Abstract
Triglyserider har begrenset løselighet, rundt 3%, i Phosphatidylcholine lipidbilagene. Ved hjelp av millisekund-skala kurs kornet molekylære dynamikk simuleringer, viser vi at modellen lipid bilaget kan romme en høyere konsentrasjon av triolein (TO) enn tidligere forventet, etter avsette triolein molekyler til bilaget sentrum i form av en uorganisert, isotrop, mobil nøytral lipid aggregat, i det minste 17 nm i diameter, som danner spontant, og forblir stabil på i det minste den mikrosekund tidsskalaen. Resultatene gi tilslutning til den mye diskutert eksistensen av mobile nøytrale lipid- aggregater av ukjent funksjon til stede i ondartede celler, og til tidlig biogenese av lipiddråper innlemmes mellom de to ark av det endoplasmatiske retikulum-membran. TO aggregater gi bilaget en blemme-lignende utseende, og vil hindre dannelsen av multi-lamellære faser i modellen, og muligens bor membraner. Den blemmer vil resultere i unormal membran sonde partisjonering, som bør tas hensyn til i tolkningen av sonderelaterte målinger
Citation. Khandelia H, Duelund L, Pakkanen KI, Ipsen JH (2010) Triglyceride blemmer i Lipid bilag: Konsekvenser for Lipid Droplet biogenesis og Mobile Lipid Signal i Cancer cellemembraner. PLoS ONE 5 (9): e12811. doi: 10,1371 /journal.pone.0012811
Redaktør: Darren R. Flower, University of Oxford, Storbritannia
mottatt: 13 juli 2010; Godkjent: 24 august 2010; Publisert: 22.09.2010
Copyright: © 2010 Khandelia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er finansiert av den danske National Research Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i denne rapporten undersøker vi de biofysikk av modell membraner som inneholder lave konsentrasjoner av triglyserid molekyler.
Triglyserider eller triglyserider (TGLs) er nøytrale lipider, hvor hver av glyserol hydroksylgrupper er forestret med en fettsyre. TGLs er hovedkomponenten i mange naturlige oljer slik som olivenolje. I pattedyr, TGLs er til stede for det meste inne smugler lipoproteinpartikler, som transporterer kolesterol, steryl estere, og TGLs mellom vev [1] og i lipiddråper (LDS) [2]. LDs er også til stede i andre eukaryots, og i enkelte prokaryote celler som syntetiserer TGLs for energi og karbonlagring [3]. TGLs i lipoproteiner og disc har vært gjenstand for stor interesse på grunn av rollen til disse partiklene i fysiologi [4], sykdom [5].
I tillegg til lipoproteiner og disc, TGLs er også til stede i flere biologiske membraner ved varierende konsentrasjoner. De lamellære legemer av lungeoverflateaktive ekstrakter i pattedyr kan inneholde mellom 0,5% til 1,8% vekt /vekt TGLs [6], [7]. Okulær linse lipider inneholde små mengder (mikrogram TGLs /mg fosfolipider) av TGLs. TGLs er også til stede i tarmmembranekstrakter [8]. Lysosomer inneholde ikke-neglisjerbare mengder av TGLs, for eksempel, i dyrkede fibroblaster hamster [9]. I rotte hepatocytter, lysosomer inneholde nesten 3,7% TGLs [10]. Mange prolifererende eller aktiverte pattedyrceller i særdeleshet, har en høy konsentrasjon av TGLs i membraner. Kreftceller inneholder så høy som 6,8% TGL fraksjon av total plasmamembranlipider [11]. Flere ondartede kinesisk hamster ovarie (CHO) cellelinjer inneholde 2,4-3,2% TGLs i sine plasmamembraner [12]. Menneskelige nøytrofile inneholde så høyt som 5,2% og 6,8% TGLs i sine plasmamembraner før og etter stimulering med lipopolysaccharides [13]. Aktiverte makrofager [14], lymfocytter [15] og B-celler [16] inneholder også store mengder TGLs i sine plasmamembraner. I denne rapporten undersøker vi effekten av lave konsentrasjoner av TGLs, som finnes i en rekke celletyper er nevnt ovenfor, på strukturen og dynamikken i modellmembraner, med sikte på å slutt å skaffe hint til den mulige strukturelle og funksjonelle rollen TGLs i plasmamembranen av levende systemer. Vi har brukt triolein (TO) som vår modell TGL, og 1-Palmitoyl-2-oleoyl-
sn
-glycero-3-phosphocholine (POPC) som modell fosfolipid.
