Abstract
Bakgrunn
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er en svært desmoplastic svulst med en forferdelig kamp prognose for de fleste pasienter. Fibrose og betennelse er kjennetegn for svulst desmoplasia. Vi har tidligere vist at å hindre aktivering av bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler) og lindre desmoplasia er gunstige strategier i behandling av PDAC. Metformin er et mye brukt glukosesenkende medikament. Det er også ofte foreskrevet til diabetikere bukspyttkjertelen kreftpasienter og har vist seg å assosiere med et bedre resultat. Men de underliggende mekanismene for denne fordelen er fortsatt uklart. Metformin er funnet å modulere aktiviteten av stelceller i andre sykdoms innstillinger. I denne studien undersøker effekten av metformin på PSC aktivitet, fibrose og betennelse i PDACs.
Metoder /Resultater
I overvekt, diabetes PDAC pasienter og pre-kliniske musemodeller, behandling med metformin reduserte nivåer av tumor ekstracellulære matriks (ECM) komponenter, spesielt hyaluronan (HA).
In vitro
, fant vi at metformin redusert TGF-ß signalisering og produksjon av HA og kollagen-I i dyrkede PSC avtaler. Videre har vi funnet at metformin lindrer tumor betennelse ved å redusere ekspresjonen av inflammatoriske cytokiner, inkludert IL-1, så vel som infiltrasjon og M2 polarisering av tumor-assosierte makrofager (TAM),
in vitro
og
in vivo
. Disse effekter på makrofager
in vitro
synes å være forbundet med en modulering av AMPK /STAT3 sti av metformin. Til slutt fant vi i våre prekliniske modeller som lindring av desmoplasia av metformin ble assosiert med en reduksjon i ECM ombygging, epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og til slutt systemisk metastaser.
Konklusjon
Metformin lindrer fibro-inflammatorisk mikromiljøet hos overvektige /diabetes personer med kreft i bukspyttkjertelen ved å omprogrammere PSC avtaler og TAM, som korrelerer med redusert sykdomsprogresjon. Metformin bør testes /utforsket som en del av behandlingsstrategien i vektige diabetikere PDAC pasienter
Citation. Incio J, Suboj P, Chin SM, Vardam-Kaur T, Liu H, Hato T, et al. (2015) Metformin Reduserer Desmoplasia i bukspyttkjertelkreft ved å omprogrammere stel celler og tumorassosiert Makrofager. PLoS ONE 10 (12): e0141392. doi: 10,1371 /journal.pone.0141392
Redaktør: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES
mottatt: 04.07.2015; Godkjent: 06.10.2015; Publisert: 07.12.2015
Copyright: © 2015 Incio et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Alle datafiler er tilgjengelige fra Harvard DATAVERSE database (sjonsnummer (e) https://dx.doi.org/10.7910/DVN/LLN5FL)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (http: //nih.gov/; R35-CA197743, CA80124, CA85140, CA96915, CA115767, og CA126642 til RKJ og DF), det Lustgarten Foundation (https://www.lustgarten.org/, forskningsstipend til RKJ) og Stiftelsen for vitenskap og teknologi (https://www.fct.pt/, Portugal, POPH /FSE finansieringsprogram, fellesskap og forskningsstipend til JI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne av dette manuskriptet har lest journalen politikk og har følgende konkurrerende interesser: RKJ mottatt konsulenthonorarer fra Ophthotech, SPARC, og SynDevRx. RKJ eier egenkapital i Enlight, Ophthotech, SynDevRx, og XTuit og sitter i styret i XTuit og styrene i forstanderskapet for Tekla Healthcare Investors, Tekla Biovitenskap Investors, og Tekla Healthcare Opportunities Fund. Ingen reagenser eller midler fra disse selskapene ble brukt i disse studiene. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prognosen for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er dystert, med en samlet fem års rente overlevelse 7% [1]. Fedme og type-2 diabetes mellitus (DM2) er blitt en pandemi i verden [2, 3]. Nyere studier har vist at disse metabolske forstyrrelser er assosiert med økt forekomst, progresjon og dårlig prognose av PDAC [4-9]. Ved diagnose, omtrent halvparten av PDAC pasienter er overvektige eller fete, og opptil 80% av pasientene stede med diabetes eller glukoseintoleranse [10-17]. DM2 og fedme kan fremme PDAC gjennom pro-tumorigen insulin og insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1) [18-20], så vel som kronisk betennelse [21, 22]. Derfor kan farmakologiske tiltak som er rettet mot diabetes /fedme også produsere anti-tumor effekter. En slik agent, for tiden under intens etterforskning, er metformin, den mest foreskrevne anti-diabetiker generisk legemiddel som også gis ofte til diabetes PDAC pasienter [23]. Metformin har vist seg å forbedre behandlingsresultatene i prekliniske modeller for PDAC [24-30]. I tillegg reduserer det forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen hos diabetespasienter samt forbedrer overlevelse (redusert risiko for død med 32%) i nydiagnostiserte tilfeller [31-33]. Imidlertid er virkningsmekanismer av metformin i kreft i bukspyttkjertelen ikke godt forstått.
