Abstract
Vi har vist at blokkering CXCR4 kan være en potent anti-metastatisk behandling for CXCR4-relatert kreft i munnhulen. Men som CXCR4 antagonister er for tiden i klinisk bruk for å indusere mobilisering av hematopoetiske stamceller, kontinuerlig administrering som en inhibitor for den metastasering kan føre til vedvarende leukocytose. I denne studien undersøkte vi den nye terapeutiske nedstrøms mål (e) av SDF-1 /CXCR4 system, ved hjelp av B88-SDF-1 celler, som har en autokrin SDF-1 /CXCR4 system og oppviser fjern metastatisk potensiale
i vivo
. Microarray analyse viste at 418 gener ble oppregulert i B88-SDF-1 celler. Vi identifiserte et gen som er sterkt oppregulert i B88-SDF-1-celler, metabotropisk glutamat-reseptor-5 (mGluR5), som ble nedregulert etter behandling med 1,1 «- [1,4-fenylenbis (metylen)] bis-1,4 , 8,11-tetraazacyklotetradecan octahydrochloride (AMD3100), en CXCR4 antagonist. Den oppregulering av mGluR5 mRNA i SDF-1 /CXCR4 systemet ble hovedsakelig regulert av Ras-ekstracellulære signalregulert kinase (ERK) 1/2 veien. I tillegg veksten av B88-SDF-1-celler ble ikke påvirket av mGluR5-agonist (S) -3,5-DHPG (DHPG) eller mGluR5 antagonister 2-metyl-6- (fenyletynyl) pyridin (MPEP) og 3- ((2-metyl-1,3-tiazol-4-yl) etynyl) pyridin (MTEP). Men observerte vi at DHPG fremmet B88-SDF-1 celle migrasjon, mens både MPEP og MTEP hemmet B88-SDF-1 celle migrasjon. For å vurdere medikamenttoksisitet, ble antagonistene injisert intraperitonealt i immunkompetente mus i 4 uker. Mus injisert med MPEP (5 mg /kg) og MTEP (5 mg /kg) viste ikke noen bivirkninger, for eksempel hematotoxicity, allergiske reaksjoner eller vekttap. Administreringen av antagonister vesentlig hemmet metastasering av B88-SDF-1 celler til lungene hos nakne mus. Disse resultatene tyder på at blokkering mGluR5 med antagonister som MPEP og MTEP kan forhindre metastase i CXCR4-relatert kreft i munnhulen uten å forårsake bivirkninger
Citation. Kuribayashi N, Uchida D, Kinouchi M, Takamaru N, Tamatani T, Nagai H, et al. (2013) The Role of metabotrope glutamat Receptor 5 på stromal Cell-Faktor-1 /CXCR4 System i Oral Cancer. PLoS ONE 8 (11): e80773. doi: 10,1371 /journal.pone.0080773
Redaktør: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 11 juli 2013; Godkjent: 06.10.2013; Publisert: 13.11.2013
Copyright: © 2013 Kuribayashi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B; 24792225; https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vi har tidligere vist at B88 celler, muntlige kreftceller som uttrykker kjemokinreseptoren CXCR4, spesielt. metastaserer til cervical lymfeknuter via en stromal celle-avledet faktor (SDF) -1 gradient produsert av lymphatic stroma [1-3]. Den tvungne-uttrykk for SDF-1 i B88 celler (kalt B88-SDF-1 celler) konferert forbedret cellemotilitet og lungemetastaser etter intravenøs inokulasjon [4]. Nylig viste også vi at CXCR4 uttrykk bidrar til metastatisk potensial av spyttkjertelkreft [5]. Videre har vi også demonstrert at blokkering av CXCR4 med 1,1 «- [1,4-fenylenbis (metylen)] bis-1,4,8,11-tetraazacyklotetradekan octahydrochloride (AMD3100), en CXCR4-antagonist, kan være en potent anti -metastatic terapi for CXCR4-relaterte hode- og halskreft [5,6].