Det har vært spredte rapporter undersøker biofysikk og biokjemi av modellen tIL-fosfolipid blandinger. Flere
13C-NMR-studier har blitt brukt for å bestemme den maksimale oppløselighet av TGLs i modellmembraner inneholdende hovedsakelig PC lipider. Den
13C-spektrum av en TGL kan skille mellom karbonylgruppene på forskjellige posisjoner (a eller p), og forskjellige væskenivåer (nær en grenseflate, eller i en oljeaktig dråpe). Bruke
13C-NMR, løseligheten av TIL i lameller og orientert som fosfolipider har dermed blitt dokumentert å være innenfor 3% både i små unilamellære vesikler (SUV) [17], [18] og i multilamellære vesikler (MLV) [19] fra fosfatidylcholin lipider. Liknende løselighetsgrenser ble oppnådd når heterogen TGLs, hvor alle tre posisjoner av glycerol ikke er forestret med den samme fettsyren, ble solubilisert ved SUVer [20]. I SUVer, er løseligheten senkes til så lavt som 1% hvis kolesterol er til stede i et 01:02 forholdstall med fosfolipider og 0,15% hvis forholdet er 01:01 [21]. I alle undersøkelser, ble ytterligere karbonylforbindelser topper i spektrene oppnådd når TGL konsentrasjonen ble hevet over 4%. Disse toppene var typisk for TGLs i «olje» -fasen. Flerkjernede og magi-vinkel spinne NMR undersøkelser av 0, 0,25, og 0,75 molfraksjon TIL i egg-fosfatidylcholin indikerte at TIL forårsaket betydelige endringer i bilaget molekylære organisasjonen, inkludert en økning i kjeden flyt [22]. TGLs, blir formet som invertert kjegler, kan også fremme lamellær å invertert sekskantede faseovergangen i begge PE membraner [23], [24].
Selv om bare opp til 2-3% TGLs kan registreres som løst ved grenseflaten i modellmembraner, er det klart at prolifererende celler (se ovenfor), kan inneholde mer enn 6-7% TGLs. Dersom modellmembraner kun kan romme 2-3% TGLs i den kanoniske bilaget konformasjonen, og enda mindre slik at hvis kolesterol er til stede [21], og mer enn 6-7% TGLs er faktisk til stede i membraner av kolesterol-inneholdende levende celler,
hvor kommer det overskytende TGL gå
? En mulig svaret ligger i observasjon av en distinkt gruppe
1 H-NMR resonanser fra levende celle NMR eksperimenter, som stammer fra «mobile lipider» fra vev triglyserider [25]. Det ble foreslått i 1980 [26] at dette signalet delvis stammer fra et overskudd triglyserid basseng som er innkvartert i midten av membranen som mikroområder. Det har vært rapporter spredt av mikroskopiske observasjoner av slike mikroområder, selv om litt større i størrelse -60 nm [27], [28], [29]. Mesteparten av
1H-NMR mobil lipid signal muligens kommer fra det cytoplasmatiske pool av TGLs, men basert på mikroskopistudier og følsomheten av signalet til paramagnetiske gadolimium ioner (som bindes til membraner), muligheten for en membran pool av TGLs kan ikke utelukkes [25].
i siste arbeid, ble det vist at sentrifugering eller over natten bosetting av tIL-POPC blandinger ført til en faseseparasjon i en tung fase pellet og en lett fase, mens det overskytende Å dannet en fet senere på toppen [30]. Selv om sammensetningen av den lette og tunge fase var like, de to fasene hadde bemerkelsesverdig forskjellige hydrering og flyteegenskaper, og noen av disse kunne forklares ved en modell som antydet at glycerol-ryggrad av TGLs kan også være i sentrum av det ytre lipid bilaget [30].
