Abstract
Formål
Denne studien evaluerte forekomst og potensiell klinisk betydning intratumoral
EGFR
mutasjons heterogenitet i kinesiske pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
Materialer og metoder
Åttifem stadium IIIa-IV NSCLC pasienter som hadde gjennomgått palliativ kirurgisk reseksjon ble inkludert i denne studien. Av disse 45 pasientene gjennomført
EGFR
mutasjoner (gruppe-M) og 40 pasienter var vill-type (gruppe-W). Hver tumorprøve ble microdissected å gi 28-34 svulst foci og intratumorale
EGFR
mutasjon ble bestemt ved hjelp av denaturering High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) og Amplification Ildfast Mutation System (armer).
EGFR
kopiere numre ble målt ved bruk av fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Resultater
mikrodisseksjon ga 1431 svulst foci fra
EGFR
mutant pasienter (gruppe -M) og 1,238 foci fra villtype pasienter (gruppe-W).
EGFR
mutante frekvenser i gruppe-M var 80,6% (1154/1431) og 87,1% (1247/1431) med DHPLC og armer, henholdsvis. En kombinasjon av
EGFR
-mutated og villtype celler ble påvist i 32,9% (28/85) av prøvene ved DHPLC og 28,2% (24/85) av ARMS, støtte forekomsten av intratumoral heterogenitet. Trettien pasienter (36,5%) ble identifisert som
EGFR
FISH-positiv. Pasienter som hadde intratumoral mutasjons heterogenitet besatt lavere
EGFR
kopiere numre enn de tumorer inneholdt mutante celler alene (16,7% vs. 71,0%,
P
0,05). Blant 26 pasienter som hadde fått EGFR-TKI, var gjennomsnittlig
EGFR
mutasjon innholdet var høyere hos pasienter som viser partiell respons (86,1%) eller stabil sykdom (48,7%) sammenlignet med pasienter som opplever progressiv sykdom (6,0%) (
P
= 0,001). Det viste også sammenheng mellom progresjonsfri overlevelse (PFS) og forskjellig innhold av EGFR mutasjons grupper (ren villtype EGFR, EGFR mutasjon med heterogenitet og ren mutert EGFR) (
P
= 0,001).
Konklusjon
Om lag 30% av pasientene intratumoral
EGFR
mutasjons heterogenitet, følger med relativt lav EGFR kopiantall.
EGFR
mutant innholdet ble korrelert med responsen og prognose av EGFR-TKI
Citation. Bai H, Wang Z, Wang Y, Zhuo M, Zhou Q, Duan J et al. (2013) Detection og kliniske betydningen av intratumorale
EGFR
mutasjons heterogenitet i kinesiske pasienter med avansert ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (2): e54170. doi: 10,1371 /journal.pone.0054170
Redaktør: William CS. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 21. august 2012; Godkjent: 07.12.2012; Publisert: 13. februar 2013
Copyright: © 2013 Bai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Sciences Foundation Distinguished Young Scholars [81025012]; og National naturvitenskap Foundation Generelt Program [81172235]; og Beijing Health Systems Faglig Leder [2011-2-22]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Epithelial vekstfaktor reseptor-tyrosinkinasehemmere (EGFR-TKI) som gefitinib og erlotinib hadde blitt brukt i stor grad til behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Flere rapporter har antydet at pasienter behandlet med EGFR-TKI utstillings forbedret behandlingseffekt og overlevelse ganger når de bærer aktive mutasjoner i
EGFR product: [1] – [6]. Imidlertid Na et al rapporterte at de kvinnelige pasientene med adenokarsinom EGFR følsomme mutasjon presentert mer postoperativ tilbakefall og kortere overlevelse enn de med villtype-EGFR [7]. Det finnes også
EGFR
-mutated NSCLC pasienter som viser dårlig respons på EGFR-TKI eller som opplever tilbakefall etter en periode med sykdom kontroll, noe som tyder på at det er flere faktorer som medierer responsen på EGFR-TKI. Sekundær mutasjon (T790M) i exon 20 av
EGFR
, så vel som andre genetiske aberrances av EGFR-relatert bypass og nedstrøms reaksjonsveier, for eksempel,
C-MET
amplifikasjon [8] – [10]
IGF-1R
mutasjon [11] hadde blitt identifisert i forhold til TKI resistens. Men ca 30% av pasientenes resistensmekanismer fortsatt uklare. Nylig har intratumoral heterogenitet av
EGFR
mutasjoner fått oppmerksomhet som en potensiell kilde til behandlingssvikt og narkotika motstand mot EGFR-TKI [12], [13].