SDF-1 /CXCR4 system hovedsak fungerer som en kjemotaktisk faktor i kreftceller til å nå metastaser. Imidlertid, for å etablere den metastase, flere viktige prosesser, for eksempel invasjon, intravasation, ekstravasasjon og ektopisk vekstpotensial, er uunnværlig. Således er det viktig å undersøke funksjonen av nedstrøms mål (e) som er ansvarlig for etablering av metastaser i SDF-1 /CXCR4 system. Dessuten har nyere kliniske forsøk demonstrerte at en enkelt administrering av AMD3100 er effektiv i å mobilisere hematopoetiske stamceller, til tross for det faktum at AMD3100 elimineres raskt med en beregnet fordeling halveringstid på 0,3 timer og terminal halveringstid på 5,3 timer [7, 8]. Imidlertid kan effektive CXCR4 relaterte anti-metastatiske behandlinger krever den daglige administrasjonen av AMD3100 å kontinuerlig hindre migrasjon av premetastatic celler til metastaser, som kan forårsake kronisk leukocytose. Dersom den nedstrøms mål-gen (e) av SDF-1 /CXCR4-systemet er spesielt uttrykt i kreftceller ble identifisert, er det forventet at antimetastatisk terapi kan utføres mer sikkert og effektivt. Imidlertid er målgenet (e) av SDF-1 /CXCR4 system ikke fullt ut forstått. Således, i denne studien undersøkte vi den nye terapeutiske nedstrøms mål (e) av SDF-1 /CXCR4 system i B88-SDF-1-celler, som har en autokrin SDF-1 /CXCR4 system og oppviser fjern metastatiske potensiale in vivo, bruker cDNA mikromatriser [4].
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Musene ble håndtert i tråd med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk ved Universitetet i Tokushima (Permit Number: 10084). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
cDNA microarray analyse
Total RNA for cDNA microarray analyse ble ekstrahert fra serum sultet B88-mock celler og B88-SDF-1 celler. Den Applied Biosystems Chemiluminescent RT-IVT Merking Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ble brukt til å konvertere total RNA til digoxigenin (DIG) -merket cRNA. Ett pg av total RNA ble brukt til å generere den dobbeltstreng-cDNA. CDNA ble transkribert med DIG-merkede nukleotider (Roche Diagnostics, Basel, Sveits), fragmenterte og hybridiserte til Human Genome Survey Array (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter vasking av hver matrise, er signalet utviklet ved bruk av en kjemiluminescerende deteksjonssett (Life Technologies). Behandlet arrays ble skannet med en 1700 kjemiluminescerende microarray analysator (Life Technologies). Disse resultatene ble analysert med bruk av GeneSpring GX 12,5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA, Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com, Redwood City, CA) programvare. Funksjonell analyse av IPA identifiserte biologiske funksjoner eller sykdommer som var mest betydnings til datasettet. Fischers eksakte test ble brukt til å beregne en p-verdi bestemme sannsynligheten for at hver biologisk funksjon eller sykdom som er tilordnet den datasettet skyldes tilfeldigheter alene. Microarray rådata er deponert i Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) i henhold til minimum informasjon om microarray eksperiment (MIAME) retningslinjer. Sjonsnummer er GSE50507.
Celler og cellekultur
B88 celler ble opprinnelig etablert fra en pasient med tungen kreft [1] og anses fri for mycoplasma og bakteriell forurensning. Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 ug /ml streptomycin, og 100 U /mL penicillin i en fuktig atmosfære med 95 % luft og 5% CO2 ved 37 ° C
Glutamat analysen
Det er totalt 5 x 10
6 celler, ble sådd på 100 mm skåler (Falcon;. Becton Dickinson Laboratorium, Franklin Lakes, NJ, USA). Mediet ble erstattet med DMEM uten L-glutamin og FCS etter 24 timer. Etter ytterligere 24 timer kultur ble kondisjonert medium samlet og 100 ul ble analysert med en Amplex® Red glutaminsyre /Glutamat oxidase Assay Kit (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescens ble målt med en Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) med 530 nm eksitasjon og 590 nm fluorescens deteksjon.