Tidligere simuleringer av TGL-inneholdende systemer har enten fokusert på lipidemulsjoner [31], eller på lipoproteiner [32], [33]. I denne studien, har vi undersøkt konformasjoner av TGLs i modellen POPC lipidbilag ved konsentrasjoner over og under den grenseflateløselighetsgrensen av TGLs. Vi har brukt omfattende kurs kornet molekylære dynamikk simuleringer for å få tilgang til strukturelle og dynamikk detaljer som ikke er lett tilgjengelig med analytiske teknikker. Foruten å skaffe ny innsikt i de biofysikk av TGL-holdige membraner, våre funn er relevante for biogenesis av lipid dråper på akuttmottaket, og tilstedeværelsen av mobile lipid-domener i maligne eller aktiverte celler.
Metoder
Simuleringer ble utført ved hjelp av kurskornet (CG) modeller av POPC-tIL blandinger på en to konsentrasjoner, en litt under (~2.3%), og en over (~ 5,2%) grenseflateløselighetsgrensen for tIL. Den fullstendige listen over simuleringer er vist i Tabell 1. CGMD simuleringer ble utført ved hjelp av MARTINI kraftfelt for lipider [34]. Kraftfelt parametre for TIL ble tilpasset fra eksisterende parametre for DOPC, ved å erstatte fosfokolin delen ved et oleoyl kjede. Det var ikke nødvendig å innføre noen nye partikkel, obligasjons- eller interaksjonstyper.
De første koordinatene til en POPC dobbeltlag ble hentet fra en selvbygging simulering av 270 POPC i overflødig vann, ved en lipid: vann-forhold på 1:60. Siden hver vann perle i MARTINI tilsvarer fire vannmolekyler, simuleringen inneholdt 270 lipider og 4050 vannperler. Å konstruere 5.2% TO-POPC blanding ble 14 POPC molekyler erstattet av TIL molekyler på to forskjellige måter. I ett tilfelle ble 7 tilfeldige POPC molekyler plukket fra hvert blad og erstattes av TO-molekyler. Vi vil referere til dette oppsettet som RAND5. I det andre tilfelle ble jevnt fordelte POPC molekyler selektivt erstattet med TIL molekyler. Vi vil referere til dette oppsettet som UNI5. To eksemplarer av RAND5 og UNI5 oppsett ble simulert med ulike utgangshastighet distribusjoner, noe som resulterer i 4 simuleringer av 5,2% til systemer. Å konstruere 2.3% til systemer, 8 til molekyler ble fjernet fra UNI5 systemer. Vi vil referere til dette oppsettet som UNI2. To eksemplarer av UNI2 oppsettet ble simulert.
Simuleringer var også kjøre for større bilags patcher 19 nm × 19 nm. For dette ble den UNI2 og UNI5 systemer replikert fire ganger i planet av bilaget, som resulterer i bilag inneholdende 1024 POPC og 24 (2,3%) eller 56 (5,2%) til molekyler. Vi vil referere til disse systemene som henholdsvis 4X2 og 4×5. Den endelige konfigurasjon fra UNI5 simulering ble brukt til å konstruere et større system ved hjelp av samme prosedyre, og en simulering av større oppdateringen ble iverksatt, vil vi referere til dette oppsettet som 4XMID5. To meget store simuleringer ble gjennomført med 5,2% til å teste for begrensede størrelse effekter, og for å sjekke om antallet og størrelsen på TO aggregater i midten av membranen endret (se senere). Disse systemene vil bli referert til som 9X5 og 16×5. Bilaget flekker var 28 nm × 28 nm og 37 nm x 37 nm, og antallet lipider var 2430 og 4230 henholdsvis.