In vitro
studier har adressert effekten av metformin på transkripsjonsfaktorer, microRNAs, DNA skader, kreft stamceller og metabolisme [34-38]. I tillegg er metformin blitt vist å modulere funksjon av hepatiske stel celler, reduserer oksidativt stress i kreft-assosiert fibroblaster, og minke tumor inflammasjon [34, 35, 39, 40]. Vi og andre har vist at omprogrammering pscs reduserer produksjonen av ekstracellulær matriks (ECM) komponenter slik som kollagen-I og hyaluronan (HA), og forsinker utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen [41-45]. Men effekten av metformin på PSC aktivering, produksjon av ECM komponenter og svulst desmoplasia har aldri blitt beskrevet.
Formålet med denne studien er å belyse de funksjonelle mekanismer metformin i PDAC fibro-inflammatorisk svulstens mikromiljø.
In vivo
studier av bukspyttkjertel kreft hittil har vært hovedsakelig utført i xenograft modeller i normalvektige /ikke-diabetikere mus der metformin har vist seg å være mindre effektive [26, 46-48]. Derfor brukte vi to immunkompetente syngeniske musemodeller som er nært etterligner fedme /DM2, for bedre å representere bukspyttkjertelcancerpasienter-majoriteten av kreft i bukspyttkjertelen at pasienten enten med nye tilfeller DM2 eller svekket glukosetoleranse på diagnosetidspunktet [10-17] – og målgruppen av metformin. Videre har vi supplert våre musemodeller med
in vitro
studier samt med analyse av humane prøver av kreft i bukspyttkjertelen fra normalvektige og overvektige /overvektige pasienter. Vi fant ut at metformin omprogrammerer direkte PSC avtaler og TAMs og lindrer fibrose og betennelse i overvektige /diabetes modeller av PDAC. Disse effektene av metformin korrelert med redusert ECM ombygging og epitelial til mesenchymale overgang (EMT), til syvende og sist påvirker metastaser. Vi bekreftet at ECM nivåer i humane PDAC prøver i overvekt og fedme pasienter var faktisk lavere i pasientgruppen behandlet med metformin.
Materialer og Metoder
Dyreforsøk
Den institusjonelle Animal Care og bruk komité i Massachusetts General Hospital godkjent alle eksperimentell bruk av dyr i denne studien. Alle dyr prosedyrer følges Public Health Service politikk på Humane Stell av forsøksdyr retningslinjer. Wild-type (WT) C57BL /6 og FVB hannmus ble opprinnelig hentet fra The Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) og oppvokst og vedlikeholdes i våre ytelses flora dyr anlegget. Mus ble opprettholdt på en 12-timers lys-mørke-syklusen i et temperaturkontrollert barriere anlegget, med
ad libitum
tilgang til mat og surgjort vann. For å generere overvektige /diabetesmusemodeller, mus (6-uker gamle) fikk en 60% fett diett (D12492, Forsknings dietter, New Brunswick, NJ) i 10 uker som tidligere beskrevet [49-51] (tiden av svulst implantasjon) og fortsatte i løpet av tumorstudier. For tumor eksperimenter ble det PAN02 og AK4.4 syngeniske PDAC modeller anvendt i C57BL /6 og FVB immunkompetente mus, respektivt. PAN02 celler (
SMAD4-M174
) [52] ble oppnådd fra ATCC. AK4.4 celler (
KrasG12D Hotell og
p53
+/-
) ble vennlig levert av Dr. Nabeel Bardeesy på MGH. Disse cellene ble isolert fra mus genererer spontane pankreastumorer (
PTF1-Cre /LSL-Kras
G12D
/p53
Lox /+
) [53]. Ortotopiske pankreastumorer ble generert ved å implantere en liten del (1 mm
3) av levedyktige svulstvev (fra en kilde svulst i en egen donor dyr) i bukspyttkjertelen til mannlig lean eller obese FVB (AK4.4 modell) eller C57BL /6 (PAN02 modell) mus. Begge tumormodeller som benyttes ble godkjent av IDEXX Laboratories. (PAN02: IDEXX RADIL Case # 22366-2013 AK4.4. IDEXX RADIL Case # 27818-2014).