Mus og in vivo studie
C3H /høne mus og BALB /c nakne mus ble kjøpt fra CLEA Japan (Osaka, Japan) og ble opprettholdt under patogen-frie forhold. I den eksperimentelle kjemoterapi, ble C3H /HEN-mus anvendt som kontroll immunkompetente mus [9], og ble behandlet daglig med enten subkutant (SC) injeksjoner av AMD3100 (2,5 mg /kg; Sigma) [5,6] eller intraperitoneal (ip) injeksjoner av 2-metyl-6- (fenyletynyl) pyridin (5 mg /kg; MPEP, Tocris Bioscience, Bristol, UK) [10], 3 – ((2-metyl-1,3-tiazol-4-yl) etynyl ) pyridin (5 mg /kg; MTEP, Calbiochem, San Diego, CA, USA) [10], eller det samme volumet av saltløsning. Mus behandlet med AMD3100 ble avlivet på dag 1, 14 og 28, og mus behandlet med MPEP eller MTEP ble avlivet på dag 1, 7, 14, 21 og 28. Alle mus ble avlivet ved blodtapping i henhold natriumpentobarbital anestesi og et komplett blod telle ble utført ved hjelp av en ADVIA120 (Siemens Healthcare Diagnostics KK, Tokyo, Japan) ved Taiho Pharmaceutical Co., Ltd (Tokyo, Japan). For metastase-analysen, ble 1 x 10
6 B88-SDF-1-celler inokulert intravenøst (i.v.) før behandling med midler. Musene ble avlivet 30 dager etter inokulering celle, og lungene ble utryddet og delt i to. Den ene halvdelen av lungen ble løst for histopatologiske analyse og farget med H-E og den andre ble lysert for kvantitativ analyse ved hjelp av Alu-PCR. Primerne som ble brukt for Alu-PCR var Halu-UP: ACGCCTGTAATCCCAGCACTT, Halu-DN: TCGCCCAGGCTGGAGTGCA [11]. Gene-spesifikke produkter ble målt kontinuerlig av en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System for 35 sykluser bruker Thunderbird SYBR® qPCR Mix (Toyobo, Osaka, Japan).
RT-PCR
Celler dyrket som monolag ble høstet ved sub-samløpet. Etter 24 timer ble RNA isolert med TRIzol reagens (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. RT-PCR for mGluR5 og glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA ble utført under følgende betingelser: 94 ° C i 2 minutter; deretter 30 sykluser ved 94 ° C i 1 min, 60 ° C i 1 minutt og 72 ° C i 1 min; og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 1 min. Primersekvenser for mennesker mGluR5 og GAPDH var som følger: mGluR5-UP: 5′-TGGCCACCCTGTTTGTTACT-3 «, mGluR5-DN: 5′-GCACTGAGGCTGACCGAGAA-3′, GAPDH-UP: 5»-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3 «, og GAPDH- DN: 5»-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3 «. For kvantitativ RT-PCR, undersøkte vi uttrykket av mGluR5 og GAPDH av en
Δ
ΔCT metode. mGluR5 og GAPDH mRNA ble samtidig registrert med Taqman
TM genuttrykk Analyser (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Gene spesifikke produkter ble kontinuerlig målt ved en ABI StepOnePlus Real-Time PCR System under 40 sykluser av PCR.
flowcytometrisk analyse
Logaritmisk voksende celler ble trypsinert og fiksert i 4% paraformaldehyde (V /V) på is i 10 min. Cellene ble vasket og inkubert med anti-mGluR5-mAb (fortynning 1: 100; R . Becton Dickinson Labware). Tyve timer senere ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Etter vasking av cellene med PBS, ikke-spesifikk binding ble blokkert med 1% BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur. Celler ble deretter inkubert med et primært kanin monoklonalt antistoff mot mGluR5 (Genway Biotech, San Diego, CA, USA). Alexa Fluor 488-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (Life Technologies) ble anvendt for påvisning. Lysbilder ble kontra med DAPI (Life Technologies) og montert med forlenge Gold Antifade Reagens (Life Technologies). Fluorescenssignaler ble observert med et konfokalt mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan). For påvisning av F-aktin, ble B88-SDF-1-celler inkubert med enten 100 uM mGluR5 agonist, (S) -3,5-DHPG (DHPG, Tocris) [12], 20 uM MPEP eller 20 uM MTEP. Etter 24 timer ble cellene farget med Alexa Fluor 488-konjugert phalloidin (Life Technologies) og immunfluorescens ble oppdaget med en epifluorescence mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan).