Til slutt, for å bekrefte spontan fordeling av TO molekyler i lipidfasen, selv-sammenstillingen simuleringer av 2,3% og 5,2% til å inneholde tilfeldig fordelt POPC, tIL og vannmolekyler ble iverksatt. Tre kopier av hver konsentrasjon ble simulert, og i hvert tilfelle for å fordeles inn i den selv-montert POPC dobbeltlaget i løpet av de første 100 nanosekunder. Dataene fra selvbygging simuleringer vil ikke bli diskutert videre, fordi resultatene er identiske med de fra RAND5, UNI5 og UNI2 simuleringer.
Simuleringene ble utført ved hjelp av GROMACS 4.0.4 pakke i isobar-isoterm (NPT) ensemble på en bar og 323 K, ved hjelp av Berendsen [35] termostat (avslapping tid 0.3ps) og barostat (koblingskonstant 3.0 for mindre bilags patcher, og 5,0 for større bilags patcher) med semi-isotropt trykk kobling. Z-akse var parallell med bilaget normal. En tidsskritt på 30 fs ble brukt, koordinater ble reddet hvert 900 ps, og ble senere behandlet for å lagre snapshots hver 13,5 ns å fremskynde analyserutiner. Ikke-bundne interaksjoner ble cutoff på 12 Å.
Analyse av simuleringene ble utført i GROMACS pakke med programmer. VMD ble brukt for molekyl grafikk [36]. De første 2 ms av CG simuleringer ble forkastet som balansen perioder for beregning av ensemblet gjennomsnittet egenskaper.
Resultater
Distribusjon av triolein i POPC
De strukturelle egenskapene til bilags, tetthetsfordelingen av tIL og POPC, og flip flop satsene for tIL fra de to eksemplarer hver av de UNI5 og RAND5 var kvalitativt og kvantitativt lignende, som viser at resultatene diskutert i de neste avsnittene er uavhengige av de første conformations av tIL i POPC bilaget. Videre er resultatene fra den større 4×5 og 4XMID5 simuleringer var identiske, noe som indikerer at de endelige konformasjoner var uavhengig av begynnelsestilstanden for systemet. For klarhet, resultater fra bare én av de fire CG simuleringer med 5,2% til, vil bli presentert, med mindre annet er angitt. Tilsvarende er resultatene fra bare én av de to eksemplarer av UNI2 presentert.
Tettheten fordeling av glyserol ryggrad til fra UNI2 (2,3% TO), UNI5 (5,2% TO) og 4×5 (5,2 % TO, større simulering størrelse) simuleringer er vist i fig. 1. Simuleringer snapshots fra de tre simuleringene er vist i fig. 2. Tettheten av TIL-komponenter har blitt multiplisert med en faktor på 10 for oversiktens skyld. Counter-intuitivt, er det en betydelig tetthet av den polare glycerol ryggraden befinner seg på den hydrofobe midten av membranen i alle tre tilfeller. Det er en høyere tetthet av TO i UNI5 simulering, sammenlignet med UNI2 simuleringen. I UNI5 simuleringen, noen til molekyler partisjon i bilaget sentrum i form av en til å aggregere, som er blottet for enhver spesiell anordning av TO-molekyler. Antallet til molekyler som forble i grensesnittet var lik for de 2,3% og 5,2% simuleringer, noe som indikerer den begrensede grenseløseligheten av TIL i lipidbilagene. De overskytende lipider som ikke kunne ordnes ved grenseflaten i 5.2% simuleringene dannet et aggregat i midten av membranen. Men som systemstørrelse økt, var svært lite å stå ved grensesnittet (Fig. 1a) i 4XMID5 simulering. Derfor, for å foretrakk å fordele seg til samlet, i stedet for å bo på membranen grensesnittet i et tilstrekkelig stort system med et større aggregat. Det var svært lite til på grensesnittet i 4×5, 4XMID5, 9×5 og 16×5 simuleringer, og den samlede okkuperte et område nesten halvparten av det av membranen patch (Fig. 2a). Ingen aggregat ble dannet i UNI2 simuleringer. Vi merker oss at det ikke er null tetthet av TIL på bilaget senter i UNI2 system viser at TIL kan fordele seg i bilaget sentrum uten et samlet er til stede. Det tetthetsprofil av UNI2 er lik den til den større 4X2 system av den samme konsentrasjon. Aggregatet ved midten av membranen er biologisk relevant. Det ligner på triglyserid rike mobile lipid-domener tidligere oppdaget ved hjelp av
1 H-NMR spektra av cellesuspensjoner som gjenkjenner mobil lipid-domener som har et høyt innhold av triglyserider [11], [26], [28]. Den samlede er også lik en begynnende lipid dråpe observert i ER-membranen. Vi kommer tilbake til dette i diskusjonen.
