H1993 celler (figur 3B). Den undertrykkende effekt av GK på ekspresjon av F-aktin ble også bekreftet ved immunocytokjemisk analyse (figur 3D), noe som tyder på at GK hemmer effektivt cytoskjelettet organiseringen av NSCLC-celler. Disse funn er i overensstemmelse med den observasjon av celle morfologiske endringer med behandling av YC i H1993 cellene.
(A) H1993-celler ble behandlet i 24 timer med indikerte konsentrasjoner av YC og uttrykkene mTORC1 signaleringsrelatert proteinene ble målt ved Western blot-analyse. (B) H1993-celler ble behandlet i 24 timer med indikerte konsentrasjoner av YC og av de mTORC2 signale-relaterte proteiner ble målt ved Western blot-analyse. (C) Interaksjonen av mTOR og rictor er blitt analysert ved immunoutfelling av rictor med følgende immunoblot av cellelysatene (nedre panel) og immunopresipitatene (øvre panel) med de angitte antistoffer. IP: immunoprecipitation. (D) H1993-celler ble behandlet i 24 timer med de angitte konsentrasjoner av YC og F-aktin-ekspresjon ble målt ved immunocytokjemi.
Effekter av YC på invasjon og migrering
Det er vel kjent at den asymmetriske akkumulering av F-aktin er forbundet med celle invasjon og migrering. YC trykkes uttrykk for F-aktin i NSCLC celler. Derfor vurderte vi videre effekten av YC på kreft celle invasjon og migrasjon. Behandlingen av YC i 24 timer hemmet migrasjon av kreftceller i en sårtilheling analyse på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 4A). I tillegg ble Matrigel invasjonen assay utført for å undersøke om YC påvirker invasivitet av ondartede kreftceller. YC hindret kreftceller fra å bevege seg inn i et kammer Matrigel i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 4B). Disse dataene tyder på at GK effektivt hemmet migrering og invasjon av kreftceller som er delvis forbundet med undertrykkelse av aktin cytoskjelettet organisasjon til ved nedregulering av F-aktin og oppregulering av E-cadherin uttrykk.
(A) H1993 cellene ble inkubert i en 12-brønners plate i 24 timer, såret med en gul spiss, og behandlet med de angitte konsentrasjoner av YC. Etter inkubering i 24 timer, cellene ble fotografert ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. (B) H1993-celler ble behandlet i 48 timer med de angitte konsentrasjoner av YC. Cellen invasjonen analysen ble utført i en Matrigel-belagte kammersystem som beskrevet i materialer og metoder.
Anti-proliferative effekter med kombinasjon av kjemoterapeutika
Vi har undersøkt effekten ytterligere av YC i kombinasjon med gefitinib eller rapamycin på H1993 celleproliferasjon. Flere studier har rapportert en positiv effekt av kombinasjonen av gefitinib, en EGFR-hemmer, med mTOR-hemmere i preklinisk modell. I denne studien viste at kombinasjonen av YC med gefitinib de betydelige synergistiske inhiberende effekt på H1993-celler (figur 5A). I tillegg vil kombinasjonen av rapamycin (en mTORC1 inhibitor) og YC effektivt inhiberte celleproliferasjon av H1993-celler, sammenlignet med rapamycin alene (figur 5B). Det er kjent at rapamycin blokker mTORC1 og hemmer ikke mTORC2. mTORC1 hemming uten å undertrykke mTORC2 kan aktivere PI3K /Akt og fremme svulst overlevelse. Derfor antyder dette resultatet at veksten inhibering av YC kombinasjon med rapamycin kan skyldes nedregulering av mTORC2 av YC.
Cellene ble behandlet med YC alene eller i kombinasjon med gefitinib eller rapamycin i 48 timer . Den celleformering ble målt ved bruk av et SRB-analyse. (A) YC i kombinasjon med gefitinib (B) YC i kombinasjon med rapamycin.
Hemmende effekt av tumorvekst ved YC i H1993 celler implantert xenograft mus modell
Den anti- tumor aktivitet av YC ble evaluert ved å bruke en
in vivo
nakne mus xenograft modell bærende H1993 celler. Når tumorvolumet nådde omtrent 90 mm
3 etter å ha implantert med H1993 cellene ble YC (0,5 eller 1 mg /kg av YC) eller gefitinib (10 mg /kg) oralt administrert til musene en gang om dagen i 21 dager. Tumorvolumet i den bærer-behandlede kontrollgruppe var ca. 750 mm
3 i 30 dager etter at cellene ble subkutant implantert i høyre flanke regionen av hver mus. Sammenlignet med de vehikkelbehandlede kontrollgruppene, YC vesentlig hemmet tumorvekst med 33,4% og 38,8% ved 0,5 mg /kg og 1,0 mg /kg, henholdsvis ved slutten av forsøkene (figur 6A). Tumorvekter ble også signifikant hemmet ved behandling av YC (figur 6B). Lignende resultater ble observert ved behandling av gefitinib (10 mg /kg). Ingen kroppsvekt endringer og åpenbar toksisitet ble funnet i
in vivo
eksperimenter med YC (Fig 6C).