Bukspyttkjerteltumorvekst studier
På 7 dager etter implantasjon, mus med orthotopic PAN02 eller AK4.4 pankreastumorer ble randomisert til kontroll eller metformin behandlingsgruppene. På dag 21 ble plasma og tumorprøver samlet inn, og svulster ble veid og bearbeidet for videre analyse.
Metformin behandling
Standarden dose av metformin for behandling av mennesker er 1000-2500 mg, vanligvis gitt to ganger daglig. I den foreliggende undersøkelse, ble metformin administrert ved 300 mg /kg i drikkevann. Dette kan oversettes til den menneskelige tilsvarende dose ved hjelp av Reagan-Shaw metoden [54]. I henhold til formelen for den menneskelige tilsvarende dose [(mg /kg) = dyr dose (mg /kg) x dyr (km) /human (km). Km for en 60 kg voksne mennesker er lik 37 og for en 20 g mus lik 3], human tilsvarende murine dose på 300 mg /kg er 1459 mg for en gjennomsnittlig størrelse på 60 kg voksent menneske. Derfor er den valgte dosen i denne studien innenfor sikkerhets terapeutiske området registrert hos mennesker. Videre er den foreliggende undersøkelsen bestemmes den terapeutiske periode for å være 2 uker for å evaluere antitumoreffekten av metformin. Dette var forenlig med de terapeutiske perioder som er rapportert i tidligere studier [55, 56]. Frisk metformin ble gitt i drikkevann hver 3. dag. Det tilsatt til hvert dyr bur mengde ble beregnet på grunnlag av den gjennomsnittlige daglige vanninntaket for at buret i løpet av en periode på 2 uker før behandlingsstart, og justert hver tredje dag basert på vannforbruket og kroppsvekt av dyrene. Den omtrentlige plasmakonsentrasjonen av metformin i pasienter med type 2 diabetes tar dette stoffet er 0,05 mm, selv om det kan akkumuleres i vev og nå høyere konsentrasjoner lokalt [35]. For
in vitro
eksperimenter, en rekke konsentrasjon 0,05 til 25 mm, avhengig av cellelinje som brukes (se nedenfor for mer informasjon).
Effekt av metformin på PSC avtaler og makrofager
in vitro
Standard MTT ble utført på PSC avtaler og makrofager behandlet med metformin i en rekke 0.05-25mM, for å undersøke mulige effekter på celle levedyktighet. RAW 264,7 (museleukemi monocyttmakrofager) ble innhentet fra ATCC og brukes til å vurdere effekten av metformin på makrofager
in vitro
. Celler ble utsådd i 10 cm
2 petri-skåler i serum /serumfritt medium og behandlet med metformin i 48 timer ved konsentrasjoner i området 0,05 til 0,4 mM (konsentrasjoner som ikke i vesentlig grad påvirker cellenes levedyktighet). Etter behandling ble cellene oppsamlet for RNA og protein ekstraksjon for å kunne utføre påfølgende analyse av gen-ekspresjon av cytokiner og polariserings markører, og for analyse av signalering og metabolske veier. Humane pscs ble sådd ut på 10 cm
2 petriskåler i media med 2,5% serum og behandlet med metformin i 48 timer ved konsentrasjoner i området fra 0,1 til 10 mM. Celler ble samlet opp for proteinekstraksjon for analyse av aktiveringen av fibrose messige reaksjonsveier. I tillegg pscs ble sådd i en 8-brønners kammerskyveren (20.000 celler /brønn), ble behandlet med metformin (1 mM, en konsentrasjon som ikke påvirker cellenes levedyktighet) i 48 timer, og immunofluorescerende farging ble utført ved å følge standardprotokoller. Cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd og blokkert med 5% normalt esel serum i 1 time. De ble inkubert med de angitte primære antistoffer over natten ved 4 ° C og deretter i 2 timer med de passende sekundære antistoffer ved RT. PBS ble anvendt for alle vaskinger og de fargede prøver ble montert med forlenge gull med DAPI. Bilder ble ervervet ved hjelp av en konfokal mikroskop. Antistoffene brukt og innstillinger image oppkjøpet er beskrevet nedenfor. Begge celletyper ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Sigma, St. Louis, MO) supplert med 5% (v /v) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS, Sigma), 100 enheter /ml penicillin og streptomycin. Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktig atmosfære inkludert 5% CO
