Abstract
microRNAs (mirnas) har blitt rapportert til å spille en nøkkelrolle i onkogenese . Genetiske variasjoner i miRNA behandlingen gener og miRNA bindingssteder kan påvirke biogenesis av miRNA og miRNA-mRNA interaksjoner, derav fremme tumorigenesis. I denne studien hypotese vi at potensielt funksjonelle polymorfismer i miRNA behandlingen gener kan bidra til hode- og halskreft (HNC) mottakelighet. For å teste denne hypotesen, genotypet vi tre SNPs på miRNA bindingssteder av miRNA behandlingen gener (rs1057035 i 3’UTR av
dicer
, rs3803012 i 3’UTR av
RAN Hotell og rs10773771 i tre « UTR av
HIWI
) med en case-control studie blant 397 HNC tilfeller og 900 kontroller matchet etter alder og kjønn på kinesisk. Selv om ingen av tre SNPs var signifikant assosiert med samlede risikoen for HNC, rs1057035 i 3’UTR av
dicer
var assosiert med en betydelig redusert risiko for kreft i munnhulen (TC /CC vs TT: justert OR = 0,65, 95% CI = 0,46 til 0,92). Videre er luciferase aktivitetsanalyse viste at rs1057035 variant C-allel ført til betydelig lavere ekspresjonsnivå i forhold til T-allel, som kan være på grunn av den relativt høye inhibering av HSA-MIR-574-3p på
dicer
mRNA . Disse funnene indikerer at rs1057035 ligger på 3’UTR av
dicer
kan bidra til risikoen for kreft i munnhulen ved å påvirke bindingen av miRNAs til
dicer
. Storskala og godt designede studier er garantert å validere våre funn
Citation. Ma H, Yuan H, Yuan Z, Yu C, Wang R, Jiang Y, et al. (2012) genetiske variasjoner i Key mikroRNA Processing Gener og Fare for Head and Neck Cancer: En case-control studie i kinesisk befolkning. PLoS ONE 7 (10): e47544. doi: 10,1371 /journal.pone.0047544
Redaktør: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, USA
mottatt: May 23, 2012; Akseptert: 12. september 2012; Publisert: 11 oktober 2012
Copyright: © Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høgskolerådet (PAPD) og Jiangsu Natural Science Foundation (BK2011764). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode- og halskreft (HNC), spesielt plateepitelkarsinom i hode og hals (SCCHN), er den sjette vanligste kreftformen i verden, står for anslagsvis 650 000 nye krefttilfeller og 350 000 kreftdødsfall hvert år [1], [2]. HNC inkluderer kreft som oppstår i bihuler, nesehulen, munnhulen, svelget og strupehodet. Tobakk og alkohol har blitt identifisert som viktige caucuses av HNC [1], [2]. Videre studier rapporterte også at genetiske faktorer, inkludert familiehistorie og genetiske varianter i flere biologiske pathways var involvert i utviklingen av HNC [3]. Men den eksakte mekanismen for å utvikle HNC har ikke vært fullt utforsket.
microRNAs (mirnas) er en klasse av ikke-koding, enkelt-strandet RNA av ~22 nukleotider og fungere som genet regulatorer gjennom binding til 3 «utranslaterte region (UTR) av protein-kodende transkripter, i sin tur utløser messenger RNA degradering eller translasjonsbevegelse undertrykkelse [4], [5]. Studier har vist at mirnas er involvert i en rekke biologiske prosesser, inkludert cellesyklusregulering, differensiering, utvikling, metabolisme og aldring. Videre mirnas er også knyttet til etiologi, progresjon og prognose av kreft, og miRNA uttrykk profiler kan identifisere krefttyper [6], [7]. Den biogenese av mirnas er en kompleks prosess som involverer flere proteiner og RNA [8]. Først blir store primær forløpere for mirnas (pri-miRNA) transkribert hovedsakelig av RNA polymerase II og spaltet til miRNA forløper (pre-mirnas) ved atommikroprosessor kompleks som inneholder drosha RNase og dobbel tråd RNA bindende protein DGCR8 [9] . Deretter blir pre-miRNA translokert til cytoplasma ved hjelp av Ran-GTPase og exportin-5 (XPO5), hvor den bearbeides videre ved et proteinkompleks inkludert dicer, som fører til produksjon av dobbeltkjedet miRNA duplex. [ ,,,0],10]. Deretter en tråd av miRNA innlemmet i RNA-induced Slå kompleks (RISC) inkludert HIWI, GEMIN3 og GEMIN4, som medierer uttrykk for målgener. Økende bevis viser at hovedkomponentene i den biosyntetiske reaksjonsvei fra miRNA spiller en viktig rolle i utviklingen eller prognose av humane kreftformer, inkludert HNC [11], [12], [13].
