Abstract
Gonadotropin-frigjørende hormon-I (GnRH-I) har vakt sterk oppmerksomhet som en hormonell terapeutisk verktøy, spesielt for androgen-avhengig prostata kreftpasienter. Imidlertid har androgen-uavhengighet av kreft i avansert stadium ansporet forskere til å se etter nye medisinske behandlinger. I tidligere rapporter har vi utviklet GnRH-II antagonist Trp-en til å hemme spredning og stimulere autophagic død av ulike prostata kreft celler, inkludert androgen-uavhengig celler. Vi har videre vist flere GnRH-II-antagonister for å identifisere molekyler med høyere effektivitet. Her undersøkte vi effekten av SN09-2 på vekst av prostata PC3 kreftceller. SN09-2 reduserte veksten av prostatacancerceller, men hadde ingen effekt på celler avledet fra andre vev. Sammenlignet med Trp-1, SN09-2 tydelig hemmet prostatacancer cellevekst, selv ved lave konsentrasjoner. SN09-2-indusert PC3 cellevekst inhibering ble assosiert med redusert membranpotensialet i mitokondriene, hvor antagonisten ble akkumulert, og økt mitokondrie og cytosoliske reaktive oksygenarter. SN09-2 indusert laktatdehydrogenase slipper inn i media og annexin V-flekker på PC3 celleoverflaten, noe som tyder på at antagonisten stimulert prostata kreft celledød ved å aktivere apoptotiske signalveier. Videre, cytokrom c frigjøring fra mitokondrier til cytosol og caspase-3 aktivering skjedde i en treringstrinnet og tidsavhengig måte. SN09-2 også hemmet veksten av PC3 celler xenotransplanted inn nakne mus. Disse resultatene viser at SN09-2 direkte induserer mitokondrie dysfunksjon og påfølgende ROS generasjon, som fører til ikke bare veksthemming, men også apoptose av prostatakreftceller
Citation. Park S, Han JM, Cheon J, Hwang JI , Seong JY (2014) apoptotisk død prostata kreft celler med et gonadotropinfrigjørende hormon-II antagonist. PLoS ONE 9 (6): e99723. doi: 10,1371 /journal.pone.0099723
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 6 februar 2014; Godkjent: 18 mai 2014; Publisert: 13 juni 2014
Copyright: © 2014 Park et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Basic Research Program (2013R1A2A2A01068295) av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT, og fremtidig planlegging og National R D Program for Cancer Control, Ministry of Health Velferd (0520270-1). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen som forekommer i det mannlige reproduksjonssystemet. Selv om de fleste prostata kreft er saktevoksende, kan de forårsake smerter og problemer med vannlating, og de mer aggressive de er sannsynlig å spre seg til andre deler av kroppen [1]. Globalt er prostatakreft den sjette største årsaken til kreft dødsfall hos menn [2], og i USA, er det rangert andre [3]. En vanlig behandling for avansert prostatakreft er hormonbehandling kombinert med strålebehandling [4]. Hovedmålet med hormonbehandling er å fjerne eller redusere serum androgen, en potensiell vekst stimulerende for prostatakreft. Men i mange tilfeller er den innledende regresjon av tumorene fulgt av re-vekst uavhengig av androgennivåer, økt aggressivitet, og høy metastatisk aktivitet [5]. Av denne grunn er utviklingen av effektive legemidler for behandling av androgen-uavhengig prostatacancer er et viktig problem.
