Abstract
Flere aktiviteter er tilskrevet cytokin tumor nekrose faktor (TNF) i helse og sykdom. Spesielt ble TNF vist seg å påvirke karsinogenese på flere måter. Dette cytokin virker via aktivering av to celleoverflatereseptorer, TNFR1, som er forbundet med inflammasjon, og TNFR2, som ble vist å forårsake antiinflammatorisk signalering. Vi vurderte effekten av TNF og sine to reseptorer på utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen med
in vivo
bioluminesens bildebehandling i en syngene orthotopic svulst musemodell med Panc02 celler. Mus mangel for TNFR1 ikke var i stand til å spontant avvise Panc02 svulster og vises dessuten forbedret tumorprogresjon. I motsetning til en brøkdel av villtype (37,5%), TNF mangelfull (12,5%), og TNFR2 mangelfull mus (22,2%) var i stand til fullt ut å avvise tumoren i løpet av to uker. Pankreastumorer i TNFR1 mangelfull mus vises økt vaskulær tetthet, økt infiltrasjon av CD4
+ T-celler og CD4
+ gaffelhode boksen P3 (foxp3)
+ regulatoriske T-celler (T
reg), men redusert tall av CD8
+ T-celler. Disse endringene ble videre fulgt av transcriptional oppregulering av IL4. Således, TNF og TNFR1 er nødvendig i pankreatisk duktalt karsinom for å sikre optimal CD8
+ T-celle-mediert immunosurveillance og tumor avvisning. Eksogene systemisk administrering av human TNF, men som bare samvirker med murine TNFR1, akselerert tumorprogresjon. Dette tyder på at TNFR1 har i utgangspunktet mulighet i Panc02 modell for å utløse pro-og anti-tumoreffekter, men tid og rom tilgjengeligheten av TNF ser ut til å bestemme endelig det samlede resultatet
Citation. Chopra M, Lang jeg, Salzmann S, Pachel C, Kraus S, Bauerlein CA, et al. (2013) tumornekrosefaktor Induserer Tumor Fremme og Anti-tumor Påvirkning av kreft i bukspyttkjertelen via TNFR1. PLoS ONE 8 (9): e75737. doi: 10,1371 /journal.pone.0075737
Redaktør: Dominik Hartl, Universitetet i Tübingen, Tyskland
mottatt: 24 juli 2013; Akseptert: 21. august 2013, Publisert: 30.09.2013
Copyright: © 2013 Chopra et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung der Universität Würzburg [gir B-149, B-233], Deutsche José Carreras Leukämie-Stiftung eV (R /06/17), Deutsche Forschungsgemeinschaft [tilskudd SFBTR 52 Z2, Wa 1025 /18-1, KFO 216 TP8, og Ma 760 /19-1] og Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2010_Kolleg.52) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA) er en av de mest ødeleggende malignitet med usedvanlig dårlig 5-års overlevelse og svært begrensede behandlingsalternativer [1] – [3]. Ulike signalveier er gjennomtrengt på kreft i bukspyttkjertelen, og dette ikke bare påvirker kreftceller direkte, men også gjelder for de stromale celler i og rundt svulsten [4] – [6]. Spesielt NF-kB-signalering er vanligvis deregulert i PDA [7] – [9]. En stor aktivator av NF-kB er cytokinet tumor nekrose faktor (TNF), som hovedsakelig produseres av aktiverte immunceller, spesielt makrofager og T-celler, men kan også uttrykkes av tumorceller [10], [11].