2
humane prøver
Menneskelige prøver av kreft i bukspyttkjertelen ble hentet fra MGH vev repository (http: /. /www.massgeneral.org/research/resourcelab.aspx?id=31) under et aktivt IRB-protokollen (Partners Health IRB godkjenningsnummer: 2013P001969). Skriftlig informert samtykke fra donor eller pårørende ble innhentet for bruk av disse prøvene for forskningsformål. Svulster utvalgte mottok ingen kjemoterapi eller strålebehandling før den kirurgiske prøve ble oppsamlet på tidspunktet for tumorreseksjon. Totalt 28 prøver ble tilfeldig valgt fra denne undergruppe av prøver. Body mass index ble oppnådd for den respektive prøven. 7 av prøvene (25%) svarer til pasienter som ble medisinert med metformin ved reseksjon. Parafinsnitt ble farget for kollagen-I og HA som beskrevet nedenfor. Bilder ble anskaffet ved hjelp konfokalmikroskopi og kvantifisert ved hjelp av Matlab. Data ble analysert anonymt.
Gene Expression
Umiddelbart etter fjerning, var snap-frosset og lagret i flytende nitrogen svulstvev. Total RNA ble ekstrahert og relativ genekspresjon av makro M1 /M2 markører ble bestemt ved hjelp av en SYBR-grønn basert standard protokoll. I tillegg ble total RNA ekstrahert, og relativ genekspresjon ble bestemt ved bruk RT2 Profiler PCR Arrays system (Qiagen) på en Stratagene Mx3000P QPCR System ved hjelp av pre-laget sti fokusert arrays ( «fibrose» lys katt nummer:. PAMM011Z; «epithelial å Mesenchymale Transition (EMT) «- Cat Antall:. PAMM090Z;» TGF-ß signaliserer mål «-PAMM235Z;» ekstracellulær matriks adhesjonsmolekyler:; Vanlige cytokiner «lys katt nummer: PAMM021Z» -cat Antall PAMM013Z og. «. ).
protein Expression
Western blot analyse.
Hver tumorprøve ble homogenisert direkte i lyseringsbuffer for protein utvinning. 20 ug av denaturert protein per prøve ble applisert på 7%, 10% og 12% SDS-polyakrylamidgeler. Antistoffer brukt: fosfor-p38 MAPKT
180 /Y182 og p38; fosfor-JNK (SAPK /JNK)
Thr183 /Tyr185 og JNK; fosfor-AKT
Ser473 og AKT, fosfor-ERK (P44 /42 MAPK)
T202 /Y204 og ERK; fosfor-NF-kB
Ser536 og NK-kB; p65
Ser536; fosfor-Smad2
Ser465 /467 og Smad2; fosfor-IGF-I Receptor ß
Tyr1135 og IGF; Fosfor-IRS-1
Ser612 og IRS; IR; phpspho-STAT3
Tyr705 og STAT3; Fosfor-AMPKα
Thr172 og Ampkα; fosfor-Ampkβ
Ser108 og AMPK; fosfor-ACC
Ser79 og ACC; Fosfor-PDGF Receptor ß
Tyr751 og PDGF Receptor ß og snegl, e-cadherin og vimentin, TGF-ß, ß-catenin, vri, LC3B. Alle antistoffene som er nevnt ovenfor ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA), og fortynnet 1: 1000 med unntak av fosfo-JNK (SAPK /JNK)
Thr183 /Tyr185, fosfo-NF-kB p65
Ser536 , fosfor-Smad2
Ser465 /467, fosfor-IGF-I Receptor ß
Tyr1135, kløyvde caspase-3, phospho-IRS-1
Ser612. Andre antistoffer som ble brukt var: αSMA og fosfor-insulinreseptorer
Y972 (1: 1000 og 1: 500, Abcam, MA); col-en (1: 1000); MMP-9 og MMP-2 (1: 500 og 1: 200, EMD Millipore-Billerica, Massachusetts), AT1 (1: 1000, levetid Biosciences Inc, Washington), ZEB1 (1: 1000, Novus Biologicals, Colorado), og ß-aktin (1: 5000, Sigma, MO). Kvantifisering av protein uttrykk i forhold til total reseptor eller SS-aktin ble innhentet ved hjelp av Image J programvare.