i hypothalamus-hypofyse-gonadal-aksen, gonadotropin-frigivende hormon-I (GnRH-I) syntetisert i hypothalamus stimulerer sekresjon av hypofyse gonadotropiner luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH), som i sin tur modulerer syntese og utskillelse av androgener, blant testosteron, fra testis [6]. Kronisk administrering av en GnRH-I agonist førte til nedregulering av GnRH-reseptoren i hypofysen, noe som resulterer i en markert reduksjon av sirkulerende androgen-nivåer [7]. GnRH-I-antagonister også redusert serum androgennivåer ved å inaktivere GnRH-reseptoren [6], [8]. Disse resultatene tyder på at hormonell behandling ved hjelp av GnRH-I agonister og antagonister er anvendbare for behandling av benign prostata hyperplasi, og androgen-avhengig prostata cancer. Videre har nyere studier vist at GnRH-I direkte påvirker både androgen-avhengige og androgen-uavhengig prostatakreftceller. GnRH-I agonister hemmet epidermal vekst faktor-insulin eller vekstfaktor-stimulert prostatacancer celleproliferasjon, og induserte apoptose av kreftceller under forhold med serum mangel [9], [10]. Disse effektene ble foreslått å være formidlet av GnRH-I-reseptor, som stimulerer G
i-bundet signale-avhengig aktivering av apoptose-relaterte proteiner, inklusive c-Jun NH
2-terminal kinase (JNK) [11 ]
i de fleste virveldyr, den andre typen av GnRH, kalt GnRH-II, er identifisert, som er strukturelt konservert i evolusjonen fra fisk til pattedyr [12] -. [14]. GnRH-II uttrykkes ikke bare i hjernen, men også i perifere reproduksjon og immun vev [15]. Denne brede uttrykksmønster kan gi en rekke fysiologiske funksjoner på peptidet. I likhet med GnRH-I, er GnRH-II i stand til å regulere reproduksjon hos kvinner ved å stimulere utskillelsen av LH og FSH [16], [17]. Selv om begge GnRHs handle om menneske granulosa-luteal celler, viser de ulike hormonelle regulerings mønstre [18], [19]. GnRH-II produsert av humane T-celler stimulerer laminin reseptor ekspresjon og cellevandring [20]. Interessant, GnRH-II-indusert laminin reseptoren uttrykk ikke er blokkert av GnRH-I antagonist cetrorelix, noe som tyder på at GnRH-II ikke interagerer med GnRH-I reseptor [20]. Nylig har vi og andre grupper identifisert GnRH-II-reseptoren i ikke-pattedyrarter. Reseptoren binder til GnRH-II med høyere sensitivitet og affinitet enn til GnRH-I [21], [22]. Videre ble en GnRH-II-spesifikk reseptor klonet fra ape og betegnes pattedyr-GnRH-II-reseptor [23]. Reseptoren er sterkt selektiv for GnRH-II og synes å være forskjellig fra den GnRH-I-reseptoren når det gjelder hurtig internalisering ved ligand-interaksjon og signalveier. Hos menneske er GnRH-II-reseptor-lignende gener lokalisert på kromosomer 1 og 14. Selv om mRNA for disse genene er uttrykt i mange vev, inkludert hjerne, og til og med i mange cellelinjer, synes de å være ikke-funksjonelle pseudogener som følge av et for tidlig stoppkodon [24], [25]. Fraværet av et funksjonelt G-protein-koblet reseptor for GnRH-II i human indikerer mulighet for andre typer av bindingspartnere på plasmamembranen, mens dens funksjonelle mediatorer forblir fortsatt ukjent.
Interessant GnRH-II oppviser evne til å inhibere proliferasjonen av eggstokkreft celler, så vel som prostatakreftceller [26], [27]. GnRH-II er sannsynlig å fungere på prostatakreftceller ved å samhandle med ukjente proteiner, basert på vår forrige observasjon at radiomerket GnRH-II ble i stand til å binde ulike menneskelige prostata kreft celler [27]. Denne binding ble fortrengt av umerket GnRH-II, men ikke av GnRH-I. Denne oppdagelse medfører at GnRH-II kan være et potensielt medikament for å behandle prostatakreft, selv om høyaffinitets binding av GnRH-II i prostatakreftceller ser ut til å være ikke som følge av ekspresjonen av en konvensjonell GnRH-II-reseptoren. Nylig har vi utviklet en ny GnRH-II-antagonist, kalt trptorelix-en (Trp-1). Trp-en er i stand til å indusere døden av androgen-avhengige og-uavhengig prostata kreft celler med underliggende mekanismer som mitokondriell dysfunksjon etterfulgt av reaktive oksygenforbindelser (ROS) og autofagi [28].