TNF er et trimert transmembrane type II-protein fra hvilken en løselig form frigjøres ved proteolytisk prosessering. De to former av TNF samhandler med to reseptorer, og TNFR1 TNFR2, men varierer i deres evne til å aktivere disse reseptorene. Membranbundet TNF aktiverer sterkt begge reseptorer, mens oppløselig TNF, til tross for binding til TNFR2, aktiveres bare TNFR1 ordentlig [12]. Mens TNFR1 er en typisk representant for den død domene-inneholdende undergruppe av TNF-reseptor-protein-familien, tilhører TNFR2 til TRAF-vekselundergruppen. Selv om har en død domene, TNFR1 som respons på TNF initierer primært pro-inflammatoriske signalveier som fører til aktivering av NF-kB transkripsjonsfaktorer og forskjellige MAP-kinaser, men vanligvis ikke i celledød induksjon. Det fremgår av analysen av TNFR1 og TNFR2 knockout-mus at mange immunregulerende prosesser kontrolleres av de to TNF-reseptorer på en antagonistisk, additiv eller synergistisk måte, men det er også bevis for autonome funksjoner av hver av de to reseptorer [11], [1. 3]. Spesielt ble TNFR2 vist seg å spille en viktig rolle i homeostase av immundempende regulatoriske T-celler (T
regs) [14] -. [16]
I bukspyttkjertelkreft TNF spiller en kompleks ennå til nå dårlig forstått rolle [17] – [23]. Her adressert vi hvordan TNF og dets reseptorer påvirke immun kontroll av PDA i en orthotopic syngene mus modell. Tap av TNFR1 i verten opphevet tumorkontroll, og resulterte i forbedret tumorvekst. TNFR1 mangel forårsaket deregulering av T-celleinfiltrasjon og aktivering. Vi foreslår en ny anti-tumorigen Vertskapsrollen TNFR1 i PDA hvor TNF-TNFR-interaksjoner regulere homeostase av både regulatoriske og cytotoksiske T-celler avgjøre om PDA er kontrollert og til slutt avvist eller vokser progressivt.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Alle forsøkene ble utført i henhold til de tyske reglene for dyreforsøk. Studien ble godkjent av Regierung von Unterfranken som ansvarlig myndighet (Permit Number 55.2-2531.01-76 /10). Alle operasjoner ble utført under esketamine /xylazin anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Dyr
C57Bl /6 mangel for TNF (B6.129S-Tnf
tm1Gkl /J , kort B6.TNF KO), TNFR1 (C57BL /6-Tnfrsf1a
tm1Imx /J, kort B6.TNFR1 KO), TNFR2 (B6.129S7-Tnfrsf1b
tm1Imx /J, kort B6.TNFR2 KO), TNFR1R2 (B6.129S-Tnfrsf1a
tm1ImxTnfrsf1b
tm1Imx /J, kort B6.TNFR1R2 KO) ble opprinnelig hentet fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) og backcrossed til albino C57Bl /6 bakgrunn (C57BL /6J-Tyr c-2J-mus, Jackson Laboratories) for forbedret
in vivo
bioluminiscens avbildning følsomhet (redusert lysabsorpsjon på grunn av mangel av melanin i hud) som tidligere beskrevet [16]. Genotyper av KO mus ble rutinemessig sjekket av PCR. Hunnmus ble brukt til eksperimenter mellom 8 og 12 ukers alder. Alle mus ble avlet innenfor den angitte patogen-frie dyr anlegget for Senter for Experimental molekylærmedisin ved Universitetssykehuset, Würzburg motta gnager chow og autoklaveres drikkevann ad libitum.
Cell Culture
For lentiviral transduksjon av Panc02 celler [24], 293 T-celler ble transient transfektert med en standard kalsiumfosfatutfelling protokollen i 10 cm skåler med 10 ug pMDL og 5 pg RSV-REV emballasje plasmider, 6 ug VSV /G konvolutt plasmid og 20 jjg EGFP og ildflue luciferase koding plasmid FUGLW. To dager senere ble supernatanten inneholdende de lentiviral partiklene aspirert, filtrert gjennom et 0,45 um-filter, ble 8 ug /ml polybrene tilsatt, og blandingen ble anvendt til å transdusere tumorcellene. De omsatte cellene var flyt sortert to ganger for EGFP-uttrykk, betegnes heretter Panc02-FUGLW. Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% antibiotika (penicillin, streptomycin), L-glutamin og 0,1% β-merkaptoetanol. Cellene ble trypsinert og passaged to ganger ukentlig. Cellekulturmedium og kosttilskudd ble oppnådd fra Invitrogen (Darmstadt, Tyskland), alt plast ware var fra Greiner BioOne (Frickenhausen, Tyskland). Panc02-FUGLW cellene er syngene til C57BL /6 mus.