MTT-analysen
En total på 5 x 10
3-celler ble sådd ut i hver brønn av en 96-brønners plate (Falcon, Becton Dickinson Labware) i DMEM supplert med 10% FCS . Etter 24 timers dyrkning ble cellene behandlet med enten 100 uM DHPG, 20 uM MPEP eller 20 uM MTEP i 48 timer. Antall celler ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid, Sigma].
Sår assay
Når 24 timer dyrkning ble en lineær sår som genereres ved skraping av et sammenflytende monolag av celler med en pipettespiss i nærvær av enten 100 uM DHPG eller 20 uM MPEP eller 20 uM MTEP. Ufestede celler ble vasket av med omrøring. Celler ble fotografert på samme gitter sted etter 48 timer. Hver linje ble belagt og såret i tre eksemplarer.
In vitro cellemigrasjon analysen
in vitro
migrasjon av muntlige kreftceller ble evaluert ved hjelp av en Transwell kammer (Corning, Corning, NY, USA). Celler i membranporene eller celler festet til den nedre overflate av membranen ble tellet i 10 synsfelt ved høy forstørrelse (x 400). I noen eksperimenter, 100 uM DHPG, 20 uM MPEP eller 20 uM MTEP ble tilsatt til cellene seeded på det øvre kammer.
Statistisk analyse
statistiske forskjeller mellom de midler verdiene av de ulike behandlingsgruppene ble evaluert med Statview 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA) ved hjelp av en enveis ANOVA med betydning sett på
p
0,05.
Resultatene
Isolering av målgenet, metabotrop glutamatreseptor 5, som er indusert av SDF-1 /CXCR4 system
Vi undersøkte nye terapeutisk nedstrøms mål ( e) av SDF-1 /CXCR4 system ved hjelp av de orale kreftceller, B88-SDF-1, som har en autokrin SDF-1 /CXCR4 system og oppviser fjerntliggende metastatiske potensialer
in vivo
. Mikromatriseanalyse avslørte at 418 gener ble oppregulert i B88-SDF-1-celler sammenlignet med mock-celler, og at ekspresjon av metabotrofe glutamatreseptor 5 (mGluR5) økte 46 ganger (5th fra toppen) i B88-SDF-1-celler, med den høyeste stillingen som svarer til den mGluR5-reaksjonsveien, som vist med IPA (data ikke vist). Videre demonstrerte Park og kolleger at sterk mGluR5 uttrykket er assosiert med pasientens overlevelse, og at mGluR5 antagonister hemmer migrasjon av muntlige kreftceller
in vitro product: [13]. Således, analyserte vi mGluR5 som en mulig kandidat gen som er involvert i den SDF-1 /CXCR4 system. For å bekrefte spesifisiteten av mikromatriseanalyse ble mRNA-ekspresjon av mGluR5 bekreftet ved RT-PCR. I likhet med resultatene microarray, ble mRNA-ekspresjon av mGluR5 oppregulert i B88-SDF-1-celler, sammenlignet med mock-celler (figur 1 A) og inhiberes ved behandling med AMD3100 (figur 1A). Vi har tidligere vist at SDF-1 /CXCR4 system aktiverer både Ras-ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1/2, og fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt trasé [1]. Vi har derfor neste undersøkte involvering av disse banene i oppregulering av mGluR5. Ekspresjon av mGluR5 ble fullstendig opphevet ved behandling med U0126, en MEK-inhibitor og delvis hemmet med Wortmannin, et PI3K-inhibitor (figur 1B). Vi har også erholdt de tilsvarende resultater i den kvantitative RT-PCR (figur 1C). Videre er oppregulering av mGluR5-protein ble også observert i flowcytometri og immunocytokjemi Resultatene (figur 1D, E).