tumorigenesis av lungekreft er en flertrinns prosess ved hvilken monoklonale kreftceller etter hvert blitt heterogen på grunn av klonal evolusjon og genetisk /epigenetisk ustabilitet. Selv om alle ondartede celler er antatt å være avledet fra en felles forløper celle, ervervet genetisk ustabilitet gir opphav til etterfølgende generasjoner uttrykkende unike egenskaper, slik som aktiverte onkogener og tumorsuppressorgener [14]. Imidlertid har nyere studier som involverer intratumoral genetisk heterogenitet generert motsier resultater. Gerlinger et al (2012) [15] rapporterte markant intratumoral heterogenitet i forhold til somatiske mutasjoner i fører- og passasjer gener som kan fremme svulst tilpasning og terapisvikt via darwinistisk utvalg. Snuderl et al (2011) [16] rapporterte stabil sameksistens av heterogene kloner som innehar forskjellig reseptortyrosinkinasehemming forsterkning (
EGFR, MET
, og
PDGFRA
) innenfor samme svulst. Som sjåfør genet,
EGFR
ble foreslått til å være forbundet med resistens mot EGFR-TKI når mutasjoner i dette genet utstilt intratumoral heterogenitet. Vår siste undersøkelse (2012) [17] viste også at
EGFR
mutasjon skift som stammer fra chemotherpy kan være relatert til den heterogeniteten intratumoral
EGFR
mutasjon og til forskjellige kjemosensitivitet nivåer av mutant og vill skriver celler, derimot, Yatabe et al (2011) [18] rapporterte at
EGFR
heterogenitet skjedde svært sjelden i lunge adenokarsinom. Disse forfatterne spekulert i at heterogenitet observert i tidligere studier var en gjenstand som resulterer enten fra en mutant allel-spesifikk ubalanse og heterogent fordelt
EGFR
forsterkning eller fra en forskjell i
EGFR
mutasjon følsomhet på tvers av ulike metoder.
Basert på ulike resultatene av tidligere serie studier på intratumoral heterogenitet, forsøkte vi å undersøke
EGFR
mutasjonsstatus ved multi-focal mikrodisseksjon analyse ved hjelp av ulike metoder (DHPLC vs ARMS), utforske foreningen av intratumoral heterogenitet med
EGFR
kopiere antall og imfluence av
EGFR
mutasjon innholdet på respons av EGFR-TKI behandling for pasienter med lokalt eller avansert NSCLC.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
Alle prøver som brukes i denne studien ble hentet fra en vev bank ved Institutt for Thoracic Medical Oncology, Peking University Cancer Hospital, som ble etablert i juni 1999 og ha hatt rundt 1900 pasienter med vevsprøver som hadde blitt genotypet for
EGFR
mutasjonsstatus ved hjelp av rutinemetoder (DHPLC). Vi valgte pasienter fra vev bank i samsvar med følgende kriterier: 1) histologisk bekreftet stadium IIIa-IV NSCLC (patologi rapport); 2) hadde fått palliativ operativ reseksjon; 3) kan gi tilstrekkelige primære vevsprøver for mikrodisseksjon og molekylær analyse. De eksklusive kriterier som følger med: 1) hadde vev, men var metastatiske språk prøver; 2) tumorcelleinnholdet var for lavt til analyse. Den palliative operasjonelle reseksjoner ble definert som utføres hos pasienter med avansert NSCLC som hadde små intra-lunge knuter, enslig metastaser i ett organ eller pre-operative uidentifisert metastatisk sykdom drift.
Til slutt 85 pasienter møtte ovenfor kriterier og ble inkludert i denne studien som inneholdt 45 prøver skrives som
EGFR
mutant (gruppe-M) og 40
EGFR
vill-type prøve (gruppe-W). Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke for biomarkør analyse. Studien protokollen ble godkjent av Institutional etikkomiteen ved Peking University Cancer Hospital.
mikrodisseksjon og DNA-ekstraksjon
Alle prøvene hadde blitt evaluert for
EGFR
mutasjon av DHPLC rutinemessig og ble sortert i 40 villtype og mutant 45-type prøver. Fra hver formalinfiksert parafininnstøpte (FFPE) blokk, ble en 15-mikrometer tykk seksjon farget med hematoxylin og eosin (H E).