Antall tetthetsprofiler av glyserol ryggrad TO (Glyc-TO), POPC fosfatgrupper (Phos-POPC) og POPC glyserol perler (Glyc-POPC). Konsentrasjonen av TIL på grensesnittet ligner for UNI2 (c) og UNI5 (b) simuleringer, men er svært lav i 4XMID5 simulering (a), der det meste av til partisjoner i bilaget sentrum.
Snapshots fra (a) 4XMID5 (b) UNI5 (c) UNI2 simuleringer. POPC haler er vist i blå, er POPC fosfat perler vist som grønne kuler, TO haler er vist i rødt, til glyserol ryggrad leser er vist som røde kuler, og vann er avbildet i cyan. De blå linjene representerer de sentrale simulering cellegrensene.
tetthetsprofiler i fig. 1 er ikke symmetrisk om bilaget sentrum. Spesielt er det mer til molekyler partisjonering i øvre pakningsvedlegget (z 0) i forhold til den nedre pakningsvedlegget til tross for den høye frekvensen av TO flip-flop. Grunnen til denne tilsynelatende uregelmessighet er at antall POPC lipider i de to ark av bilaget var ikke lik i den første lipid selv-montert POPC dobbeltlaget, som ble brukt til senere å konstruere alle TO-POPC simuleringsmodeller. Antallet POPC molekyler i den øvre paknings var lavere enn i den nedre paknings, noe som resulterer i et større antall TO molekyler diffunderer til slutt til den øvre paknings for å holde molekyltettheten lik i begge brosjyrer. Vi har gjennomført to ytterligere simuleringer (med 2,3% og 5,2% TO) hvor den opprinnelige antall POPC molekyler var lik i begge brosjyrer, og i så fall skulle fordeles likt i begge brosjyrer (figur S1).