(A) Ekspresjon av mGluR5 mRNA ble bekreftet i B88-B88 og mock-SDF-1-celler i både nærvær og fravær av AMD3100 (1 pg /ml). Human placenta ble anvendt som en positiv kontroll (PC). (B) Celler ble behandlet med U0126 (10 nM) eller Wortmannin (50 nM) i 48 timer og mRNA-ekspresjon av mGluR5 ble analysert ved RT-PCR. (C) Ekspresjon av mGluR5 mRNA ble bekreftet ved real-time PCR. **;
p
0,01 sammenlignet med ubehandlede B88-SDF-1-celler ved en-veis ANOVA. ND; ikke oppdages. (D) Protein uttrykk for mGluR5 ble evaluert i B88-mock og B88-SDF-1 celler ved hjelp av flowcytometri. Logaritmisk voksende celler ble inkubert med eller uten anti-mGluR5 mAb og farget med PE-merket geit anti-mus IgG. Hvite og røde soner indikerer celler farget med isotype kontroll og anti-mGluR5-mAb, respektivt. (E) Protein ekspresjon av mGluR5 ble påvist ved immunocytokjemi. Kjernen var farget med DAPI (blå)
Uttrykket av glutamatreseptorer i B88-SDF-1 celler
glutamatreseptorer er delt inn i to kategorier.; mGluR’er og ionotrope GluRs (iGluRs), som er videre karakterisert som enten N-metyl-D-aspartat (NMDA), a-amino-3-hydroksy-5-metylisoksazol-4-propionsyre (AMPA) og kainat (KA) reseptorer [14,15]. Vi bekreftet ekspresjon av glutamatreseptorer involvert i SDF-1 /CXCR4-system ved anvendelse av en cDNA microarray. Av de 8 typer mGluR’er undersøkt, var bare ekspresjon av mGluR5 markert oppregulert i B88-SDF-1-celler (tabell 1). Videre, av de 14 typer av iGluRs undersøkt, ekspresjonen av GluR1, en AMPA-reseptor, økte 6-fold i B88-SDF-1-celler (tabell 2).
Gruppe
mGluR
Brett induction
*
ImGluR11.27mGluR546.13IImGluR20.98mGluR30.67mGluR40.19IIImGluR61.54mGluR71.06mGluR80.46Table 1. Expression of mGluR’er i cDNA microarray analyse. Product: * oppregulering av B88-SDF-1 celler vs B88-mock celler CSV ned CSV Gruppe
iGluRs
Brett induksjon
*
AMPAGluR16.05GluR21.42GluR3NDGluR41.04KAGluR50.46GluR60.47GluR70.84KA10.41KA20.39NMDANMDA12.34NMDA2A2.21NMDA2B0.71NMDA2C0.12NMDA2D1.23Table 2. Expression of iGluRs i cDNA microarray analyse. Product: * oppregulering av B88-SDF-1 celler vs B88-mock celler CSV ned CSV
Produksjonen av glutamat i orale kreftceller
Vi neste undersøkt produksjonen av glutamat, en mGluR5 ligand, i B88 og dets transfektanter, B88-mock og B88-SDF-1 celler. Glutamat produksjon ble påvist i det kondisjonerte medium avledet fra disse cellene ved en konsentrasjon på omtrent 12 um (tabell 3). Imidlertid glutamat produksjon var ikke avhengig av enten den SDF-1 /CXCR4 system eller ekspresjonsnivået av mGluR5.
Cells
B88
B88-mock
B88-SDF-1
Glutamat frigjøring (mm) 12,23 ± 0.3012.17 ± 0.1712.21 ± 0.29Table 3. Produksjon av glutamat i munnhulen celler.
CSV ned CSV
rollen mGluR5 på cellevekst
Vi har undersøkt effekten av mGluR5 på cellevekst ved hjelp av en bestemt mGluR5 agonist, DHPG, og to antagonister, MPEP og MTEP. Agonisten og antagonister påvirket ikke veksten av enten B88-håne eller B88-SDF-1-celler (figur 2).
A sammenflytende monolag av celler ble behandlet med enten 100 uM DHPG, 20 uM MPEP (A) eller 20 pM MTEP (B). Effekten av mGluR5 på cellevekst ble evaluert ved hjelp av MTT-analysen. Det var ingen signifikante forskjeller mellom de tre gruppene av enveis ANOVA.
Rollen mGluR5 på SDF-1 /CXCR4-avhengig cellemigrasjon
Vi neste undersøkte effekten av mGluR5 på SDF-1 /CXCR4-avhengige migrasjon av celler. Sårhelende analyser avslørte at den forbedrede motilitet av B88-SDF-1-celler ble ytterligere akselerert med DHPG behandling, men ble betydelig svekket av MPEP og MTEP behandling (figur 3A, B). Antagonister av mGluR5 også hemmet migreringen av B88-SDF-1-celler, som vist ved en migrerings kammer analysen (figur 3C). Videre DHPG forbedret F-aktin polymerisasjon ved forkanten, mens MPEP og MTEP hemmet F-aktin polymerisasjon (figur 3D-G). Vi har også observert hemming av Matrigel invasjon med MTEP behandling i B88-SDF-1-celler (data ikke vist).