For å sikre de analyserte prøvene hadde mer enn 90% tumor innhold , en protokoll blir rutinemessig utført i vår gruppe: For det første ble svulst grense på seksjonen trukket av to uavhengige patologer henhold mikroskopi og utelukkes ikke-ondartet vev så snart som mulig. For det andre, små foci (omtrent 0,1 cm2 størrelse) i tumor-regionen ble microdissected ved hjelp av Laser mikrodisseksjon System (LMC, Leica Wetzler, Tyskland) og sikre hvert foci inneholde mer enn 90% tumorceller.
DNA ble ekstrahert fra alikvoter av microdissected prøver ved hjelp FFPE DNA Extraction Kit i henhold til produsentens instruksjoner (Omega). DNA-prøver ble undersøkt for renhet og konsentrasjon ved hjelp av en Nano Drop kit (Thermo Scientific) og ble fortynnet til en fungerende konsentrasjon på 10 ng /mL.
EGFR mutasjonsanalyse ved DHPLC og ARMS
EGFR
mutasjons statusene genomiske DNA-prøver fra kreft microdissections ble bestemt ved å bruke både DHPLC og ARMS til hver prøve. DHPLC ble utført som tidligere beskrevet [19], og ARMS ble utført med en DxS
EGFR
Mutation Test Kit, i henhold til produsentens anbefalinger (Amoy Diagnostics Co, LTD, Kina). Kvantitativ PCR (qPCR) reaksjoner ble utført ved hjelp av en Mx3000P Real-Time QPCR System (Stratagene, Agilent Technologies, USA).
Semiquantitation av EGFR mutasjon heterogenitet
En semikvantitativ DHPLC analyse av
EGFR
overflod ble utført ved å beregne forholdet mellom topphøyder mellom den mutante (M) og villtype (W) produkter (forhold, M /W). Den DHPLC analysen ble begrenset til mutasjoner i ekson 19 fordi M og W-topper ble skilt helt, men overlappet i ekson 21 mutasjonsdeteksjon.
EGFR kopiantall deteksjon
EGFR
kopiere tallene ble bestemt ved fluorescens in situ hybridisering (FISH) fra bulk vev ved hjelp av dual-color DNA-prober (Beijing GP medisinsk Tec., LTD, Kina). Vevsprøver ble klassifisert i seks kategorier på grunnlag av fisk resultater i henhold til kriteriene for Cappuzzo [20]. Cytogenetiske mønstre ble klassifisert som FISH-negative hvis de viste ingen eller lav genomisk gevinst (
vil si
, ≤4 kopier av
EGFR
i . 40% av cellene). Prøvene ble klassifisert som FISH-positive hvis de viste en høy grad av polysomy (≥4 kopier av
EGFR
i ≥40% av celler) eller om de vises genamplifisering, definert som tilstedeværelse av stram
EGFR
gensamlingene og forholdet
EGFR Twitter /kromosom 7 cent av to eller flere per celle eller 15 eller flere eksemplarer av
EGFR
per celle i minst 10% av analyserte celler .
statistikker
χ2 test ble brukt til å analysere sammenslutningen av mutasjon innhold med kopiantall. McNemar test ble brukt for å sammenligne forskjellen på
EGFR
mutasjon heterogenitet mellom DHPLC og armer. Wilcoxon rank sum test ble anvendt for å sammenligne den mutante overflod mellom de ulike gruppene mutasjon. Ikke-parametriske tester ble benyttet for å analysere mutasjonen innhold mellom ulike grupper. Tosidige P-verdier og 0,05 ble betraktet som signifikant. Data Evalueringen ble gjennomført med alle beregninger ble utført ved hjelp av SAS Versjon 10.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).