ortotopiske PDA Modell og in vivo Bioluminesens Imaging
Panc02-FUGLW celler ble trypsinert, høstet og vasket to ganger med PBS. Resipientmus ble bedøvet med i.p. injeksjon av 80 mg /kg kroppsvekt (bw) esketamine hydroklorid (Pfizer, Berlin, Tyskland) og 16 mg /kg xylazin (cp Pharma, Burgdorf, Tyskland) og plassert på en 37 ° C varmeplate. Panc02-FUGLW celler ble injisert orthotopically som beskrevet andre steder [17], [25] med små modifikasjoner. I korthet, ble bukhulen åpnet av en minimal invasiv tverrgående laparotomi. Lederen i bukspyttkjertelen ble identifisert og externalized. 1 × 10
4 levedyktige Panc02-FUGLW celler ble sakte injisert i 30 mL PBS inn i hodet på bukspyttkjertelen ved hjelp av en 710 RN 100 ul Hamilton sprøyte med Gauge 28, 10 mm, Point Style 4 p (Hamilton sprøyte, Bonaduz , Sveits). Bukspyttkjertelen ble plassert tilbake i bukhulen og peritoneum og huden ble lukket ved å kjøre enkelt lag av polyglaktin 6-0 suturer (Johnson Johnson, Norderstedt, Tyskland).
TNF behandling, mus ble injisert ip med 5 ug human TNF i 200 ul PBS annen hver dag fra og med dagen for tumorcelle inokulering. For
in vivo
bioluminesens bilde [26], mus ble bedøvet og co-injisert med 300 mg /kg kroppsvekt D-luciferin (BIOSYNTH, Staad, Sveits). Ti minutter senere ble Bioluminescens signaler fra bedøvede mus vurderes med en IVIS Spectrum bildesystem (Caliper Life Sciences, Mainz, Tyskland). Bildene er tatt fra den laterale visning i automatisk modus med en maksimal eksponeringstid på fem minutter per bilde. Bildene ble evaluert ved hjelp av levende bilde 4.0-programvaren (Caliper Life Sciences).
Ex vivo
Imaging
På dag 23 eller 30 etter tumorcelle inokulasjon, mus ble injisert med D -luciferin og 10 minutter senere avlives. Indre organer ble fjernet og utsatt for
ex vivo
bioluminesens bilde [26]. Vevsprøver ble forankret i Tissue Tek OCT (Sakura Finetek, Staufen, Tyskland) for videre histologisk analyse.
Isolering av immunceller fra bukspyttkjertelen Tissue og Milter
Vev ble hakket med en kirurgisk kniv og oppsluttet i 45 minutter ved 37 ° C med 2 mg /ml kollagenase D og 0,1 mg /ml DNase i (begge fra Roche, Mannheim, Tyskland). Tissue stykker ble most gjennom en 70 mikrometer celle sil og spunnet ned. Cellepelleten ble resuspendert i erytrocytt lyseringsbuffer (168 mM NH
4Cl, 10 mM KHCO
3, 0,1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)) og inkubert i 2 minutter. Deretter 10 volumer av PBS ble tilsatt, og cellene ble sentrifugert ned igjen. Den resulterende pellet ble resuspendert i PBS, og cellene ble anvendt for strømningscytometri. Milt ble direkte filtrert gjennom en 70 mikrometer celle sil inn erytrocytt lysebuffer og vasket en gang med PBS.
immunfluorescens Mikros
Cryo-embedded vev ble kuttet i 3 mikrometer tykke seksjoner på en Leica CM1900 cryostat (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og monteres på frostet lysbilder. Objektglassene ble lufttørket og fiksert med aceton ved romtemperatur i 7 minutter. Platene ble vasket og blokkert med 2% FBS i PBS i 15 minutter. Når biotin-konjugerte antistoff ble anvendt, ble ytterligere blokkering ved hjelp av et avidin /biotin Blokkering kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) utføres. Platene ble deretter inkubert med de passende antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Mellom antistoff-inkubasjoner, ble platene vasket med PBS tre ganger. Lysbilder ble kontra med DAPI og montert med montering medium (Vector Laboratories). Antistoffer som ble brukt var: CD11b-Alexa 647 (M1 /70), CD31-Biotin (MEC13.3), CD4-Alexa 647 (GK1.5), CD8-Biotin (53 til 6,7), foxp3-renset (FJK-16) (eBioscience), esel-anti-rotte-Cy3 (Dianova, Hamburg, Tyskland), F4 /80-Alexa 488 (CI: A3-1), GR-1-Biotin (RB6-8C5), streptavidin-Alexa 546 (Invitrogen ). Bilder ble oppnådd med en Zeiss Imager.Z1m fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Göttingen, Tyskland) og evaluert med Zeiss AxioVision programvare (Carl Zeiss). Immunceller ble talt og gitt som celler /mm
2 eller som piksler /150 000 mikrometer
2 som vurderes av Image J programvare (NIH, Bethesda, MD).