(A) B88-B88 eller mock-SDF-1-celler ble dyrket til konfluens. En sårheling assay ble utført i nærvær av enten 100 uM DHPG, 20 uM MPEP eller 20 uM MTEP. (B) Den kvantitative data som er avledet fra (A). *;
p
0,05 sammenlignet med DHPG-behandlede celler ved en-veis ANOVA. (C) Den motilitet av B88-SDF-1-celler i nærvær av enten 100 uM DHPG, ble 20 uM MPEP eller 20 uM MTEP undersøkt ved anvendelse av et transwell migrasjonsanalyse. *;
p
0,05 sammenlignet med ubehandlet kontroll eller DHPG-behandlede celler ved en-veis ANOVA. (D-G) F-aktin polymerisasjon i forkant av B88-SDF-1-celler ble undersøkt ved immunocytokjemi følgende (D) ingen behandling, (E) DHPG behandling, (F) MPEP behandling og (G) MTEP behandling. Nucleus ble farget med DAPI (blå).
Effekt av mGluR5 antagonister på immunkompetente mus
Fordi mGluR5 kan være en roman metastatisk mål i kreft i munnhulen, vi evaluert bivirkninger av mGluR5 antagonister i C3 /høne mus. Ingen vekttap eller makroskopiske organ avvik ble påvist i mus som ble behandlet med mGluR5 antagonister MPEP og MTEP (data ikke vist). Videre gjorde disse antagonister ikke induserer hematotoxicities som anemi og leukocytose (figur 4A-C). Vi vurderte også bivirkninger av AMD3100 på C3H /høne mus. Ingen vekttap, makroskopiske organ unormalt eller endring i røde blodceller telle ble observert hos mus administrert med AMD3100 (data ikke vist); imidlertid vesentlig og kronisk leukocytter ble observert etter daglig s.c. administrasjon av AMD3100 (data ikke vist).
C3H /høne mus ble behandlet i.p. med MPEP (5 mg /kg), MTEP (5 mg /kg) eller det samme volum av saltvann daglig. Mus ble avlivet på dag 1, 7, 14, 21, og 28 ved blodtapping og WBC (
A
), røde blodceller (RBC, B) og hemoglobin (Hb; C) ble målt. Det var ingen signifikante forskjeller mellom de tre gruppene av enveis ANOVA.
Rollen mGluR5 i SDF-1 /CXCR4-avhengige celle metastase
Dermed vi bestemt effekten av mGluR5 antagonister på lungemetastaser av B88-SDF-1 celler. Tallrike metastatiske noduler ble funnet i lungene til mus som var inokulert med B88-SDF-1-celler (Figur 5A, venstre). Imidlertid ble en signifikant reduksjon av metastatisk lungeknuter observert hos mus behandlet med MPEP (figur 5A, midten) og MTEP (figur 5A, til høyre), som vist ved histopatologisk analyse i løpet av en 4 ukers observasjonsperiode. Vi har også bekreftet tilstedeværelsen av metastatiske kreftceller i utvinnes lungevevet ved hjelp av kvantitativ Alu-PCR. Følgelig ekspresjon av human Alu-DNA hos mus behandlet med mGluR5 antagonister var betydelig lavere enn i mus behandlet med saltvann (figur 5B).
Celler ble podet inn i blodåren på nakne mus, som ble ofret på dag 30. (A) Representant H E farging av lungene fra kontroll-behandlet (venstre), MPEP behandlet (i midten), MTEP-behandlet (høyre) nakne mus. (B) Kvantitativ analyse av Alu-PCR ble utført på de utryddet-lunge vev. **,
p
0,01 sammenlignet med saltvannskontroll ved en-veis ANOVA.