Resultater
Karakterisering av pasienter
I løpet av perioden oktober 2005 til desember 2011, 85 pasienter ble inkludert i denne retrospektive studien. Histologiske subtyper av hver NSCLC prøve ble evaluert basert på World Health Organization (WHO) kriterier [21]. Adenokarsinom var den vanligste histologisk subtype (63 pasienter, 74,1%). Kreft iscenesettelse ble utført i henhold til UICC-AJCC-TNM-systemet (versjon 7, 2009) [22]. Avansert sykdom (stadier IIIb – IV) ble identifisert i 61,2% av inkluderte pasientene. Pasientdata er oppsummert i Tabell 1. Førtifem pasienter ble bekreftet å være
EGFR
mutant type (gruppe-M), inkludert 25 pasienter med exon 19 slettinger (gruppe-M /E19) og 20 pasienter med exon 21 mutasjoner (gruppe-M /E21).
heterogenitet av EGFR mutasjon påvises ved DHPLC og ARMS
Tumor mikrodisseksjon ga 2,699 foci, inkludert 1,238 foci fra villtype
EGFR product: (gruppe-W) og 1,431 gruppe M tilfeller. Den samlede mutantfrekvens i gruppe-M var 80,6% av DHPLC (1154/1431) og 87,1% (1247/1431) av ARMS. Mutant frekvenser variert mye gjennom individuelle svulster, som strekker seg mellom 5% -100% av DHPLC og 1% -100% av ARMS. Gruppe-M prøver ble oppdelt ved mutasjon innhold som følger: 1) ren
EGFR
mutasjon (100%) eller ingen mutasjons heterogenitet ble påvist i 21 tilfeller av DHPLC (12 gruppe-M /E19, ni gruppe M /E21) og i 31 tilfeller av ARMS (20 gruppe-M /E19, 11 gruppe M /E21); 2) moderat mutant innhold (≥50%) eller moderat nivå heterogenitet ble påvist i 16 tilfeller av DHPLC (10 gruppe-M /E19, 6 gruppe M /E21) og i 9 tilfeller av ARMS (2 gruppe M /E19 7 gruppe M /E21); og 3) lav mutant innhold eller høyt nivå heterogenitet ( 50%) ble påvist i 8 tilfeller av DHPLC (3 gruppe-M /E19 og fem gruppe M /E21) og i 5 tilfeller av ARMS (3 gruppe-M /E19 og 2 gruppe M /E21).
Blant de 40 gruppe W tilfeller, 4 tilfeller vises lave mutant frekvenser fra 5,0% til 8,0% når microdissected kreft foci ble analysert ved DHPLC. Tre av disse tilfellene gjennomført en
EGFR
ekson 19 mutasjon, og ett tilfelle gjennomført en
EGFR
exon 21 mutasjon. ARMS bekreftet disse 4 tilfeller og identifisert 6 ekstra tilfeller viser svært lave mutant frekvenser fra 1,0% til 5,0%. Ved å kombinere gruppe M tilfeller bærer både vill og mutant-type
EGFR
celler og gruppe-W tilfeller inneholder mutante celler ved lav frekvens, 32,9% (28/85) og 28,2% (24/85 ) av prøvene ble identifisert til å bære intratumoral
EGFR
mutasjons heterogenitet med henholdsvis DHPLC og ARMS,. Forskjellen på intratumoral
EGFR
mutasjons heterogenitet identifisert av to metoder var ikke statistisk signifikans (
P
= 0,031, McNemar test) (figur 1).
annen farge av kaken representerer ulike EGFR mutasjon heterogenitet. De forlot tre deler (lyseblå, lilla og grønn) for hver kakediagram representerer prosentandel av tilfellene med EGFR heterogenitet.
semikvantitativ analyse av ekson 19 mutasjon av DHPLC
Vi har også målt semikvantitativt
EGFR
mutant overflod ved å beregne M /W topphøyde forhold fra DHPLC grafen. Vi har begrenset denne analysen til exon 19 delesjon fordi den tilsvarende M og W toppene ikke overlapper i henhold udenaturert betingelser (50 ° C) (figur 2). Median M /W prosenter av ekson 19 var 2,43 (range, 0,40 til 18,15) blant gruppe M prøver og 0,12 (range, 0,06 til 0,22) blant gruppe W prøver (
P
= 0,005). Under delvis denaturert forhold (62,2 ° C), M og W topper som tilsvarer ekson 21 substitusjon overlappet, utelukker noen fastsettelse av deres relative høyder.