vippen hastighet til molekyler i alle CG simuleringer er angitt i den siste kolonnen i tabell 1. Ut fra tetthetsfordelingen av glycerol ryggraden i hver simulering ble bilaget delt i tre regioner, to grenseflate og en i midten av membranen. En flip-flop hendelsen ble registrert hver gang massesenteret av den glycerol ryggraden i en til molekyl translokert fra en grenseflate-region til den andre. Den flip flop frekvensen av TIL var bemerkelsesverdig høy: 0.3 til 1,2 prosent us prøvetaking tid, avhengig av konsentrasjonen av TIL, og størrelsen på simuleringen. En flip-flop hastighet på ~ 1 per us prøvetaking tid ville gå ubemerket i kortere all-atom MD simuleringer. Vippen rente i RAND5 og UNI5 simuleringer var høyere på grunn av dannelsen av å aggregere som senker fri energi barriere for translokasjon av polar til glyserol ryggrad over membranen. Størrelsen av de samlede øker nesten proporsjonalt i større 4×5 og 4XMID5 simuleringer, og flip-flop priser samtidig øke med nesten en faktor på tre, tilsynelatende på grunn av en ytterligere reduksjon i fri energi barriere, som den samlede opptar nesten halvparten av overflatearealet av bilaget plasteret. Aggregatene dannet i 5,2% simuleringene er svært dynamisk i naturen, og til molekyler utveksle ofte mellom grenseflaten og aggregatet. Ingen flip-flop hendelsen ble observert for noen POPC molekyl i en simulering i overensstemmelse med tids løst liten vinkel nøytronspredning eksperimenter på store unilamellære vesikler, som viser svært langsom POPC flip-flop [37]. Vi har også gjennomført ca 1 uS simuleringer ved hjelp av høyere oppløsning forent-atom modeller for 0% og 5% til å bruke Berger kraftfelt for lipider. I disse simuleringene ble det ikke TO sett på bilags sentrum, og ingen av de TO molekyler flip-floppet på grunn av den korte tidsskalaer.
Molecular konformasjoner av triolein Molekyler
De tre acylkjedene av triolein molekyler kan spriker i forhold til hverandre, noe som fører til ulike molekylære konformasjoner. Tidligere MD simuleringer av ren TIL systemer i krystallinske eller amorfe landene viste at molekylene kunne vedta flere konformasjoner inkludert stemmegaffelen (SN1 og SN3 hale parallelt, og sn2 antiparallell), stolen (SN1 og sn2, eller sn2 og SN3 parallelt, og den andre halen antiparallell), Trident (alle haler parallell) eller væske (kjedene peker i tilfeldige retninger) [32]. Inne lipid bilag, vil det samme omfanget av konformasjoner ikke bli kopiert, fordi da ved grenseflaten, pakkingen av endene av en TO-molekyl vil være begrenset til å være parallell med bilaget normal. Men når en TO-molekyl er i senter av bilaget, kan dets acylkjeder spriker. Vi har delt TIL conformations inn i tre typer avhengig av vinkelen mellom tilstøtende par av haler.
θ
1-2
ble definert som vinkelen mellom SN1 og SN2 haler, og
θ
2-3
ble definert som vinkelen mellom sn2 og SN3 haler. Linjen bli glyserol perle til siste acyl halen perle beskrevet hver hale vektor. Vi klassifisert TIL conformations som fullt sprikende, dels sprikende eller ikke sprikende avhengig av
θ
1-2 Hotell og
θ
2-3
: Den samlede brøkdel av unsplayed, fullt sprikende, og delvis sprikende til molekyler er vist i fig. 3. Graden av splaying ble korrelert med posisjonen til en TO polart glycerol-ryggrad på innsiden av membranen. Som forventet, acyl haler var mer splayed i sentrum av bilaget i alle simuleringer. I motsetning til intuisjon, men kjedene er delvis utspredt mer enn 20% av tiden, og fullt ut sprikende 5% av tiden når den polare ryggraden i TO molekylene befinner seg ved grenseflaten. Fraksjonen av fullt splayed og delvis splayed TO molekyler er nesten identiske i alle systemer i midten av membranen. I 5,2% til systemer, de samlede sprikende fraksjoner er høyere fordi TO molekylene tilbringer mer tid i midten av membranen. For referanse, vinkelen mellom POPC acylkjeder var større enn 90 grader mindre enn 4,5% av tiden i alle CG simuleringer (data ikke vist). Den høye andelen av sprikende haler på bilaget sentrum antyder en isotrop å aggregere.
De fraksjoner av TIL sprikende haler i CG simuleringer. For definisjoner av splaying, henvises det til tekst. De haler av en TIL-molekylet er mer splayed når det er i nærheten av bilags sentrum, noe som tyder på en isotrop miljø i å aggregere.