diskusjon
Glutamat er en unik ligand for mGluR5, en metabotropisk glutamat reseptor som tilhører familien av G-proteinkoblet -reseptorer [16,17] som er overalt finnes i de cerebrale cortex, hippocampus, caudate nucleus og nucleus accumbens i sentralnervesystemet (CNS) [16,17]. Det har blitt foreslått at mGluR5 er involvert i CNS-forstyrrelser som induseres av hypersekresjon av glutamat, slik som epilepsi, nevrogen eller inflammatorisk smerte, psykose, dyskinesi, hodepine og medikamentavhengighet [16,17]. På cellenivå, regulerer mGluR5 vekst og vandring av gliaceller [18], neurale stamceller forløper [19], embryonale stamceller [20] og glioma celle [21]. Selv om rollen av mGluR5 i kreft progresjon er fortsatt uklart, nyere undersøkelser tyder på at mGluR5 funksjoner i tykktarmen [22], bryst [22] og prostata kreft celler [23]. Videre demonstrerte Park og kolleger at sterk mGluR5 uttrykket er assosiert med pasientens overlevelse, og at mGluR5 antagonister hemmer migrasjon av muntlige kreftceller
in vitro product: [13]. Disse resultatene tyder på at mGluR5 fungerer som et onkogen i faste cancere, inkludert oral cancer. På den andre hånd, har nylige undersøkelser vist at glutamat er produsert av mesenchymale celler, så som osteoblaster og osteoklaster, epitelceller, for eksempel pankreatiske øyceller og keratinocytter, bryst og prostata cancer-celler [24-27]. I tillegg er produksjonen av glutamat i glioma-celler er rapportert å være assosiert med proliferasjon og invasjon [21,28,29]. I tillegg demonstrerte Bade og kolleger betydelig økt konsentrasjoner av glutamat i sera av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen, som målt ved metabolomikk analyse [30]. I den foreliggende undersøkelse, viser vi at B88-celler, og dens transfekterte derivater, produsere glutamat i sin kondisjonert medium ved en konsentrasjon på omtrent 12 pM. Disse konsentrasjonene var lik funnene beskrevet av Seidlitz og kolleger i brystkreftcellelinje, MDA-MB-231 [29]. Disse resultatene indikerer at glutamat og dens reseptor er forbundet med progresjon av kreft. Imidlertid ble det ikke observert noen forskjell i glutamat produksjon mellom B88-mock og B88-SDF-1 celler, selv om uttrykket av mGluR5, en reseptor for glutamat, ble oppregulert i B88-SDF-1 celler. Disse resultatene tyder på at ekspresjon av mGluR5, i stedet for glutamat produksjon, er nødvendig for glutamatergic system for å være involvert i SDF-1 /CXCR4 signalering.
Nylig, syntetiske mGluR5 antagonister er blitt utviklet som potensielle medikamenter for CNS-lidelser som er indusert av hypersekresjon av glutamat [11,31,32]. Det har blitt rapportert at administrering av MPEP og MTEP har blitt brukt til å effektivt behandle smertesymptomer, Parkinsons sykdom, kognisjon forstyrrelser, depresjon, angst og schizofreni [16,17]. Selv om vi opprinnelig brukt MPEP som mGluR5 antagonister i denne studien vesentlige ikke-spesifikke virkninger av MPEP, inkludert hemming av AMPA eller NMDA-reseptorer, er blitt antydet [10]. Videre har vi oppdaget at en 6-gangers økning i ekspresjon av GluR1, en AMPA-reseptor som er involvert i veksten og invasjonen av gliomceller, i B88-SDF-1-celler [33,34]. For å utelukke ikke-spesifikk effekt av MPEP på mGluR5, vi revurdert rollen mGluR5 på SDF-1 /CXCR4 systemet ved hjelp av nyutviklede mGluR5 antagonist MTEP, som er mer svært selektiv for mGluR5 og har færre off-target effekter enn MPEP [10]. Men både MPEP og MTEP hadde lignende virkninger på migrering og metastasering av B88-SDF-1-celler, noe som indikerer en spesifikk virkning av mGluR5 på SDF-1 /CXCR4 system.