flowcytometrisystemer
Cellene ble blokkert med normalt rotteserum (1:20 i PBS) og farget med egnede antistoffer ved 4 ° C i 30 minutter. Etter overflateantigen farging ble cellene vasket en gang med PBS og merket med propidiumjodid. For intracellulær farging ble cellene farget med LIVE /DEAD fikses fiolett død celle flekk kit (Invitrogen) og bearbeides videre ved hjelp av musen regulatoriske T cellefarging kit # 2 (eBioscience, Frankfurt, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Antistoffer som ble brukt var fra Biolegend (Uithoorn, Nederland) hvis ikke annet er oppgitt: α4β7-PE (DATK32), CCR4-APC (2G12), CCR5-PE (C34-3448), CCR7-APC (4B12), CD102-Biotin ( 3C4 (MIC2 /4)), CD103-Pacific Blue (2E7), CD106-Alexa 488 (429), CD107a-FITC (1D4B), CD107b-Alexa 647 (M3184), CD11-PE (M17 /4) (BD) , CD11b-Alexa 647 (M1 /70), CD11b-PE /Cy7 (M1 /70), CD11c-Alexa 647 (N418), CD25-PE (PC61.5) (eBioscience), CD24-PE (LG.7F9) (eBioscience), CD29-PE (HMβ1-1), CD4-FITC (RM4-5) (eBioscience), CD4-APC (RM4-5), CD44-PE (IM7), CD45.1-PE (A20), CD45.2-APC (104), CD49d-Alexa 647 (RI-2), CD49f-Alexa 488 (GoH3), CD54-PE (YN1 /1.7.4), CD62E-PE (10E9.6) (BD), CD62L-APC /Cy7 (MEL-14), CD69-Pacific Blue (H1.2F3), CD8-PE /Cy7 (53 til 6,7), CXCR3-APC (CXCR3-173), CXCR4-Alexa 488 (2B11) (eBioscience ), E-selektinuttrykk IgG-fusjonsprotein (R D Systems, Wiesbaden, Tyskland), F4 /80-Alexa 488 (C1: A3-1), foxp3-APC (FJK-16) (eBioscience), Ly6G-PE (1A8 ) (BD), P-selektin IgG-fusjonsprotein (BD), TNFR1-APC (55R-286), TNFR2-PE (TR75-89), geite-anti-humant IgG-PE (Jackson), streptavidin-Alexa 546 ( Invitrogen). Alle forsøkene ble utført på en BD FACS Canto II (BD) og eksempeldata registreres ved hjelp av BD FACSDiva programvare og analysert ved hjelp av FlowJo programvare (Tre Star, Ashland, OR, USA).
RNA Isolation, Reverse Transcription og QRT -PCR
RNA ble isolert fra vevsprøver ved hjelp Qiashredder og RNeasy mini kit spin kolonner (Qiagen, Hilden, Tyskland). 1 mikrogram total RNA ble revers transkribert ved hjelp av QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Uttrykk for gener av interesse (primer sekvenser kan finnes i tabell 1) ble analysert på en iCycler termocykler (Bio-Rad, Munchen, Tyskland) ved anvendelse av iTaq Universal SYBR grønn Supermix (Bio-Rad) og β-aktin som referanse genet. Expression nivåer ble beregnet ved hjelp av ΔΔC
T-metoden.
In vitro
TNF behandling og vurdering av metastatisk Capabilities
1 × 10
5 Panc02 celler per brønn ble sådd ut i 6-brønners plater og fikk stå over natten. Celler ble behandlet med 1,67 nM human TNF eller 1,67 nM murine TNF i 48 timer, høstet ved forsiktig skraping monolaget av plastoverflate, vasket to ganger med PBS og vurdert for ekspresjon av adhesjonsmolekyler og kjemokinreseptorer ved flowcytometri.
for å teste evnen til Panc02 celler til å feste til forskjellige ekstracellulære matrix komponenter ble CytoSelect 48-brønnen celleadhesjonsanalyse (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) brukes i henhold til produsentens anvisninger. For å teste evnen til Panc02 celler til å invadere kjelleren membran ble CytoSelect 24-Well Cell Invasion analysen (Cell Biolabs) som brukes i henhold til produsentens anvisninger.