I den senere tid har det blitt rapportert at tilstedeværelsen av enkeltnukleotidpolymorfi (SNP’er) i mikroRNA gener, deres behandling maskiner og skivebindingsseter påvirker mottakelighet for kreft ved modulering av ekspresjonsnivåene av mirnas og miRNA-mRNA-interaksjoner [14]. Blant dem, har noen studier fokusert på effekten av SNPs i miRNA-bindingsseter (miRNA-bindende SNPs) av miRNA behandlingen gener og kreftrisiko. For eksempel, en studie med 130 orale premaligne lesjoner (OPLS) tilfeller og 136 kontroller fant at den varianten allel av rs3742330 i 3’UTR av
dicer
betydelig økt risiko for OPLS i amerikanere [15]. To andre studier har rapportert at rs11077 i 3’UTR av
XPO5 Hotell og rs14035 i 3’UTR av
RAN
var assosiert med kreftfaren [16] eller nyrecellekreft [17]. Men til dags dato er det ingen rapport om forholdet mellom genetiske variasjoner i miRNA BIOGENESIS gener og HNC risiko. I denne studien hypotese vi at potensielt funksjonelle SNPs i 3’UTR av miRNA BIOGENESIS gener kan endre HNC risiko i kinesiske befolkningen. For å teste denne hypotesen, utførte vi en genotyping analyse av tre SNPs (rs1057035 i
dicer
, rs3803012 i
Ran
og rs10773771 i
HIWI
) med en case-control studie av 397 HNC krefttilfeller og 900 friske kontroller i Han-kinesere og evaluert deres individuelle og felles effekt på HNC risiko. For å klargjøre den funksjonelle relevansen av de merkede SNP med HNC kreft, undersøkte vi også luciferaseaktiviteten av
dicer
rs1057035 (T og C-alleler) ved kloning og rapportørgenet assay vurdere effektene av SNP på binding av spesielle mirnas til 3’UTR av
dicer
.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av Institutional Review board of Nanjing Medical University. Utformingen og gjennomføringen av studien omfatter mennesker ble klart beskrevet i en forskningsprotokoll. Alle deltakerne var frivillig, og vil fullføre informert samtykke i skriftlig før du tar del i denne forskningen.
Study befolkningen
Alle nylig og histologisk bekreftet HNC pasienter ble fortløpende rekruttert fra Jiangsu Dental Hospital og First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing, Kina, siden januar 2009 til april 2011. Eksklusjonskriterier kriterier~~POS=HEADCOMP inkluderte andre HNC primære svulster eller spredning kreft fra andre organer. 420 saker ble først kontaktet for deltakelse og ca 95% av godkjente tilfeller (397 tilfeller) enige om å delta i studien. Kreftfrie kontroller frekvens-tilpasset sakene på alder (± 5 år) og kjønn ble tilfeldig valgt fra en kohort av mer enn 30.000 deltakere i et samfunn basert screeningprogram for ikke-smittsomme sykdommer i Jiangsu-provinsen i Kina. Alle deltakerne var genetisk urelaterte, etniske Han-kinesiske befolkningen. Når skriftlig informert samtykke ble innhentet, ble et strukturert spørreskjema som brukes av trente intervjuere til å samle inn informasjon om demografiske data og miljømessig eksponering historie, som alder, kjønn, røyking og drikking forbruk. Etter intervju, ble ca. 5 ml venøs blodprøve tatt fra hver deltager. Til slutt, totalt 397 tilfeller og 900 kontroller gjennomført intervju og donert blodprøven.