Multiplex array.
Hver tumorprøve ble homogenisert direkte i lyseringsbuffer for protein utvinning. 2UG /ul av prøven ble anvendt. En multipleks inflammatorisk flere cytokiner protein utvalg ble brukt (V-PLEX proinflammatoriske PANEL1 mus kit, Cat Antall:. K15048D). For ELISA analyse
immunfluorescens /Immunohistochemistry
For analyse av frosne deler av mus tumorvev, tumorene ble skåret ut og frosset i en optimal skjære temperatur forbindelse (Tissue-Tek). Tverrgående tumorsnitt, 10 mikrometer tykke, ble immunostained med spesifikke antistoffer. For å få mosaikk bilder av tumorsnitt, ble en Olympus FV1000 confocal laserskanning mikroskop. En 10x objektiv luft ervervet 1260-um kvadratiske fliser, og en automatisert trinn skannet gjennom hele tverrsnittet av tumorvev. De fotograferte fliser ble sydd til et endelig mosaikk bilde med Olympus programvare. Antigen-ekspresjon ble kvantifisert ved å måle arealet som opptas av flekken av interesse normalisert med arealet av DAPI-fargede kjerner (dvs. dimensjonsløs), og analysert ved hjelp av en tilpasset algoritme i MATLAB (The MathWorks). Identiske innstillinger og terskler for analyse ble brukt for alle svulster. Antistoffer anvendt for immunofluorescens var følgende: Collagen-I [LF-68-antistoff, 1:50 fortynning, levert av Dr. Larry Fisher (NIDCR)]; Hyaluronan (biotinylert hyaluronan proteoglykan-fragmentet, 385911, Calbiochem, 1: 200 fortynning); αSMA (C6198 antistoff, Sigma, 1: 500 fortynning); og F4 /80 (MCA497A488 antistoff, ABDserotec, 1: 200 fortynning). Cy3-, Cy5- eller FITC-konjugerte sekundære antistoffer ble anvendt for deteksjon av signaler ved konfokal mikroskopi. Lysbilder ble kontra med DAPI for nukleær farging.
MMP aktivitetsanalyse
Hver tumorprøve ble homogenisert direkte i lyseringsbuffer for protein utvinning. En standard kommersiell analyse (Abcam ab112146) ble anvendt for å påvise den generelle aktiviteten av MMP i tumorprøver. Tumor lysater ble inkubert med et fluorescerende substrat [fluorescens-resonans energioverføring (FRET) peptid] for 1, 2 og 16 timer, og fluorescensen ble målt ved bruk av en fluorescerende mikroplateleser.
Flow Cytometry
tumor-bærende mus ble perfusert ved intrakardial injeksjon av PBS og ofret. Pankreatiske tumorcellene ble høstet, hakket, og behandlet ved 37 ° C i 1 time med DMEM inneholdende kollagenase type 1A (1,5 mg /ml), hyaluronidase (1,5 mg /ml) og DNase (2 ug /ml). Fordøyelsen blandinger ble filtrert gjennom 70-mikrometer celle siler. Enkeltcellesuspensjoner ble inkubert med rotte-anti-mus CD16 /CD32 mAb for blokkering og farget med fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer i kald buffer (1% BSA, 0,1% NaN3 i PBS). 7-amino-actinomycin D (7AAD) reagens (eBioscience) ble satt til de fargede rør per produsentens anvisninger umiddelbart før du kjører strømningsanalyse. Flowcytometri data ble kjøpt på en LSRII strømningscytometer (Becton Dickinson) og ble analysert med FACSDiva programvare. FSC-A vs. FSC-W og SSC-A vs. SSC-W ble brukt til å diskriminere de doublet /aggregerte hendelser. Følgende monoklonale anti-mus-antistoffer ble brukt: CD45-PE, CD45-PE-Cy7, CD45-FITC, CD11b-APC-Cy7, CD11b-APC, F4 /80-APC (BD Biosciences) og F4 /80-FITC og F4 /80-PE (eBioscience).