Vi syntetisert ekstra GnRH -II-antagonister for å sammenligne med de Trp-1-virkning og forbedrer den død virkning. Her presenterer vi en annen antagonist, SN09-2 som er i stand til å hemme spredning og indusere død i menneskelige prostata kreft celler med en høyere virkningsgrad enn for Trp-en. Videre de funksjonelle mekanismer av død er annen form Trp-1, og involverer aktivering av apoptotiske trasé.
Materialer og metoder
GnRH-II analoger og reagenser
GnRH-II-antagonist [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4CI) -D-Pal (3) -Ser-Phe-D-Lys-Trp-Tyr-Arg-D-Ala-NH
2], betegnet som SN09-2, og dens fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert formen ble syntetisert ved AnyGen (Gawngju, Korea). Trp-1 [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4CI) -D-Pal (3) -Ser-Tyr-D-Cit-Trp-Tyr-Pro-D-Ala-NH
2 ] ble også syntetisert av samme selskap [28].
mitokondriemembranen potensial detektor 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid (JC- 1), MitoTracker, og 2 «, ble 7»-dichlorfluorescein-diacetat (DCF-DA) som er kjøpt fra Invitrogen (Palo Alto, California, USA). Cellekulturmedier, inkludert Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ble oppnådd fra Welgene Inc. (Daegu, Korea). Føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin ble fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Alle reagenser inkludert Hoechst 33342, Annexin V-H
2o
2, og bovint serumalbumin ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO) med mindre annet er angitt. Antistoffer mot spaltede caspase-3, intakt caspase-3, og cytokrom C ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danver, MA, USA). Anti-p-aktin-antistoffer var fra Sigma.
Cellekultur
Alle cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PC3, LNCaP, DU145, og DLD1 cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 inneholdende 10% varme-inaktivert FBS, 100 enheter penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og fuktet 5% CO
2. HeLa-celler ble dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS under de samme betingelser.
reportergen assay
CV-1-cellene ble kulturen over natten i 24-brønners plater og deretter transfektert med liposom-kompleks som inneholder pGL3 /SRE-Luc plasmider med bull frosk GnRHR-II (bfGnRHR-II) eller grønn ape GnRHR-II (gmGnRHR-II). Ytterligere 48 timer senere ble cellene behandlet med GnRH-II (1 nM for bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II) og forskjellige konsentrasjoner av SN09-2 eller Trp-1 til 6 timer, vasket med PBS og solublized med lyseringsbuffer. Luciferaseaktiviteten av celleekstraktene ble bestemt ved å bruke standard luciferase-analysesystemet fra BioTek Instrument, Inc. (Winooski, VT). For å bestemme transfeksjonseffektiviteten, ble luciferase-aktivitet normalisert til den β-gal-aktivitet. Alle data er beregnet ut fra minst tre uavhengige eksperimenter normalisert til ubehandlede grupper.
Celleviabilitet assay
Cellene ble sådd ut i 12-brønners plater i triplikat (1 x 10
4 celler /godt). Etter 24 timer ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjoner av GnRH-II-antagonister oppløst i 0,1% DMSO hver 24 timer for det indikerte antall dager. Deretter ble cellene vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), dissosiert med trypsin /EDTA, og på nytt oppslemmet i 500 ul komplett vekstmedium. Trypanblått (0,4%) dye-ekskluderende celler ble telt under en invertert mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).
Laktat dehydrogenase utgivelsen analysen
Laktat dehydrogenase (LDH) aktivitetsanalyse ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). I korte trekk, ble PC3-celler sådd ut i 12-brønners plater ved 2 x 10
4 celler /brønn. Neste dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SN09-2 i 5% FBS-holdig RPMI 1640 i 3 dager. De kulturmedium ble overført til Eppendorf-rør og sentrifugert i 1 minutt ved 5000 rpm. Ett hundre mikroliter av hver supernatant ble overført til en optisk klar 96-brønns plate. Ett hundre mikroliter av nyfremstilt reaksjonsblanding ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 30 minutter ved 25 ° C. Absorbansen av prøvene ble målt ved anvendelse av bølgelengdefilter av ELISA-leser 490 nm.