SNP utvalg og genotyping
Åtte nøkkel miRNA BIOGENESIS gener (
drosha
,
DGCR8
,
XPO5
,
dicer
,
HIWI
,
GEMIN3
,
GEMIN4 Hotell og
RAN
) ble valgt ut gjennom en omfattende litteratursøk. For hvert gen, vi brukte først NCBI dbSNP database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bygge 131) for å søke SNPs som lokalisert på 3 «UTR av gener og fant 17 SNPs med mindre allel frekvens (MAF ) 0,05 i kinesisk befolkning. Deretter ble to verktøy web-baserte analyser som brukes til å forutsi effekten av 17 SNP på miRNA binding (https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm; https://miracle.igib.res.in/dbSMR ) [18], [19] og bare 4 SNPs med konsistente funn i begge verktøyene ble holdt. Blant disse SNPs (rs11077, rs1057035, rs10773771, og rs3803012), ble rs11077 ekskludert fordi den videre søk etter mirBase database (https://www.mirbase.org/search.shtml) viste at dette SNP ikke lå i den bindende region for noen miRNA. Som et resultat, identifiserte vi 3 miRNA-bindende SNPs i tre gener (rs1057035 i
dicer
, rs3803012 i
Ran
og rs10773771 i
HIWI
). Blant dem som ble rs1057035 spådd å påvirke har-MIR-574-3p bindende, rs3803012 påvirkning har-MIR-199A-3p bindende og 10773771 påvirkning har-MIR-1264 bindende
(*, P . 0,05; **, P . 0.001)
Genomisk DNA ble isolert fra leukocytter av venøs blod av proteinase K fordøyelse og fenol /kloroform ekstraksjon. Den genotyping av SNPs ble utført ved hjelp av TaqMan allel diskriminering analysen på en ABI 7900 system (Applied Biosystems, Foster City, California). Genotyping ble utført uten å vite fagenes sak eller kontroll status, og to negative kontroller i hver 384-brønners format ble brukt for kvalitetskontroll. De genotyping Resultatene ble bestemt ved hjelp av SDS 2,3 Allelic Diskriminering programvare (Applied Biosystems). Den konkordans oppnådde 100% for duplikater av 5% av prøvene for hver SNP.
Luciferase reporter analyse for å fastslå effekten av miRNA bindende dicer uttrykk
3’UTR regionen
dicer
inneholdende de antatte gjenkjenningssete rs1057035 ble amplifisert fra prøve-DNA, og deretter klonet inn i pMIR-RAPPORT
TM (Applied Biosystems) vektor med Mlu i og Hind III-spaltinger. Primerne var: GTAGACGCGTTCAACAGCAAACTTCAGCC (fornuft) og TCCAAAGCTTGGCAGGGTATCAGAATCTTT (antisense). Plasmider som inneholder de ulike alleler av rs1057035 ble generert ved hjelp av stedsspesifikk mutagenese. Alle konstruksjoner brukt i denne studien var begrensningen kartlagt og sekvensert for å bekrefte deres autentisitet.
Tca-8113 (en human muntlig plateepitelkarsinom cellelinje) [20], 293T (a humane embryonale nyrecellelinje) og Hela (en human cervical carcinoma cellelinje) celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med høy glukose (Gibco) supplementert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Gibco) og 50 ug /ml streptomycin (Gibco) ved en 37 ° C inkubator supplert med 5% CO2. Celler ble sådd ut ved 1 x 10
5 celler per brønn i 24-brønners plater (BD Biosciences, Bedford, MA). Tjuefire timer etter plating ble cellene transfektert med Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens forslag (Invitrogen).
dicer
3’UTR luciferasepreparater plasmider (forskjellige alleler) og kjemisk syntetisert modne HSA-MIR-574-3p ble transfektert hhv. PRL-SV40 plasmid (Promega) ble transfektert som en normalisering kontroll. Seks replikater for hver gruppe og eksperimentet gjentas minst tre ganger. Etter 24 timers inkubasjon ble cellene samlet og analysert for luciferase aktivitet med Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega).