Macrophage isolasjon
etter å kutte svulstvev i biter 0,5 mm i diameter, svulster ble dissosiert med collagenase og hyaluronidase i én time. Dissosierte tumorer ble vasket med sortering buffer (0,5% BSA i PBS) og føres gjennom cellefiltre før de ble blokkert ved hjelp av Fcr og deretter inkubert med et F4 /80 biotinylert primære antistoff (eBiosciences) i 15 min. Anti-biotin-konjugerte magnetiske kuler (Miltenyl Biotech) ble tilsatt til cellesuspensjonen og inkubert i 15 minutter før eksponering av cellene for magnetiske spalter (MACS LS-kolonner fra Miltenyl Biotech) for celleseparasjon.
Statistisk analyse
statistiske forskjeller mellom gruppene ble vurdert av en to-tailed Student t-test. To-veis analyse av varians ble benyttet ved sammenligning av kroppsvekt i løpet av tiden mellom kontroll og metformin-behandlede grupper. Forekomsten av metastasering og vegg invasjonen ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat. Alle statistiske analyser ble utført ved anvendelse av Prism software Graphpad. Alle resultater ble ansett statistisk signifikant når p-verdien var mindre enn 0,05 når beregnet med den passende statistisk test. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standard feil.
Resultater
Metformin reduserer desmoplasia i mus og menneske PDACs
Vi har vist at reduksjon av desmoplasia senk ECM komponenter slike som HA og kollagen-i-i PDACs potensiere anti-tumor behandlinger [41-43]. Derfor undersøkte vi sammenhengen mellom metformin behandling og desmoplasia i PDACs i chemo /strålebehandling naive PDAC kirurgiske prøver. Vi fant at overvektige eller fete pasienter under behandling med metformin, nivåer av HA var 30% lavere enn hos pasienter som ikke tar metformin (Fig 1i og 1ii). Interessant nok ble observert noen forskjell i HA nivåer i metformin hos pasienter behandlet med normal vekt. På den annen side, behandling med metformin syntes å ha noen innvirkning på kollagen-I ekspresjon i enten kroppsvekt gruppe (S1 figur).
(i) Representative histologiske bilde som viser effekten av metformin på tumor hyaluronan nivåer i normal vekt [Body mass index (BMI) 25)] eller overvektige /fete pasienter (BMI 25) (n = 22 kontroller, 7 metformin). (Ii) Immunhistokjemisk analyse av totale tumor hyaluronan nivåer. Metformin reduserer hyaluronan-positive område fraksjon (%) i overvekt /overvektige pasienter. Data er presentert som gjennomsnitt ± standard feil. * P 0,05 vs. kontroll hos pasienter med BMI . 25
For å vurdere om vi kan rekapitulere disse funnene i prekliniske modeller, brukte vi FVB og C57BL /6 mus ble matet med en fettrik diett . Vi, sammen med andre har vist at en fettrik diett induserer fedme og metabolske forstyrrelser som er typiske for DM2, forhøyet blodsukker, insulin og IGF-1 [50, 57-60] i disse stammene. Etter 10 uker på fettrik diett, AK4.4 og PAN02 svulster ble orthotopically implantert i obese FVB og C57BL /6 mus, henholdsvis. Dyrene ble randomisert til metformin i drikkevann (300 mg /kg) eller ingen behandling ved dag 7 til dag 21 når plasma og tumorer ble oppsamlet. Behandling med metformin korrelert med redusert ekspresjon av HA med 64% (Fig 2Ai og 2Aii) og av kollagen-I med 35% (Fig 2Ai og 2Aiii) i AK4.4. svulster. Videre er prosentandelen av aktiverte pscs (som bestemt ved ekspresjon av alfa-glattmuskel-antigen, αSMA) som ko-uttrykke HA og kollagen-I ble redusert med 58 og 38%, henholdsvis (fig 2Bi-2Biii). I en annen, mindre desmoplastic modell (PAN02), redusert metformin uttrykket av HA med 40% og av kollagen-I med 22%, selv om det ikke statistisk signifikans (S2i-S2iii fig). Ikke desto mindre, metformin betydelig redusert tetthet av kollagen-I-positive aktiverte pscs i tumorer med 54% i denne modellen (fig S2V). Tettheten av HA positive aktivert PSC avtaler i PAN02 svulster ble også redusert med 57% (S2iv figur), men nådde ikke signifikans. Vi har tidligere vist at angiotensin-II reseptor 1 (AT1) er kritisk for HA og kollagen-I produksjonen i PDACs [43]. Faktisk, observerte vi at metformin var i stand til å redusere ekspresjonen av AT1 (figur 2C). Samlet utgjør disse dataene indikerer at metformin reduserer desmoplasia i PDACs i overvekt /fedme verter.