Hydration nivåer av glyserol Perler
I
13C-NMR-spektra av tO i egg-PC unilamellære liposomer, var det mulig å skille de to topper som kommer fra de to a-karbonyler og β-karbonyl gruppe [17]. Jo høyere karbonyl resonans frekvens β-karbonyl indikerte at det var mindre hydrogenbundet til vann, og derfor satt dypere i lipid-vann-grenseflaten [17]. På fig. 4a, vi har vist de tetthetsprofiler for de tre glyserol perler fra CG simuleringene langs bilaget normalt. For klarhet, er bare data fra den lille 2,3% til System rapportert. Sn2 (eller β) karbonylgruppe er noe dypere i bilaget enn de to andre (SN1 og SN3) karbonyl kuler. Hydratiseringen av kulene ble beregnet fra den radiale fordelingsfunksjonen av vannperler rundt hver glycerol-ryggrad perlen (fig. 4b). Den β eller sn2 vulst er den minst hydratiserte del av glycerol ryggraden, i god overensstemmelse med NMR-data.
(a) Tetthet i fordelingen av de to α og en β glycerol-ryggrad perler av TO. For korthets skyld er bare ett monolag er vist. Den β vulst ligger dypere i bilaget enn de to a-perlene. (B) radiell fordeling funksjon av vann rundt kulene. Den β glycerol vulsten er klart mindre hydratiserte enn både a perlene, i meget god overensstemmelse med
13C-NMR [17].
De strukturelle egenskapene til dobbeltlaget (området pr lipid, tykkelse , ordre parametre) er presentert i saksdokumenter. Områdene og tykkelser er ordnet i Figur S2, og ordre parametrene presenteres som tekst S1.
Diskusjoner
Ved hjelp av omfattende CG simuleringer oppsummering til mer enn 1,8 millisekunder, gir vi bevis for tilstedeværelse av en stor å aggregere på bilaget sentrum til en tIL-konsentrasjon høyere enn grenseløseligheten av tIL. Som simuleringssystemet størrelsen øker, størrelsen av aggregatet også øker proporsjonalt. I de største simuleringene vi implementert (1400 nm
2 patch), den samlede sugd i det meste av TO molekyler fra grensesnittet til membranen sentrum (Fig. 5). Den samlede var skiveformet og omtrent 17 nm i diameter. I de 16×5 og 9×5 simuleringer, ble flere aggregater opprinnelig dannet i membranen, som senere koalisert sammen for å danne større aggregat. Det er ikke klart om størrelsen av aggregatet vil fortsette å øke etter hvert som stadig større bilags flekker er simulert, men endelig størrelse effekter er viktig i dagens system. For de mindre UNI5 og RAND5 simuleringer, ble en betydelig tetthet av TIL oppdaget på bilaget grensesnittet. Imidlertid, som simuleringen størrelse ble øket ved 4X, 9X og 16X har de fleste av de TO partisjonert i aggregatet ved dobbeltlaget midten.
Simulering øyeblikksbilde fra den største system 16×5 simulert, inneholdende en 37 x 37 nm bilaget lapp. (A) fra siden, der to periodiske bilder i langs bilaget normal har blitt vist. (B) ovenfra, er bare den sentrale simulering cellen vist. De blå linjene representerer de sentrale simulering cellegrensene. Den fargekoding er i likhet med fig. 2. Den samlede ved senteret er ~17 nm i diameter.
Når, og på hvilken kritisk størrelse (hvis noen) vil TIL aggregater forlate bilaget og fase skille? Triglyserid er uoppløselig i vann og fase skiller med en stor grenseflatespenning
γ
O /W
= 35-50 mN /m. Når amfifiler, f.eks overflateaktive midler eller lipider, blir innført i løsningen grenseflatespenningen er sterkt redusert som fører til mikrofaseseparasjon av vann og olje. Dette er forårsaket av anrikning av olje-vann-grenseflaten ved et monolag av amfifiler. Den grense fri energi (
F
i
) av en slik selv-montert amfifile grensesnittet må modifiseres for å inkludere bøying elastisk energi [38] Her
H
m
er den midlere krumning av den amfifile monolaget, og er den spontane krumningen av grensesnittet.