Statistisk analyse
Hardy-Weinberg likevekt ble testet av en godhet -av-fit χ
2 test for å sammenligne de observerte genotypefrekvensene med de forventede seg blant kontrollpersoner. Utdeling av utvalgte demografiske variabler, risikofaktorer, og frekvenser av variant genotyper mellom sakene og kontrollene ble evaluert ved hjelp av χ
2 test. De sammenslutninger av variant genotyper med HNC risiko ble beregnet ved å beregne odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall (CIS) fra både univariate og multivariate logistiske regresjonsanalyser. Den heterogenitet mellom undergrupper ble vurdert med Chi-kvadrat-baserte Q test og heterogenitet ble betraktet som signifikant når
P
0,05. De mulige gen-gen og gen-miljø (dvs. røyking og drikking status) interaksjoner ble evaluert av den logistiske regresjonsmodeller. Alle de statistiske analysene ble utført med Statistical Analysis System programvare (v.9.1 SAS Institute, Cary, NC). To-sidige tester ble vanligvis brukt for statistisk analyse og
P
. 0,05 ble ansett som statistisk sikkerhet
Resultater
De valgte karakteristikker av tilfellene og kontrollene er vist i tabell 1. det var ingen signifikante forskjeller i fordelingen av alder, kjønn og røyking mellom sakene og kontrollene (
P
= 0,637, 0,263 og henholdsvis 0,580,), og gjennomsnittsalderen var lik (59.98 ± 11,94 år for saker og 60.65 ± 7.99 år for kontrollene). Som forventet, ble flere drikker observert i tilfelle gruppen sammenlignet med det i kontrollgruppen (45,1% vs. 32,2%,
P
0,001). Av de 397 tilfellene, 293 (73,8%) var med tumor fra munnhulen, 6 (1,5%) med orofarynks, 86 (22,2%) med strupehodet og 10 (2,5%) sammen med andre. Videre 335 tilfeller (84,4%) presenteres med plateepitelkarsinom.
SNPs var på Hardy-Weinberg likevekt (
P
= 0,14 for rs1057035 og
P
= 0,73 for rs3803012, henholdsvis), bortsett rs10773771 (
P
= 0,01). Genotypen og allel distribusjoner av
dicer
rs1057035,
HIWI
rs10773771 og
Ran
rs3803012 i saker og kontroller er vist i tabell 2. enkelt locus analyser avslørte at genotypen distribusjoner av disse tre polymorfismer var ikke signifikant forskjellig mellom overordnede saker og kontroller (
P
= 0.080 for rs1057035,
P
= 0,397 for rs3803012 og
P
= 0,539 for rs10773771, henholdsvis). For ytterligere å undersøke modifiserende effekter av tre varianter på risikoen for HNC med ulike kreft områder, gjennomførte vi lagdel analyse av munnhulen og ikke-munnhulen kreft. Som vist i tabell 2, ble rs1057035 variant genotyper forbundet med en betydelig redusert risiko for kreft i munnhulen (TC vs TT: justert OR = 0,65, 95% CI = 0,46 til 0,93, justert
P
= 0,019; TC /CC vs TT: justert OR = 0,65, 95% CI = 0,46 til 0,92, justert
P
= 0,016; additiv modell: justert OR = 0,67, 95% CI = 0,48 til 0,93, justert
P
= 0,018). Ingen av signifikant sammenheng ble observert mellom genotyper av to andre SNPs (rs3803012 A G, rs10773771 G A). Og risiko for HNC med forskjellige områder (tabell 2)
Vi har utført ytterligere lagdel analyse på assosiasjoner mellom rs1057035 og oral kreftrisiko etter alder, kjønn, røyking, drikking og histologi. Som vist i figur 1, den reduserte risiko for oral cancer assosiert med varianten TC /CC-genotyper var signifikant blant de yngre (justert OR = 0,61; 95% CI = 0,38 til 0,97), av hunnkjønn (justert OR = 0,53; 95% CI = 0,30 til 0,95), ikke-røykere (justert OR = 0,50; 95% KI = 0.30-0.83) og ikke-drikkere (justert OR = 0,54; 95% CI = 0,33 til 0,89), sammenlignet med TT genotype. Men heterogenitet test viste at det var ingen signifikant heterogenitet (
P
0,05) i annenhver stratums. Vi vurderte også effekten av tilsetning av alkohol, røyking og kjønn på ORS og fant at disse var ingen forskjell om disse variablene ble inkludert i modellene eller ikke inkludert (tabell S1). I tillegg ble ingen signifikante resultater observert for gen-gen eller gen-miljø (dvs. røykestatus og alkohol status) interaksjoner (data ikke vist).