Ubehandlede og TNF-behandlede Panc02 celler ble videre undersøkt for aktivitet av matriks-metalloproteinaser MMP-2 og MMP-9 med gelatin zymografi. For protein isolasjon, ble hjertemuskelen vev fra et infarkt mus hjertet så vel som Panc02-FUGLW celle pellets homogenisert med Ripa buffer og PMSF (Cell Signaling, Frankfurt, Tyskland). Prøvene ble separert på en 10% polyakrylamidgel inneholdende 2,5 mg /ml gelatin ved en konstant spenning på 120 V i 2 timer ved 4 ° C. Etter elektroforese ble proteinene renaturated ved inkubering av gelene i 2,5% Triton X-100 i 90 minutter ved romtemperatur. Gelene ble deretter inkubert i aktiveringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM CaCl2, 0,2 M NaCl og 0,02% Brij-35) i 12 timer ved 37 ° C. Til slutt ble gelene farget i 1 time med 0,5% Coomassie blå farging løsning og deretter avfarget i 40% volum /volum metanol, 10% volum /volum eddiksyre åpenbare bånd for renhold som indikerer proteolytisk aktivitet. Bandet intensiteten ble kvantifisert ved hjelp ImageJ (versjon 1.44p)
statistikker
Alle grafer vises er kombinert data fra minst to uavhengige forsøk.; antall dyr er angitt i figuren legender. Alle data er vist som gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien. Tallene ble fremstilt ved bruk av GraphPad Prism 5-programvaren (La Jolla, CA, USA) og Adobe Photoshop 7 (San Jose, CA, USA). Alle gruppene ble sammenlignet med villtype eller ubehandlet kontrollgruppe, med henholdsvis to-halet uparet t-test ved bruk av GraphPad INSTAT 3 programvare. Data nådde statistisk signifikans er angitt som: * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01
Resultater
Tap av Host TNFR1 opphever Spontan Avslag på ortotopiske Panc02 Svulster
I. for å følge tumorvekst non-invasiv i en syngene mus modell av PDA, genererte vi Panc02 celler uttrykker EGFP og ildflue luciferase (Panc02-FUGLW) og injisert 1 × 10
4 av disse kreftceller orthotopically inn albino villtype C57BL /6 mus og albino C57Bl /6 mus mangel for TNF, TNFR1, TNFR2 eller begge TNFR’er. I alle genotyper vurdert, Panc02-FUGLW svulster i utgangspunktet vokste de første 7 dagene etter tumorinokulasjon (figur 1A og B). 3/8 B6 villtype mus, 1/8 B6.TNF KO mus, og 2/9 B6.TNFR2 KO-mus spontant forkastet tumoren i løpet av 14 dager. I motsetning 13/13 mus mangel for TNFR1 eller TNFR1 og TNFR2 kunne ikke avvise svulsten.
In vivo
BLI (figur 1A og B) og
ex vivo
BLI en måned etter tumorinokulasjon (figur 1C og D) også avdekket betydelig høyere tumorbelastning i mus som mangler for TNFR1 (eller TNFR1 og TNFR2) enn i villtype mus. Dermed TNFR1 dukket opp som en viktig faktor for kontroll og avvisning av Panc02 svulster.
Murine bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (Panc02) celler ble omformet til å stabilt uttrykke EGFP og ildflue luciferase og 10
4 tumorceller ble injisert orthotopically inn i albino C57Bl /6-mus. Tumorvekst i villtype mus (B6.WT) og mus som var mangelfull for TNF eller dets reseptorer ble bestemt av
in vivo
BLI. Et: Tumorvekst vist som total utstråling (B6.WT n = 8, B6.TNF KO n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6, B6.TNFR2 KO n = 9, B6.TNFR1R2 KO n = 7). B: Eksempler på bilder av bilde tidsforløpet av en mus som spontant avvist svulsten (til venstre) og en mus som ikke kunne kontrollere tumorprogresjon (til høyre). C:
Ex vivo
bildebehandling én måned etter tumorcelle vaksinasjon. Indre organer ble fotografert for tilstedeværelse av tumorceller. Eksemplariske bilder av en mus som spontant avvist svulsten (I), en mus med lav tumorbyrde (II), og en mus med stor tumorbyrde (III). D: Bukspyttkjerteltumorstørrelse én måned etter Panc02 inokulasjon vises som total utstråling (B6.WT n = 8, B6.TNF KO n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6, B6.TNFR2 KO n = 9, B6.TNFR1R2 KO n = 5). * P≤0.05, ** p≤0.01. Kombinerte data fra fire uavhengige forsøk.