(A) H1993 celler ble injisert subkutant inn i flankene av nakne mus og svulster, og fikk lov til å utvikle seg i 21 dager. Da de nådde ca 90 mm
3, de angitte konsentrasjoner av YC ble iverksatt. Alle studie medisiner ble gitt oralt en gang daglig i 21 dager. Tumor størrelser ble overvåket hver 4 ~ 6 dager. (B) Volumet og vekten av hver tumor xenograft ble målt ved avslutningen av eksperimentet på dag 21. (C) dyr i kontroll- og behandlede grupper ble veiet hver 4 ~ 6 dager. Den midlere kroppsvekt i hver gruppe er vist.
I tillegg har en biokjemisk analyse av tumorvev også bekreftet aktivering av AMPK ved behandling av YC ved hjelp av Western blot (Fig 7A) og immunhistokjemisk analyse (figur 7B) på en doseavhengig måte. YC også oppviste inhibering av ekspresjonen av de sprednings biomarkører Ki-67 (figur 7C), og prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) (figur 7D) i tumorvev. Disse data antydet at YC effektivt undertrykket tumorvekst av H1993-celler
in vivo
, og dens anti-tumor-aktivitet kan delvis være assosiert med aktivering av AMPK signalveien.
Proteinet ekstraktene ble avledet fra tumorvev av H1993 xenograft modell. (A) De AMPK uttrykk ble målt ved Western blot analyse. (B) Den p-AMPK uttrykk ble målt ved immunhistokjemi. (C) Ki-67-ekspresjon ble målt ved hjelp av immunhistokjemi. (D) PCNA uttrykk ble målt ved immunhistokjemi.
Diskusjoner
Naturlige produkter har blitt spilt en viktig rolle i legemiddelforskning og utvikling [21]. Spesielt har plantebaserte terrestriske naturlige produkter har vært verdifulle kilder til terapeutiske midler. Yuanhuacine (YC), en daphnane diterpenoid, er et prinsipp komponent av blomster av
Daphne genkwa
. Nyere studier av vår gruppe og andre rapporterte sterke anti-proliferative effekter av YC mot ulike kreftcellelinjer [8, 22-24]. En plausibel mekanisme omfatter målretting av topoisomerase-DNA komplekser, og YC er ansett som et DNA-ødeleggende middel [25]. YC viste også induksjon av G2 /M fase cellesyklus arrest i menneskelige blære og tykktarm kreft celler [26]. Men den nøyaktige molekylære mekanisme av YC i anticancer aktivitet av humane lungekreftceller, spesielt forble NSCLC cellevekst som skal belyses. Denne studien viser at YC regulerer AMPK /mTOR signalveien og hemmer aktin cytoskjelettet organisasjon i human lunge H1993 kreftceller.
Nyere studier viser at AMPK /mTOR signalveier er sterkt koblet i reguleringen av kreft celle vekst, proliferasjon og overlevelse. Spesielt aktivering av AMPK regulerer negativt kreftcellevekst gjennom nedstrøms mTOR signalveier [26]. Faktisk, mange naturlige produkter-avledet forbindelser inkludert galegine fra
Galega officin product: [27], resveratrol fra røde druer, quercetin til stede i mange frukter og grønnsaker, ginsenoside fra
Panax ginseng
, curcumin fra
Curcuma longa
, berberine fra
Coptis chinensis
, epigallocatechin gallate fra grønn te, theaflavin fra svart te [28], og hispidulin fra snø lotus [29] har vist anticancer aktivitet ved aktivering av AMPK veier. I denne studien fant vi også at YC aktiverer effektivt AMPK og nedregulerer de mTORC2-assosiert signalveier. Aktiveringen av AMPK ved YC ble funnet å være oppstått i en tidlig begivenhet i H1993 celler og aktivering av AMPK ble også bekreftet ved samtidig behandling med en AMPK-inhibitor (forbindelse C), eller en aktivator (metformin). Disse funnene antyder at den anti-proliferative aktivitet av YC er delvis forbundet med aktivering av AMPK i de humane NSCLC-celler.
AMPK viser mange nedstrøms mål for eksempel ACC, mTOR, p-p53, og COX 2 i kreftceller.