Annexin V-farging assay
Apoptose av PC3-celler ble vurdert ved hjelp av en apoptose deteksjonssett (Koma Biotech, Seoul, Korea). Etter eksponering til SN09-2 i de angitte tidsrom eller ved forskjellige konsentrasjoner, ble PC3 cellene høstet og vasket med kald PBS og re-suspenderes i bindingsbuffer inneholdende fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert annexin V-protein og propidiumjodid. Annexin V bindende og PI farging ble bestemt ved flowcytometrisk analyse (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Apoptotiske celler ble definert som PI-negative og annexin V-positive.
Etter behandling med SN09-2, PC3-celler på poly-D-lysin-belagte dekkglass ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 min, vasket med PBS tre ganger og inkubert med Cy3-konjugerte annexin V. Cellene ble vasket med PBS og inkubert med kort Heochst33342 (10 ug /ml). Fargede celler ble visualisert under en LSM510 konfokal mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).
Western blot analyse
celler (5 × 10
4) ble belagt i 100 mm-retter . Den neste dag ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjoner av SN09-2 til forskjellige tider, høstet og inkubert med buffer inneholdende 10 mM HEPES (pH7.9), 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, og protease-inhibitor cocktail (Roche) i 30 minutter på is. Celler ble avbrutt med en Dounce homogenisator med 20 slag og sentrifugert ved 5900 ×
g
i 10 minutter for å samle cytosoliske fraksjonen. De resulterende pellets ble resuspendert i kald buffer, kort sonikert tre ganger, og ble sentrifugert ved 5.900 x
g
i 10 minutter for å oppnå rå mitokondrielle proteiner. Proteiner av hver fraksjon (20 ug) ble påført SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (12% gel) og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, Massachusetts). Membranene ble blokkert med 3% bovint serum albumin og inkubert med de aktuelle antistoffer. Etter vasking med Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween 20, ble membranene inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert sekundære antistoffer, og de signaler som ble detektert ved bruk av en forbedret kjemiluminescens-løsning (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, UK).
subcellulære lokalisering av SN09-2
To dager etter utsåing på poly-D-lysin-belagte dekkglass i 12-brønners plater, ble PC3-celler behandlet med 66 nM MitoTracker i 30 min og deretter med 10 mM FITC- SN09-2 i 10 minutter ved 37 ° C. Etter vasking med PBS ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 min. Kjerner ble farget med Hoechst 33342. Fluorescens signaler ble oppdaget under konfokal mikroskop.
Måling av mitokondriell membranpotensiale
Mitokondriell membranpotensialet ble målt ved hjelp av JC-1. Hos friske celler, JC-1 danner aggregater innenfor mitochondria, genererer rød fluorescens. Men under mitokondrie depolarisering, JC-1-monomerer diffundere gjennom hele cellen, fremstilling av grønn fluorescens. PC3-celler ble sådd ut på poly-D-lysin-belagte dekkglass i 12-brønners plater. Etter behandling med 10 uM SN09-2 i 3 dager, ble celler inkubert med PBS inneholdende JC-1 (2,5 ug /ml) i 20 minutter ved romtemperatur. Cellene ble vasket, fiksert med 4% paraformaldehyde, og observerte under konfokal mikroskop. Etter inkubasjon med JC-1, ble PC3 cellene løsnet fra fatet og søkt om fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse.
Perler konjugering og pull-down analysen
Perler konjugering av SN09- 2 ble utført som beskrevet i foregående papir [28]. I korte trekk, N-hydroxysunninimide-aktiverte Sepharose-kuler ble inkubert med SN09-2 i koblingsbuffer over natten ved 4 ° C, og deretter vasket med en buffer inneholdende 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5), og en buffer inneholdende 0,1 M acetat (pH 4,5) og 0,5 M NaCl. Membranfraksjonen av PC3-celler ble isolert ved homogenisering og sentrifugering. De resulterende pelleter ble oppløst i lyseringsbuffer inneholdende 1% Triton-X-100 og sentrifugert ved 20000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatantene ble inkubert med SN09-2-konjugert sepharose og vasket med lyseringsbuffer. Bunnfallet ble inkubert med 50 pM SN09-2 og supernatantene ble anvendt for SDS-PAGE og Western blotting med anti-GPR75-antistoffer.