Den venstre grafen viste rutine EGFR mutasjonsstatus deteksjon av DHPLC og tilsvarende bulk vev. Retten grafen representerer EGFR mutasjon heterogenitet av mikrodisseksjon. De ovennevnte to paneler representerer mutant EGFR i bulk vev viste ren mutasjon og mutasjon med heterogenitet av mikrodisseksjon hhv. Den under to paneler representerer vill EGFR i bulk vev med ren vill-type EGFR eller blandet med lav frekvens av mutasjoner celler ved mikrodisseksjon.
EGFR kopiantall
FISH analyse ble utført på 85 tumorprøver for å måle
EGFR
kopiere numre. Trettien tilfeller (36,5%) ble vurdert som FISH-positiv. Foreningen av
EGFR
mutasjons heterogenitet som oppdages ved ARMS med
EGFR
kopiere nummeret er beskrevet nedenfor. Blant de 31 pasientene med 100%
EGFR
-mutated celler (ingen heterogenitet), 71,0% (22/31) ble klassifisert som FISH-positive (høy polysomy eller genamplifisering). Derimot, den lave
EGFR
-mutated gruppe utstilt ca 13,3% FISH-positivitet (2/15, inkludert 10 lavfrekvente mutante tilfeller i gruppe-W og 5 lavfrekvente mutante tilfeller i gruppe-M) , og den moderate
EGFR
-mutated gruppe vises omtrent 22,2% (2/9) FISH positivitet (
P
0,05, figur 3 og 4), som var lik den som er detektert i 30 pasienter med villtype
EGFR
fra hvem mikrodisseksjon foci ble analysert ved hjelp av armer (5/30, 16,7%,
P
= 0,75).
De ulike
EGFR
mutasjon innholdet er avbildet i forklaringen.
Evaluering av EGFR genkopitallet av FISH ble gjort ved hjelp av
EGFR plakater (oransje) /CEP 7 (grønn) probe (Beijing GP medisinsk Tec., LTD, Kina). Paneler illustrere vevsprøver som representerer genamplifisering (A) og disomy (B).
Heterogenitet av histologisk type og stadium
Adenokarsinom var den vanligste histologiske mønster identifisert i denne studien (74.1 % av pasientene); Dette var ventet i en overveiende kirurgisk serie. Positivitet av
EGFR
mutasjon i adenokarsinom, som bekreftet av mikrodisseksjon analyse, var 91,8%. M /W ratio var 2,57 (range, 0,13 til 18,15). Til sammenligning er
EGFR
mutasjonsfrekvensen var lavere blant andre histologiske mønstre (70,9%), og bare tre tilfeller gjennomført
EGFR
19 mutasjon med M /W ratio 1,53. Basert på UICC-AJCC-TNM svulst staging system, ble 50 svulster klassifisert som stadium IIIa og IIIb (lokalavansert) og 35 ble klassifisert som stadium IV (avansert). Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller i mutasjons positiv rate og abundances mellom lokalt avanserte og avanserte stadier NSCLC (rente, 87,7% vs. 86,3%,
P
= 0,875; M /W ratio, 2,12 vs 2,86,
P
= 0,662).
Virkningen av EGFR mutasjons heterogenitet på responsen på EGFR-TKI
Blant 85 tilfeller, 26 pasienter fikk EGFR-TKI som første-linje eller multi- linje terapi. 9 pasienter viste en partiell respons (PR), 7 hadde stabil sykdom (SD), og 10 erfarne progressiv sykdom (PD). Ifølge ARMS resultater, var gjennomsnittlig mutant-innholdet var 86,1% (247/287) i PR-gruppen, 48,7% (110/226) på SD-gruppe, og 6,0% (19/317) i PD-gruppen, og med en signifikant forskjell (
P
= 0,001).
Vi delt 26 pasienter inn i tre undergrupper avhengig av EGFR mutasjonsheterogen status, som var «ren villtype EGFR», «EGFR mutasjon med heterogenitet» og «ren muterte EGFR». PFS var 3,01 måneder (95% KI 0,51 til 5,52), 11.35 måneder (95% KI 6,37 til 15,21) og 16.21 måneder (95% KI 8,21 til 25,19) for de tre gruppene, henholdsvis (p = 0,001).