Etter 10 uker med fettrik diett, AK4.4 svulster ble orthotopically implantert i vektige FVB mus. Dyr ble randomisert til metformin i drikkevann (300 mg /kg) eller ingen behandling i dag 7 til dag 21 når svulster ble samlet. (A-i) Representative immunhistokjemi bilder som viser effekten av metformin på tumor hyaluronan og kollagen-I-nivåer i AK4.4 tumorer (n = 3-4). (A-ii) Kvantifisering av hyaluronan ekspresjon i AK4.4 tumorer. Metformin reduserer hyaluronan-positive område fraksjon (%). (A-iii) Kvantifisering av kollagen-I ekspresjon i AK4.4 tumorer. Metformin reduserer kollagen-I-positive område fraksjon (%). (Bi) Representative immunhistokjemi bilder som viser virkningen av metformin på uttrykket (co-lokalisering) av hyaluronan og kollagen-I-nivåer i aktiverte (αSMA-positiv) pankreatiske stel celler (pscs) i AK4.4 tumorer (n = 3-4) . (B-ii) Kvantifisering av hyaluronan uttrykk i PSC avtaler. Metformin reduserer andelen av aktiverte pscs uttrykker hyaluronan. (B-iii) Kvantifisering av kollagen-I uttrykk i PSC avtaler. Metformin reduserer andelen av aktiverte pscs som uttrykker kollagen-I. (C-i) Representative vestlige blotter for angiotensin-II reseptor-1 (AT1) uttrykk i AK4.4 svulster. ß-aktin blir benyttet som en kontroll for protein lasting. (C-II) Densitometrisk analyse av AT1 uttrykk normalisert til ß-aktin. Metformin reduserer ekspresjon av AT1. Data er presentert som gjennomsnitt ± standard feil. * P 0,05 vs. kontroll.
Metformin påvirker desmoplasia ved direkte reduksjon av TGF-β signalering og produksjon av kollagen-I /HA ved PSC avtaler
Collagen-I og HA er i hovedsak produsert av aktivert PSC avtaler i PDACs [43, 61]. For å avgjøre om metformin behandling kan direkte redusere kollagen-I /HA uttrykk i PSC avtaler, inkuberes vi pscs
in vitro
med metformin. Vi har funnet at, i en dose (1 mM) som ikke i vesentlig grad påvirker levedyktigheten av pscs (S3 fig), redusert metformin ekspresjon av HA og kollagen-I (fig 3AI-3Aiii). Dette indikerer metformin virker på pscs for å redusere produksjonen av disse kritiske ECM komponentene. Videre fant vi at metformin (0.1-1mM) redusert uttrykk av AT1, TGF-β og nedstrøms signale via SMAD-2, samt PDGF-β, alle sentrale aktører i ECM produksjon av PSC avtaler (Fig 3B). I tillegg metformin påvirket også aktivering av kanoniske signalveier som fremmer PSC aktivering og fibrose [62], spesielt ERK, p38, og STAT3, selv ved relativt høye doser (1-10 mm) (figur 3B). Viktigere, i hele svulster, redusert metformin aktivering av STAT3 i begge modellene, med en trend for redusert p38-aktivering i PAN02 (S4i-S4iii figur), noe som tyder på at metformin kan akkumuleres i konsentrasjoner høye nok til å påvirke disse signalveier
in vivo
. Samlet utgjør disse dataene indikerer at metformin påvirker desmoplasia ved direkte reduksjon av AT1 /TGF-β /STAT3 signalisering og produksjon av kollagen-I /HA ved PSC avtaler.