Intracellulær ROS genererings
Reaktive oksygenarter (ROS) var målt ved hjelp av DCF-DA. PC3-celler (1 x 10
5) ble sådd ut på 60-mm skåler, dyrket i 5% FBS RPMI, og behandlet med SN09-2 i 3 timer. Etter inkubasjon med 5 uM DCF-DA i 30 minutter ved 37 ° C i mørke, ble cellene vasket, resuspendert i PBS, og deretter påført på FACS-analyse.
Immunocytochemistry
PC3 -celler (4 x 10
4) ble sådd ut på dekkglass i 12 brønners plater og behandle med 10 uM SN09-2 i 12 timer. Cellene ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter, permeabilisert med 0,2% Triton-X i PBS, vasket og blokkert med 3% BSA i PBS i 30 min. Polyklonale kaninantistoffer mot spaltede caspase-3 (1:200) og monoklonal mus anti-p-aktin antistoffer (1:1000) ble påført til cellene. Aktiv caspase-3 og β-aktin ble visualisert ved inkubering med både Alexa 594-konjugert anti-mus og Alexa 488-konjugert anti-kanin sekundære antistoffer i 1 time. Deretter ble cellene farget med Hoechst 33342 (1 mikrogram /ml) i 5 minutter, montert på lysbilder, og observerte under konfokal mikroskop.
In vivo
vekst av prostata kreft celler
Seks uker gammel mannlig atymiske nakne mus (BALB /c-nu) ble hentet fra Harlan (Houston, Texas). Mus ble holdt under spesifikke patogen-frie betingelser i et individuelt bur ventilert system. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført etter å ha fått godkjenning fra Institutional Animal Care og bruk Committee of Clinical Research Institute i Seoul National University Hospital. PC3-celler (6 x 10
6) ble injisert inn i den høyre flanken av musene. Ti dager etter celleinjeksjon, svulster med volum på rundt 20-25 mm
3 utviklet i de fleste mus; tumorvolumer ble målt hver dag. Tumor volum ble bestemt av to vinkelrette dimensjoner [lengde (
L
) og bredde (
W
)] og høyden (
H
), målt ved hjelp av Vernier calipers (den formelen er
V
= (π /6) x (
W
×
L
×
H
). Fra denne tiden, SN09-2 ( eddiksyre form) oppløst i 5% N, N-dimetylacetamid (DMA), 10% glycerol og 85% destillert vann som er biokompatibelt løsningsmidlet ble subkutant injisert inn i mus for 25 etterfølgende dager. den tumorstørrelse i hver mus ble målt hvert dag. Seks til syv mus ble brukt for hver forsøksgruppe.