Panc02 Svulster Vis Altered T celleinfiltrasjon i B6.TNFR1 KO mus
Deretter analyserte vi immuncelleinfiltrasjon inn Panc02-FUGLW svulster dyrket i enten C57Bl /6 villtype eller C57Bl /6-mus mangelfull for TNF, TNFR1 eller TNFR2 (figur 2 og tabell 2) for å ta opp om tapet av tumorkontroll kan være relatert til forandringer i immunceller infiltrat av tumoren. Tap av TNFR1 korrelert med redusert antall infiltrerende CD8
+ T-celler og økt antall av infiltrerende CD4
+ foxp3
+ T
regs. TNFR1 mangel dessuten betydelig økt vaskulær tetthet som vurderes av CD31-uttrykk, men ikke signifikant endre infiltrasjon med medfødte immunceller av myeloid avstamning (CD11b
+, F4 /80
+, GR1
+ celler). De endrede T-celle infiltrasjon mønstre av Panc02-FUGLW svulster fra B6.TNFR1 KO en måned etter vaksinasjon bedt oss om å vurdere T-celle fenotype i tidlig stadium av svulstvekst. Derfor, analyserte vi ekspresjonen av aktiveringsmarkører på CD4
+ og CD8
+ T-celler 7 og 15 dager etter tumorcelle-injeksjon (figur 3). T-celleaktivering markører bare subtilt forskjellig. Likevel, observerte vi en trend mot høyere aktivering med tiden av CD8
+ T-celler (uttrykk av CD25 og CD69) og lavere aktivering av CD4
+ T-celler (uttrykk CD27, CD54, og CD69). Tumorvekst var sterkt assosiert med myeloid betennelse. Flowcytometri avdekket økte prosentandeler av CD11b
+ og Ly6G
+ -celler i bukspyttkjertelen over tid uavhengig av den genetiske bakgrunn av tumorbærende mus. Interessant, på et systemisk nivå, tap av TNFR1 resulterte i betydelig redusert CD11b
+ og Ly6G
+ antall celler i milten av tumor-bærende mus. Økt tumorvekst innen pankreata av TNFR1 KO mus ble bekreftet av betydelig forhøyet antall EGFP
+ Panc02-FUGLW celler i disse musene to uker etter tumorinokulasjon (figur 3).
Panc02-svulster ble Eksplanterte en måned etter tumorcelle vaksinasjonen, ble påfølgende histologiske snitt farget for angitt immuncellepopulasjoner og blodårer (CD31). Pankreastumorer resulterte i en strøm av immuncellepopulasjoner i det medfødte og adaptive immunsystemet som ikke ble observert i friske bukspyttkjertelen vevet under steady-state. Av notatet, mangel på TNFR1 resulterte i en redusert cytotoksisk CD8
+ T-celle infiltrasjon men økte T
reg celle infiltrasjon. Eksempler photomicrographs vises. Scale bar indikerer 100 mikrometer.
pankreata og milten fra naive og tumorbærende mus en og to uker etter tumorcelle inokulering ble eksplanterte og forberedt som enkeltcellesuspensjoner. T-celler ble analysert for ekspresjon av aktiverings-assosierte overflatereseptorer ved strømningscytometri. Videre ble prosent av T
regs, myeloide celler og kreftceller bestemmes av flowcytometri (w /o tumor: B6.WT n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6; d + 7: B6.WT n = 7, B6.TNFR1 KO n = 6; d + 15: B6.WT n = 7, B6.TNFR1 KO n = 7). * P≤0.05, ** p≤0.01. Kombinerte data fra fire uavhengige forsøk.
Å vurdere mekanistiske forskjeller i tumorkontroll mellom villtype og TNFR1 KO mus videre, vurdert vi uttrykket av immundempende gener og forskjellige cytokiner i Panc02-FUGLW tumorer (figur 4). Her, observerte vi på et transkripsjonsnivået signifikant økt ekspresjon av Galectin-9 og IL-4, mens ekspresjonen av iNOS ble vesentlig redusert.