Diskusjoner
intratumorale
EGFR
mutasjon homogenitet har lenge vært antatt i lungekrefttilfellene. Som sådan, bestemmelse av en pasients
EGFR
mutasjonsstatus ble tolket ved hjelp av kvalitative metoder. Det er imidlertid bare en brøkdel av pasienter som hadde
EGFR
mutasjoner svare på EGFR-TKI, noe som tyder på at ytterligere faktorer som ligger utenfor EGFR mutasjon bidra til en pasients legemiddelrespons. I tillegg til flere relaterte biomarkører (
f.eks
., K-ras, T790M, C-Met), intratumoral
EGFR
mutasjons heterogenitet er foreslått som kandidat formidler av motstanden mot EGFR TKI terapi, selv om det finnes en slik heterogeniteten har vært omstridt [15] – [17]. I denne studien ble det observert betydelig intratumoral mutasjons heterogenitet ved hjelp av både DHPLC og armer metoder.
En av kontroversene på intratumoral heterogenitet av
EGFR
mutasjon er om heterogenitet attributter for å bruke en lav følsom påvisningsmetode, spesielt når mutert signal er under terskelen for deteksjon. For å utelukke muligheten, benyttet vi to testmetoder, DHPLC og armer, for å evaluere
EGFR
mutasjonsstatus i microdissected intratumoral foci. ARMS er tenkt som en høy sensitiv analyse for
EGFR
mutasjonsdeteksjon. Mens DHPLC metoden ikke har vært mye brukt for
EGFR
mutasjon analyse, men det er høy sensitivitet og spesifisitet har blitt vist i våre og andre studier (deteksjonsgrense 3% -10%) [19], [23] – [26]. Resultatene viste at en del av prøvene fra lokalt avansert og avansert NSCLC present sameksistens av
EGFR
mutant og villtype cellene uavhengig av DHPLC eller ARMS blir brukt, noe som tyder på at intratumoral
EGFR
mutert heterogenitet faktisk eksisterte, og ikke utlede fra favorisering av deteksjonsmetoder eller lave intratumorale muterte frekvenser.
for å bedre karakter intratumoral heterogenitet av
EGFR
, microdissected vi bulk svulstvev å få 28-34 foci per svulst og analysert hver fokus for
EGFR
mutasjonsstatus ved hjelp av kvalitative og semi-kvantitative metoder. De fleste av de mikrodisseksjon foci ble identifisert som
EGFR
mutant-type med
EGFR
mutasjon innholdet varierer fra 1% til 100%. Teoretiske og eksperimentelle undersøkelser har rapportert at kreftceller av den samme genotype lokalisere contiguously [27]. Analyse av en liten prøve fjernet fra tumorvev ville sannsynligvis indikerer en genetisk identisk populasjon av kreftceller. Men vår analyse av
EGFR
mutasjon user fra mange intratumorale foci indikert heterogenitet. Vi utelukket ikke-maligne områder ved mikroskopisk visualisering, og hver microsampled prøven var kryss kontrollert for å bekrefte at prosentandelen av tumorvevet var minst 90%, noe som sikrer at microdissected områder som ikke var forurenset av ikke-kreftceller. Dermed våre data bekreftet eksistensen av intratumoral
EGFR
mutasjons heterogenitet.
Yatabe et al. (2011) [17] rapporterte at heterogene distribusjoner av
EGFR
mutasjoner i lunge adenokarsinom var svært sjeldne. Forfatterne foreslo at svulsten heterogenitet rapportert av andre var faktisk en pseudoheterogeneity som følge av en mutant allel-spesifikk ubalanse (MASI) eller fra heterogent fordelt
EGFR
forsterkning. Flere studier støtter forekomsten av MASI i EGFR-mutert tumorceller, og dette fenomenet er forbundet med økt mutant allel transkripsjonen aktivitet [28] – [30].