Statistisk analyse
data ble analysert ved hjelp PRISM4 programvare (GraphPad). gruppe midler ble sammenliknet med Student
t
test eller enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni multippel sammenligning A
P-
verdi. . 0,05 ble akseptert som betydelig
Resultater
SN09-2 induserer prostatakreft celle -spesifikk død
Vi har tidligere rapportert at en roman GnRH-II antagonist Trp-1 indusert prostatakreft celledød [28]. For å identifisere mer effektiv molekyl, syntetisert vi 65 analoger basert på Trp-en struktur og vist sin død aktiviteter på PC3 og LNCaP uten giftige aktivitet på lunge fibroblast MRC-5. Til slutt, SN09-2 ble valgt som potensielt effektive GnRH-II-antagonist til å inhibere prostatacancer-cellevekst. I forrige reporter, identifiserte vi Trp-1 har antagonistisk aktivitet på GnRHR-II [28]. Vår nåværende reportergen analysen avslører at SN09-2 har også en potent antagonistisk aktivitet på GnRHR-II, selv sammenlignet med Trp-1 (fig. 1). SN09-2 antagonized effektivt effekten av GnRH-II på bull frosk GnRHR-II (IC
50 = 0,01 mm) og grønn ape GnRHR-II (IC
50 = 1,9 mm). Men Trp-1 hemmet aktivering av bare bull frosk GnRHR-II med høy potens (IC
50 = 0,25 mm). Sekvensene til GnRH-II, Trp-1, og SN09-2 ble beskrevet i fig. 2A. PC3-celler (androgen-uavhengig prostata cancer celler) ble behandlet med 10 uM SN09-2 i kulturmedier inneholdende forskjellige konsentrasjoner av FBS. I lave serumkonsentrasjoner (mindre enn 2%) SN09-2 induserte mer enn 95% veksthemming av PC3-celler i løpet av 4 dager. Og selv i høyere serumkonsentrasjoner, SN09-2 dramatisk inhiberte celleveksten med mer enn 85%, selv om inhibering ble svakt påvirket av serumkonsentrasjon (fig. 2B). Behandling med SN09-2 i 4 dager induserte 91% og 88% veksthemming av PC3-celler i 5% og 10% serum forhold, respektivt. Dette resultatet indikerer at SN09-2 regulerer negativt prostatacancer cellevekst i et serum-uavhengig måte. Deretter ulike kreftceller ble behandlet med 10 uM SN09-2 i 5% serum-inneholdende medium for å bestemme den prostatakreft celle-spesifikk effekt av den GnRH-II-antagonist. Tre dager etter behandling med SN09-2, ble veksten av PC3 og LNCaP-celler drastisk nedregulert, og at av DU145-celler ble også hemmet av ≈50%, noe som tyder på at følsomheten av prostatacancerceller til SN09-2 kan være forskjellige. Imidlertid veksten av celler fra andre vev så som HeLa (cervikal kreft) og DLD1 (tykktarmskreft) ble ikke påvirket av SN09-2 (Fig. 2C). Selv om flere celler bør testes, kan disse resultatene indikerer SN09-2 har prostatakreft cellespesifikke veksthemmende virkning.
Enten bfGnRHR-II eller gmGnRHR-II ble transfektert med SRE-Luc reporter i CV-1 celler . Celler ble behandlet med antagonister av forskjellige konsentrasjoner i nærvær av GnRH-II (1 nM for bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II).
(A) Molecular sekvenser av GnRH-II, trp-1, og SN09-2 (B) PC3-celler ble inkubert i RPMI-medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av FBS og eksponert for 10 uM SN09-2 i 4 dager. Antallet levedyktige celler ble tellet under et lysmikroskop. (C) PC3, Du145, LnCap, HeLa, og DLD1 celler ble inkubert med 5% FBS medium inneholdende 10 mM SN09-2 eller DMSO i 3 dager. (D) PC3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Trp-en eller SN09-2 i 3 dager, og deretter levedyktige celler ble tellet under lysmikroskop. Celletallet i hver gruppe ble sammenlignet med DMSO-behandlede gruppen. CTL: DMSO-behandlet. (E) PC3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SN09-2 i 3 dager. Ved hjelp av kultursupernatanter fra hver gruppe, ble LDH-aktivitet bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene er midler ± S.E. *,
p
0,05; **,
p.
0,01, versus kontroll
I en tidligere rapport, viste vi at Trp-1 hemmet spredning av PC3 celler [28]. For å undersøke vekstinhibering effektiviteten av GnRH-II-antagonister, tilsatte vi dem til PC3-celler dyrket i 5% serum tilstand i 3 dager. Sammenlignet med kontrollgruppene, begge antagonister betydelig svekket cellevekst på en doseavhengig måte. Videre er det i alle gruppene som ble behandlet med ulike konsentrasjoner, cellevekst var mer potent inhibert ved SN09-2 snarere enn Trp-1, noe som tyder på at SN09-2 er sannsynlig å være bedre molekyl for utvikling som en prostatakreft-inhibitor (fig. 2D). Den hemmende virkning på cellevekst kan bli korrelert med celledød. For å bekrefte ideen, målte vi LDH aktivitet fra cellekultur media behandles med forskjellige doser av SN09-2. Som vist på fig. 1E, aktiviteten ble økt i alle SN09-2-behandlede celler. Dette resultatet tyder på at SN09-2 er i stand til å stimulere prostatacancerceller i hjel selv i små mengder. Selv om en høy dose av SN09-2 svakt øket LDH-aktivitet, ble aktiviteten ikke korrelert med dosen av agonisten, noe som tyder på at denne analysen synes å være for følsomme til å skille doseavhengig aktivitet på celledød.