Panc02-tumorer ble eksplantert en måned etter tumorcelle inokulering og total RNA ble isolert fra tumorvevet. RNA ble revers transkribert og forsterket ved QRT-PCR. Dataene er presentert som relative uttrykk i tumorer avledet fra B6.TNFR1 KO-mus sammenlignet med tumorer avledet fra villtype (WT) mus (B6.WT n = 3, B6.TNFR1 KO n = 4). * P≤0.05.
eksogen TNF induserer ikke metastaser tross Styrking tumorvekst og påvirke T
reg Homeostase
TNF ble vist å øke tumorcelle metastaser i flere
in vivo
musemodeller [27] – [29] inkludert en orthotopic xenotransplantasjon modell av PDA med pancreatectomy-indusert metastase [17]. For å teste om TNF påvirker også Panc02-FUGLW tumorvekst og metastase, behandlet vi tumor-bærende mus med rekombinant human TNF, som bare binder seg til murine TNFR1, annenhver dag i tre uker etter tumorcelle inokulering. Dette betydelig økt samlede tumorvekst innen pankreata og ablated spontan svulst avvisning som vurderes med
in vivo Hotell og
ex vivo
BLI (figur 5A og B), men fremkalte ikke metastaser til leveren, nyrer, eller mesenteriet (data ikke vist). Vi har også analysert infiltrasjon av CD8
+ og CD4
+ T-celler og T
kjørte inn i svulster i ubehandlede og TNF-behandlede dyr og faktisk observert at human TNF behandling i betydelig grad øke T
reg tall innenfor de tumorer (tabell 3). Siden vi og andre har funnet tidligere at TNFR2 heller enn TNFR1 på T
regs er nødvendig for å drive sin ekspansjon [14] – [16], peker dette til en indirekte mekanismen som administrering av humant TNF utløser T
reg ekspansjon i vår modell PDA.
10
4-tumorceller ble injisert inn i milten hos albino B6.WT mus. Musene var enten ubehandlet eller behandlet hver annen dag med 5 ug rekombinant human TNF. Tumorvekst ble bestemt av
in vivo
BLI. A: Tumor vekst vises som total utstråling (ubehandlet n = 11, TNF n = 10). B:
Ex vivo
bildebehandling 23 dager etter tumorcelle vaksinasjon. Indre organer ble fotografert for tilstedeværelse av tumorceller. Bukspyttkjertelen tumorstørrelse vises som total utstråling (ubehandlet n = 11, TNF n = 10). ** P≤0.01. Kombinerte data fra to uavhengige forsøk.
Panc02 Cells viser liten in vitro evner for metastaser
På grunn av begrenset metastatisk aktivitet Panc02 celler
in vivo
vi analyserte metastatiske egenskapene til disse cellene
in vitro
spesielt også på TNF stimulering. Panc02 celler følges ekstracellulære matrix proteiner fibronektin, laminin jeg og fibrinogen, men verken kollagen jeg eller IV. Hverken human eller murin TNF modifisert adhesjon av celler til Panc02 ekstracellulære matriks-komponenter (figur 6A) til tross for sterk utløser av den klassiske NF-kB pathway (data ikke vist). Deretter analyserte vi Panc02 celler for deres ekspresjon av proteiner involvert i adhesjon og migrering av celler (figur 6B). Vi har funnet at PDA-tumorceller for å uttrykke CD29 (integrin β1), CD49f (integrin α6), og CD107a og b, hvis ekspresjon ble ikke modulert av TNF. CD106 (VCAM-1) ekspresjon, men ble indusert av TNF. Vi vurderte også invasiv evnen til Panc02 celler ved hjelp av en
in vitro
invasjon analyse og måling gelatinolytisk aktiviteter (Figur 6C). TNF ikke signifikant induserer invasjonen og mens infarkt mus myokard viste MMP-9 og -2 aktiviteter, Panc02 celler ikke, uavhengig av TNF stimulering. I sum, resultatene av
in vitro
analyse av metastaserelaterte faktorer bekreftet begrenset metastatisk aktivitet observert med Pan02 celler
in vivo
.