Fordi rs1057035 viste signifikant sammenheng med oral kreftrisiko og ble spådd å finne på den antatte miRNA bindingssetet (HSA-MIR-574-3p), er det interessant å teste om rs1057035 påvirker målretting av HSA-MIR-574-3p til
dicer
mRNA in vitro. Dermed genererte vi reporter gener for
dicer
3’UTR (C eller T-allelet) som ble transfektert med kjemisk syntetisert modne HSA-MIR-574-3p i Tca8113 muntlig plateepitelkarsinom cellelinjer. Som vist i figur 2, kotransfeksjon av HSA-MIR-574-3p vesentlig hemmet ekspresjon av reporterbære rs1057035 C-allel, men ikke T-allelet (293T cellelinje: 0,057 ± 0,002 for C-allel versus 0,333 ± 0,089 for T-allelet
P
= 0,032; Hela cellelinje: 0,041 ± 0,007 for C-allelet versus 0,357 ± 0,257 for T allelet,
P
= 0,030; Tca8113 cellelinje: 0,072 ± 0,067 for C-allelet versus 0,833 ± 0,120 for T allelet,
P
0,001). Resultatene antydet at rs1057035 variant allel kan forskjellig påvirke målretting av HSA-MIR-574-3p til 3’UTR av
dicer
i orale kreftceller.
Diskusjoner
i dette case-control studie av 397 HNC pasienter og 900 kreftfrie kontroller i en kinesisk befolkning, undersøkte vi assosiasjoner mellom tre SNPs i 3’UTR av miRNA biosyntese gener og risiko for HNC. Selv om vi ikke finne bevis for en viktig effekt av hver SNP på samlet HNC risiko, undergruppen analyse av HNC viste at variant genotyper av rs1057035 var assosiert med risiko for HNC som oppstår ved munnhulen. Andre funksjonelle analyser viste at rs1057035 C-allel ført til betydelig lavere luciferase-aktivitet, sammenlignet med T-allelen. Disse funnene foreslått, for første gang, som potensielt funksjonelle polymorfismer av
dicer
kan spille en rolle i utviklingen av HNC, spesielt av de svulster som oppstår i munnhulen.
dicer er et enzym som er ansvarlig for spaltning av miRNA forløpere og har tidligere vært implisert i onkogene prosessen av flere typer kreft [21], [22], [23]. Mye tyder på at
dicer
kan ha ulike roller i tumorigenesis av ulike kreftformer. For eksempel har noen studier viste at lavere nivåer av
dicer
mRNA uttrykk var assosiert med utvikling av lungekreft [24] og prognosen for eggstokkreft [11]. Men studier har også vist at forhøyet uttrykk nivåer av
dicer
var korrelert med økt celleproliferasjon orale kreftceller [12]. I vår studie fant vi at rs1057035 variant C-allelet ført til betydelig lavere uttrykk nivåer av
dicer Hotell og viste en beskyttende effekt på kreft i munnhulen mottakelighet, som var i samsvar med funnene i muntlige kreftceller [12]. Videre fant vi at den beskyttende effekten av rs1057035 variant genotyper var statistisk signifikant i noen undergrupper, for eksempel kvinner, ikke-røykere og ikke-drikkere. Men viste heterogenitet test ingen signifikant heterogenitet (
P
0,05). Mellom hver to stratums, noe som tyder på at det ikke var noen fare effekt endring av disse variablene under etterforskning
Den betydelige SNP (rs1057035 ) identifisert i vår studie ligger i 3 «UTR av
dicer Hotell og spådd å påvirke bindingen av HSA-MIR-574-3p. Hsa-MIR-574-3p er evolusjonært konservert ved nukleotid nivå fra fluer til mennesker. Selv om funksjonen av HSA-MIR-574-3p er ikke klart, det er spådd å målrette flere hundre menneskelige gener [25]. Våre resultater indikerer at
dicer