(A) PSC avtaler ble inkubert
in vitro
med metformin (1 mm) i 48 timer. (A-i) Representative immunocytochemistry bilder som viser effekten av metformin på tumor hyaluronan og kollagen-I-nivåer i humane pankreatiske stellate cells (pscs)
in vitro plakater (n = 2). (A-ii) Kvantifisering av hyaluronan uttrykk i PSC avtaler. Metformin reduserer ekspresjon av hyaluronan i pscs. (A-iii) Kvantifisering av ekspresjonen av kollagen-I i pscs. Metformin reduserer ekspresjon av kollagen-I i pscs. αSMA betegner aktivert PSC avtaler. (B) Representative Western blots for ekspresjon av fibroserelaterte markører og signaleringsproteiner i pscs behandlet med metformin ved 0, 0,1, 1 og 10 mM. Metformin reduserer uttrykk for fibrose relaterte markører og signalanlegg proteiner i PSC avtaler. Densitometrisk analyse av protein ekspresjon normalisert til ß-aktin eller totalt protein (i tilfelle av fosforylerte proteiner) er vist som tall under de representative band. Dataene i A er presentert som gjennomsnitt ± standard feil. * P 0,05 vs. kontroll.
Metformin forbedrer også desmoplasia ved å hindre rekruttering og M2 polarisering av makrofager i PDACs
betennelse som oppstår i PDACs er en viktig komponent i desmoplasia [63]. Spesielt tumorassosierte makrofager (TAM) er en viktig kilde av cytokiner som forverre desmoplasia i PDACs [64] og en negativ innvirkning sykdom utfallet [65]. Derfor har vi bestemt her effekten av metformin på TAM infiltrasjon i svulster. Vi fant at TAM nivåene var 60% lavere med metformin behandling i AK4.4 modellen (figur 4A). De har også tendens til å være lavere (~ 30%, ikke signifikant) i PAN02 modellen (fig S5a). For å bestemme en direkte effekt av metformin på makrofager, inkubert vi makrofager med metformin
in vitro
for 48t på økende konsentrasjoner. Vi fant ut at metformin påvirket levedyktigheten til makrofager ved doser på 0,4 mm eller høyere (S6 fig). Metformin ved en konsentrasjon på 0,05 mm (tilsvarende til konsentrasjonen målt i plasma hos pasienter som tar metformin) redusert M2 markører slik som Arg-1 og IL-10, mens metformin ved doser høyere enn 0,2 mM redusert både M1 og M2 markører (fig 4B ). I strømnings-sortert TAMs fra PAN02 tumorer
in vivo
, vi faktisk bekreftet en effekt av metformin på ekspresjon av M2 markører Arg-1 (~ 1/2) og IL-10 (~ 2/3) uten vesentlig påvirker ekspresjonen av M1 markører (figur 4C). Vi forsøkte å forstå hvordan metformin påvirker disse cellene. Flere kanoniske og ikke-kanoniske signalveier kan aktiveres i PDACs ved betennelse og fremme uttrykk for M2 markører på TAMs [66-69]. I samsvar med virkningene på TAM, metformin redusert aktivering av STAT3, JNK, AKT og p38 i makrofager
in vitro
ved konsentrasjoner lavere enn 0,2 mm (figur 4D). Som nevnt ovenfor, i hele svulster metformin redusert aktivering av STAT3 i begge modellene, med en trend for redusert aktivering av p38 i PAN02, i tråd med vår
in vitro
resultater (S4i-S4iii fig). Det har vist seg at STAT3 aktivitet er redusert med metformin via aktivering av metabolsk energi sensor AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) i flere celletyper [70]. Ja, vi fant at den hemmende effekten av metformin på STAT3 signale i makrofager
in vitro
forbundet med aktivering av AMPKα og nedstrøms enzymet acetyl-CoA karboksylase (ACC) (sistnevnte åpenbart bare i serum tilsatt media) i disse celler (fig 4D og S7 fig). Tatt sammen indikerer disse data at metformin reduserer TAM infiltrering, så vel som ekspresjon av M2 markører, som kan bli mediert i det minste delvis via AMPK /STAT3 aliserte inhibering i makrofager. I tillegg er inflammasjon i tumorer, karakterisert ved et overskudd av inflammatoriske cytokiner som fremmer desmoplasia, og metformin har vist seg å påvirke flere inflammatoriske mediatorer [34, 35].