EGFR
mutasjoner, genkopitallet gevinster, og MASI forekommer sammen i tumorceller synes å synergize å gjennomføre en mer ondartet fenotype enn disse endringene enkeltvis [28] – [30]. Vi observerte en forhøyet
EGFR
kopiere antall blant pasienter med ren
EGFR
mutasjoner, noe som tyder på at en høy frekvens av
EGFR
mutasjoner oppstår ofte med en forhøyet
EGFR
kopiantall (MASI). Hos pasienter som viser intratumoral heterogenitet,
EGFR
kopiere antallet var lavere enn hos pasienter med ren
EGFR
muterte tumorer. Den mulige forklare er det heterogene tumorer inneholdt ikke bare
EGFR
mutante celler, men også villtype-celler, og selektiv amplifikasjon av mutante alleler kan bli fortynnet ved villtype-allel, som gir opphav til en forholdsvis lav
EGFR
kopiere nummeret.
Blant bulk svulster som bærer villtype
EGFR
, 10 av 40 tilfeller viste langt lavere mutante frekvenser (5-8%) via mikrodisseksjon analyse sammenlignet med 45 pasienter som hadde mutant
EGFR
. Denne såkalte «false negativitet» målt fra masse vev kan være på grunn av den manglende evne av DHPLC for å detektere spor av mutant DNA når noen mutante celler er inneholdt i en prøve. Vi har også bestemt semikvantitativt mutant overflod ved å beregne forholdet mellom topphøyder (M /W) fra DHPLC grafen. Ifølge våre data, median M /W ratio varierte 0,13 til 18,15 i
EGFR
mutant saker og 0,06 til 0,22 i vill-type saker, noe som tyder på at kreftceller i bulk svulstvev vanligvis inneholde mutant og ikke-muterte typer samtidig. Så vidt vi vet, er dette den første studien påføring av M /W-forhold til semi-kvantitativt bestemme
EGFR
mutasjonsstatus og antyde intratumoral heterogenitet.
Bare 26 pasienter fikk EGFR-TKI, som begrenset den statistiske kraften i denne armen av studien. Men vi har oppdaget en betydelig høyere mutasjonsraten i foci fra PR og SD-pasienter sammenlignet med parkinsonpasienter. Disse resultatene var i samsvar med flere andre undersøkelser. Taniguchi et al [31] analysert sammenhengen mellom
EGFR
heterogenitet og responsen på EGFR-TKI av mikrodisseksjon tidlig stadium NSCLC svulster, og rapporterte at pasienter med en større
EGFR
mutasjonsfrekvens var mer følsomme for EGFR-TKI og viste lengre progresjonsfri overlevelse ganger enn pasienter med lave
EGFR
mutasjon priser. Vi har spekulert på om hurtig tumorprogresjon kan forekomme i prøvene med en lav prosentandel av
EGFR
mutante celler, på grunn av det faktum at den apoptotiske
EGFR
mutante celler som responderte til EGFR-TKI ble mindretall av prolifererende ikke-mutante celler. Basert på dette spekulasjoner, foreslår vi at intratumoral heterogenitet kan være en viktig faktor som bidrar til EGFR-TKI motstand. Pasient svar kan ved forbedret ved å administrere en kombinasjon av EGFR-TKI behandling og andre behandlingsformer i stand til å fjerne ikke-
EGFR
mutante tumorceller i en simultan eller sekvensiell måte.
Totalt våre funn tyder at pasienter med avansert lungekreft næret merket EGFR mutasjons heterogenitet. Det viktigste kliniske betydningen av EGFR mutasjons heterogenitet kan være i stand til å forklare motstanden mekanisme av EGFR-TKI. Sekundær, intratumoral heterogenitet av EGFR mutasjon tyder også på at enkelt punkt eller eneste gang biopsi kanskje ikke optimal metode for å bestemme personlig EGFR-TKI behandling. Kombi histologiske og genetiske metoder bruker informasjon om overlevelse og responsprofiler kan gi bedre slutninger for effektiv sykdomsforebygging og helbredelse i fremtiden.
Takk
Vi takker Prof Keneng Chen ved Institutt for Thoracic Surgery for å gi delvis prøver, Dr Ning Wang ved Institutt for radiologi for vurdering av reaksjon for behandling, Dr. Yu Sun i Avdeling for patologi for hennes bidrag i analysen av Peking University Cancer Hospital Institutt. Vi takker professor Chen Yao (Peking University Clinical Research Institute) og Dr.Guoshuang Feng (Chaoyang Center for Disease Control and Prevention) for statistisk analyse.