Vi oppdaget additive effekter av mGluR5-agonister DHPG i migrasjonsanalysen til tross for som inneholder en stor mengde glutamat i media. Selv om vi ikke observere direkte aktivering av mGluR5, er det vurdert at DHPG aktiverer sannsynligvis mGluR5 i B88-SDF-1 celler fordi DHPG ikke forbedre migrasjon i mock celler som ikke uttrykker mGluR5 (data ikke vist). Cleva og Olive viste at mGluR5 er fysisk koblet til NMDA-reseptorer ved hjelp av forskjellige stillas proteiner, og er biokjemisk koblet til NMDA-reseptor-funksjon via PKC [35]. Videre har dette mGluR5-NMDA interaksjonen blitt observert i en rekke hjernepreparater, hvorved aktivering av mGluR5-reseptorer med DHPG potenserer NMDA-reseptor-formidlede responser til eksogent tilført glutamat eller NMDA [35]. Fordi B88-SDF-1-celler uttrykker NMDA-reseptorer i vårt mikromatriseanalyse (tabell 1), kan denne additive effekten av DHPG være på grunn av den samtidige aktivering av NMDA reseptoren svei.
I denne studien, viste vi involvering av Ras-ERK1 /2 pathway på oppregulering av mGluR5 av SDF-1 /CXCR4 system. Selv om en forbindelse mellom mGluR5 og SDF-1 /CXCR4-systemet ikke har blitt rapportert i kreftceller, har Luo og kolleger demonstrert induksjon av mGluR5 på E14.5 neurale forløperceller ved å stimulere med SDF-1. De foreslo også at mGluR5 ekspresjon av SDF-1 /CXCR4 system er indusert av transkripsjonsfaktoren, Ets, som aktiveres av ERK1 /2-signalveien [36]. Fordi
mGluR5
genet har Ets bindingsseter i sine arrangører [37], den CXCR4 /ERK1 /2 /Ets veien kan være involvert i induksjon av mGluR5 som ble observert i vårt eksperiment.
Vi gjorde det samme eksperiment ved bruk av en oral SCC-cellelinje, HNT, i hvilken ekspresjonen av CXCR4 er 7,5 ganger lavere enn det i B88-celler [1]. HNT-SDF-1-celler utviste svak, men ikke signifikant, fenotypiske endringer in vitro og in vivo [4], og mGluR5 induksjonen ble påvist bare i en marginal nivå, sannsynligvis på grunn av redusert ekspresjon av CXCR4, sammenlignet med den til B88 celler. Dermed kan CXCR4 ekspresjonsnivået og sterk nedstrøms signalisering også være avgjørende for aktivering av mGluR5 veien.
Vi oppdaget at mGluR5 antagonister betydelig hemmet SDF-1 /CXCR4-avhengige migrasjon og metastasering. Selv om SDF-1 /CXCR4-systemet hovedsakelig fungerer som et kjemotaktisk faktor i cancerceller, det er også involvert i de forskjellige metastatiske prosesser, for eksempel neovaskularisering, celleadhesjon, invasjon, utvekst og epitelial til mesenchymale overgang [38-43]. I den foreliggende undersøkelse, mGluR5 regulert cellemigrering forbundet med SDF-1 /CXCR4 system; Det er imidlertid usannsynlig at mGluR5 antagonister undertrykke SDF-1 /CXCR4-avhengig metastase bare via inhiberte cellemigrering. Selv om mGluR5 har vist seg å forbedre adhesjon og invasjon av orale kreftceller [13] og utvekst av neuralceller [44], er lite informasjon tilgjengelig angående metastaserelaterte funksjoner. mGluR aktivere både MAPK og Akt trasé, som er to kjennetegn signalveier som fremmer kreft vekst og metastase [45,46]. Dermed rettet mot mGluR5 kan undertrykke disse kritiske metastatiske stier og hemme kreft metastasering.
I vår forrige undersøkelse, vi har oppdaget CXCR4 uttrykk i ca 60% av primær oral kreft og konkluderte med at CXCR4-positive tilfeller hadde signifikant dårligere prognose enn CXCR4-negative saker [3]. Selv om vi ikke undersøke uttrykket av mGluR5 i muntlig kreft vev, Park og kolleger viste at 70% av oral cancer uttrykker mGluR5 og at overekspresjon av mGluR5 reduserer overlevelsen av pasienter med kreft i munnhulen [13]. Til sammen er det sammenheng mellom CXCR4 og mGluR5 sterkt anbefalt for å fremme utviklingen av kreft i munnhulen.