Mitokondriell opphopning av SN09-2
i tidligere rapporter, vi og andre grupper observert at radiomerkede GnRH-II bundet til prostata kreft celler gjennom interaksjon med en ca 80-kDa protein hvis identitet ble utpekt som glukose-regulert protein 75 (GRP75) basert på væske-kromatografi-elektrospray ionisering-tandem massespektrometri [11], [28], [29]. Interessant, vår pull-down analysen viste også at SN09-2 direkte interaksjon med GRP75 (Fig. 3A). Siden GRP75 finnes hovedsakelig i mitokondriene, kan det endelige målet for SN09-2 ikke være celleoverflaten. For å utforske den subcellulære beliggenheten av antagonisten, merket vi SN09-2 med FITC og lagt den til PC3-celler ved en 1 mM konsentrasjon i 10 min. FITC-SN09-2 signal ble ikke sett på plasmamembranen men rundt kjernen. Ved behandling med MitoTracker fargestoff, FITC signalet overlappet med den til fargestoff, noe som indikerer at FITC-SN09-2 kan hope seg opp i mitokondriene (Fig. 3B). FITC-SN09-2 var knapt påvises i andre cellelinjer så som HeLa, MCF7, og DLD1 (data ikke vist). Mitokondriell akkumulering av dette konjugatet er ganske lik den for FITC-konjugert GnRH-II og Trp-1, som ble dempet ved umerket GnRH-II. Dette resultatet innebærer at en ukjent endocytose vei for GnRH-II og dets antagonister kan eksistere i prostata kreftceller.
Celler ble inkubert med FITC-konjugert SN09-2 og MitoTracker. Etter vasking ble cellene kort merket med Hoechst33342 (for kjernen farging). Bildene ble tatt under et konfokal mikroskop. Red: MitoTracker, Grønn: FITC-SN09-2, Blå: Hoechst33342
mitokondrieskade og ROS induksjon i SN09-2-behandlede celler
Mitokondriell dysfunksjon er antatt å være direkte relatert til cellulær død [30]. Mitokondrie målretting av SN09-2 kan knyttes til drapet effekt på prostatakreftceller gjennom dysfunksjon i organeller. Vi har undersøkt den elektriske potensial endringen i mitokondriemembranen, noe som indikerer mitokondriell funksjon. Som vist på fig. 4A, 3-dagers behandling av PC3-celler med SN09-2 redusert rød fluorescens-intensitet rundt kjernen, men øket gul og grønn fluorescens med mer enn 80% i cytoplasma, noe som indikerer en reduksjon i mitokondriemembranen potensialet (fig. 4B). I mange tilfeller er mitokondriell dysfunksjon en forutsetning for generering av cytoplasmisk ROS. Når PC3 celler ble behandlet med 5 mikrometer SN09-2, cytoplasmatiske ROS nivåer, målt ved fluorescens av fluoroprobe DCF-DA, ble økt (fig. 4C). Selv om det geometriske gjennomsnittet til fluorescensen var mye lavere enn det som ble sett i H
2o
2-behandlede celler, verdien kan være nok til å indikere endringer av mitokondriefunksjon (fig. 4D). Videre økte SN09-2 cytoplasmatiske ROS-nivåer på en doseavhengig måte (fig. 4E).