rs1057035 C-allelet kan påvirke målretting av HSA-MIR-574-3p og resultere i redusert uttrykk for
dicer
mRNA i orale kreftceller, som kan være en mulig underliggende mekanisme for den observerte sammenhengen mellom rs1057035 og redusert risiko for kreft i munnhulen. Men vi fant ikke noen sammenheng mellom rs1057035 og samlet risiko for HNC kreft eller ikke-oral kreftrisiko i vår studie. Patogenesen av kreft i munnhulen kan være litt forskjellig fra andre kreftformer som oppstår på hode og nakke. For eksempel har nylig epidemiologisk og molekylære studier identifiserte høyrisiko typer av humant papillomavirus (HPV) som potensialet etiologisk faktor for HNC, men det er mer fremtredende i oropharynx cancer enn i munnhulen kreft [3], [26 ].
i tillegg har vi også fant ingen signifikante assosiasjoner mellom SNPs i 3’UTR av
RAN Hotell og
HIWI Hotell og HNC risiko. RAN er et unikt medlem av superfamilien av Ras GTPases, noe som er vesentlig for transport av pre-mirnas fra kjernen til cytoplasma gjennom kjerne pore-komplekset i en GTP-avhengig måte [27]. HIWI er en del av RNA-induced Slå Complex (RISC) og en sentral regulator av stamcelle pluripotency ved å regulere celleselvfornyelse og differensiering [28]. Noen studier har undersøkt assosiasjoner mellom polymorfismer i disse to genene og risiko for flere kreftformer, som spiserørskreft, blærekreft og nyrecellekarsinom, men resultatene var uforenlig [15], [16], [17], [29] . I vår studie vi først fant ut at
RAN
rs3803012 og
HIWI
rs10773771 variant genotyper var ikke forbundet med risiko for HNC, tyder disse SNPs kanskje ikke modulere mottakelighet for HNC i kinesiske befolkningen.
Flere potensielle begrensninger med denne studien garanterer hensyn. Først av alt, kan en relativt liten utvalgsstørrelse begrense den statistiske kraften i vår studie, særlig i stratifisering analyse av tumor nettsteder. Vi har evaluert statistisk styrke for effekten av rs1057035 av PS programvare (Strøm og utvalgsstørrelsen Beregninger versjon 1.0.17) og fant at i tilfelle av OR = 0,65 (dominerende modellen), kan vårt utvalg nå 78,8% av den statistiske effekt. Dernest er det et sykehusbasert case-control studier og iboende utvalgsskjevhet kan ikke helt utelukkes. Men vi brukt en streng epidemiologisk utforming i å velge forsøkspersonene og brukes videre statistisk justering for kjente risikofaktorer for å minimere potensielle skjevheter. For det tredje, siden intensiteten og varigheten av røyking og drikking var fraværende i denne studien, var det vanskelig å gjøre fremtidig analyse for slike eksponeringsvariabler. Sist, vi bare valgt miRNA-bindende SNPs for genotyping og kunne ikke evaluere forholdet mellom andre potensielt funksjonelle SNPs i miRNA behandlingen gener og HNC risiko. Dermed større, veldesignede epidemiologiske studier med etnisk forskjellige befolkningsgrupper er garantert å bekrefte og utvide våre funn.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
analyse for effekten av variabler på ORS i modellene. MERK:
en Likelihood ratio test ble brukt for å sjekke forskjellen mellom -2 * log likelihood av de to modellene.
b Sammenlignet med den første modellen inkludert alder, kjønn, røyking og drikking
doi:. 10,1371 /journal.pone.0047544.s001 plakater (docx)