Panc02 celler ble behandlet med 1.67: Adhesjon til forskjellige ekstracellulære matrix proteiner (n = 4). B: Strømningscytometrisk bestemmelse av ekspresjonen av proteiner involvert i adhesjon og migrasjon (n = 3). C: Invasive egenskapene Panc02 celler. Venstre panel:
In vitro
invasjon av basalmembran (n = 3). Høyre panel: Gelatin zymografi av tumorcelleprøver. Infarkt mus hjerte-lysat ble anvendt som en positiv kontroll (n = 4).
diskusjon
Her vi demonstrert at TNFR1 er en viktig reseptor for den immunologiske kontroll av PDA. Tap av denne reseptoren i verten fører til forstyrrelser av immuncelleinfiltrasjon inn i svulsten og ablates immunosurveillance mekanismer. Likevel eksogene aktivering av TNFR1 med rekombinant TNF i tumorbærende dyr resultert i forbedret tumorprogresjon, taler for et tveegget rollen som TNF-TNFR1-interaksjoner i PDA tumorkontroll.
En fersk studie analysert T antigen indusert flertrinns carcinogenesen i bukspyttkjertelen holmer og funnet ut at når man er i villtype mus infiltrere CD4
+ T-celler indusert tumor dormancy, tap av TNFR1 på disse cellene byttet dem til en tumor-fremme fenotype ved å stimulere angiogenese [18]. Disse observasjoner er i overensstemmelse med våre resultater, dvs. tap av TNFR1 økte vaskulære tettheter innenfor tumorer. Mens TNFR1-mangel ikke konsekvent endre aktivering fenotype av tumor-infiltrerende T-celler, fant vi mer CD4
+ T-celler infiltrere svulstene i TNFR1-mangelfull enn villtype mus. Videre har vi observert redusert antall av infiltrerende CD8
+ T-celler og økt antall T
regs. Chee og medarbeidere fant tap av TNFR1 i NOD-mus for å beskytte dem mot diabetes ved å påvirke homing av konvensjonelle T-celler inn i bukspyttkjerteløyer og samtidig øke antall T
reg-celler [30]. I vår modell TNFR1 mangel medført endringer i uttrykket av IL-4, Galectin-9, og iNOS. I tråd med dette har IL-4 blitt beskrevet som en potent T
H2 cytokin [31] som ble foreslått å fremme PDA tumorcellevekst og dermed spille en aktiv rolle i tumorprogresjon av dette malignitet [32], [33 ]. Galectin-9 undertrykker T
H1 immunfunksjoner [34] og induserer T
regs [35]. Rollen til dette proteinet i PDA er ikke godt etablert, ikke desto mindre, økt ekspresjon av både IL-4 og Galectin-9 kan antyde mot en mekanisme for å forklare øket CD4
+ T-celler og T
reg infiltrering inn Panc02 tumorer dyrket i TNFR1-manglende mus. iNOS ble beskrevet å være oppregulert i pankreastumorer [36], [37].
Rollen TNF i bukspyttkjertelen tumorprogresjon er kontroversielt. Selv om noen studier viste anti-tumorigene egenskaper av TNF [19], [21], andre har vist de motstående resultater [17], [20]. Vi viser her en pro-tumorigen funksjon av systemisk aktiv TNF som behandling av tumorbærende mus med dette cytokinet betydelig økt tumorvekst. Dette går sammen med forhøyet antall T
regs innenfor svulster. Vi har nylig vist en tilsvarende mekanisme i B16F10 lungemetastase modell [16] hvor eksogent TNF behandling forbedret tumorvekst i et T
reg-avhengig måte.
TNF er kjent for å spille en rolle i å fremme cancer metastase [16] – [17], [27] – [29]. Til tross for dette, har vi ikke observere økt metastasering av primær Panc02 svulst på leveren ved eksogen TNF behandling. Mens PDA lett metastasizes i andre modeller [17], [38] og i menneske-pasienter [39], [40], den Panc02 tumoren synes ikke å ha evnene til å metastasere spontant. Tumorcellene viste svært lite gelatinolytisk kapasitet og
in vitro
verken deres invasive eller deres klebende evner ble modulert av TNF stimulering.
I sammendraget, foreslår vi en rolle TNFR1 i tumor immunosurveillance av PDA . Mens våre data taler for en immun mediert anti-tumorigen effekt av TNF via TNFR1, som advarende resultat vi også observert at eksogene behandling av tumorbærende mus med TNF utvidet tumorvekst snarere enn kontrollert den.