(A) Etter behandling med 10 uM SN09-2 i 3 dager, PC3-celler på dekkglass ble inkubert med JC-1, fiksert med 4% paraformaldehyde, kort farget med Hoechst33342, og observert under konfokal mikroskop. (B) SN09-2-behandlede PC3-celler ble løsnet fra formen og anvendes på FACS-analyse for å undersøke fluorescensen fargeendring. (C) PC3-celler behandlet med SN09-2 i 3 timer og ble inkubert med DCF-DA, og påført på FACS-analyse (D) Positiv kontroll av intracellulær ROS. PC3-celler ble behandlet med H
2o
2 i 5 min, merket med DCF-DA, og deretter påført på FACS-analyse. (E) Geometri hjelp av fluorescens-signaler i PC3-celler behandlet med ulike konsentrasjoner av SN09-2 er vist som grafer. Dataene er midler ± S.E. **,
p.
0,01, versus kontroll
SN09-2 induserer celledød gjennom aktivering av apoptotiske signalveier
Mitokondriell dysfunksjon og påfølgende ROS generasjon kan gå forut for apoptose, en form for celledød. For å bestemme mekanismene bak celledød stimulert av SN09-2, farget vi PC3 celler med Cy3-konjugert Annexin V, som spesifikt binder til membran fosfatidylserin. PC3-celler som ble behandlet med 10 uM SN09-2 i 24 timer i utstrakt grad ble farget med Cy3-Annexin V, noe som tyder på at cellene gjennomgår apoptotiske endring (fig. 5A). Når celler ble påført på FACS-analyse etter farging med FITC-konjugert Annexin V og propidiumjodid, de fleste cellene ble FITC-positive, men PI-negativ, noe som tyder på at SN09-2 stimulert apoptotisk død, men ikke nekrotisk døden. Annexin V farging ble dramatisk forbedret med 9 timer etter 10 mikrometer SN09-2 behandling og vedvarende inntil 24 timer (fig. 5B). Under lave konsentrasjoner av SN09-2, få celler ble FITC-positive, mens de fleste celler behandlet med høye konsentrasjoner (mer enn 5 um) ble FITC-positive, hvilket antyder at SN09-2 er en effektiv apoptose induktor for prostatakreftceller (fig. 5C). Sammen med det resultat spredning, det sjeldne farging av cellene behandlet med mindre enn 0,5 uM SN09-2 viser at en lav dose av antagonisten inhiberer cellevekst i stedet for å stimulere celledød.
(A) PC3-celler behandles med 10 mm SN09-2 på dekkglass ble inkubert med Cy3-konjugert annexin V, og kort farget med Hoechst33342. Fluorescens bilder ble tatt under et fluorescens mikroskop. BF: cellemorfologi under lett mikroskop (B, C) annexin-V-positive celler ble økt i en dose- og tidsavhengig måte (B) PC3-celler behandlet med SN09-2 ble innhøstet ved forskjellige tidspunkter, inkubert med FITC-konjugert annexin V, og påført på FACS-analyse (C) PC3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SN09-2 i 12 timer før annexin V-farging. Dataene er midler ± S.E. *,
p
0,05; **,
p.
0,01, versus kontroll
frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene er en tidlig hendelse i løpet av caspase-avhengig celledød. Ved frigjøring av cytokrom c inn i cytoplasma, binder det apoptotisk protease-aktiverende faktor-1 og procaspase-9 for å danne apoptosome, som deretter aktiverer caspase-3 og -7 ansvarlig for å ødelegge celler [31]. Western blot analyse viste at SN09-2 stimulerer cytokrom c frigjøring inn i cytoplasma i en tids- og doseavhengig måte. Den mest cytokrom c ble frigjort fra mitokondrier i celler behandlet med mer enn 5 uM SN09-2 (fig. 6A, C), og cytosoliske metning av proteinet ble utført ved 24 timer etter behandlingen (fig. 6B, D).
(A-D) Western blotting av cytokrom c i den cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner (A, C) PC3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SN09-2 i 24 timer og fraksjonert inn i cytosol og mitokondrier. 20 ug lysater fra hver fraksjon ble anvendt for SDS-PAGE og Western-blotting med anti-cytokrom c-antistoffer. (B, D) Celler behandlet med 10 mikrometer SN09-2 ble høstet ved ulike tidspunkt, og deretter fraksjonert.