κ
m
er bøyestivheten [39], og
A
er grenseområdet. For uløselige amfifiler (for eksempel lipider så som POPC) grenseflatespenningen
γ
er forsvinnende, og den ovenstående ligning fører til en karakteristisk dråpestørrelse med radius 1 /. For en sfærisk formet selv-montert monolayer den spontane kurvatur kan estimeres fra den kritiske pakking parameter
P = v /al product: [40], [41]:
Her
l
er molekyl lengde,
v
er molekylvolumet og
en
er det tverrsnittsarealet av de hodegruppe. For POPC, er i ferd med 13,9 nm. Dette er den klassiske dråpe mikroemulsjon bilde av den ternære blanding av olje, vann og lipider [42]. Den foreliggende arbeid har vist at et annet scenario er mulig ved lave oljekonsentrasjoner. Lipider danner bilags-strukturer, som opp til en viss løselighetsgrensen
c * plakater (3% for TO i POPC) tillater inkorporering av triglycerid i bilaget. Når [TO]
c
*
, TO skillevegger mellom en konfigurasjon i sentrum av bilaget og en grenseflate konfigurasjon med en fordelingskoeffisient på ca. ~0.27. Når [Å]
c
*
, det overskytende TO faseseparerer inne i membranen struktur, for å danne en ren oljefase i midten av bilaget som vist i våre simuleringer. I likhet med den ovenstående beskrivelse av den dråpe mikro-emulsjon, triglyserid blemmer danner sammen med et lipid monolaget ved olje-vann-grenseflaten, med den samme foretrukne krumning. Imidlertid kan den totale størrelsen av blemmene være mindre, på grunn av grenseeffekter mellom bilaget og blisterpakningen. Bidraget av en slik grense virkning på formen og stabiliteten av slike blærer er nylig blitt beskrevet av Zanghellini et al. [43] i en fenomenologisk modell. Det er også mulig at blærer innenfor lipid bilag kan være dannet av andre hydrokarboner i tillegg, og en slik mulighet er verdt å undersøke i fremtiden.
Hva er den biologiske relevans TO aggregater? De fleste naturlig bilagsmembraner ikke inneholder en svært høy andel av TGLs. Imidlertid kan plasmamembraner visse aktiverte eller prolifererende celletyper, inkludert kreftceller, makrofager, B og T-celler, inneholder mer enn 5% TGLs, selv om funksjonen eller innblanding av tilstedeværelsen av en slik høy andel av TGLs er uklar [ ,,,0],27]. Ettersom løseligheten av grenseflate TGLs er mindre enn 5%, er den konformasjonelle spekteret av TGLs i plasmamembraner slike celler diskuteres. Anbefalinger basert på
1 H-NMR av mobile lipider som TGLs kan danne 20-30 nm store mikroområder på bilaget sentrum [26] ikke samle støtte på grunn av mangel på fysisk bevis for slike domener, som bare har dukket opp sporadisk [28 ], [29]. En distinkt mobil lipid
1H-NMR-signalet som oppstår fra 60 nm intra-membran-partikler kunne observeres i TEM-bilder fryse-frakturerte celler [28]. Partiklene var forskjellig fra calveolae, og signalet ble derfor tilbakeføres til en mobil lipid partikkel som består av TGLs og steryl estere [28]. Det ble imidlertid senere diskutert hvorvidt eller ikke et slikt
1H-NMR-signalet kan detektere partikler av denne størrelse i det hele tatt, riktignok for en annen cellelinje [27]. Basert på
1 H-NMR eksperimenter, Mountford og Wright hadde foreslått en membran modell der fettpartikler kunne overnatte i plasmamembraner. Mountford og Wright [26] argumenterte med at mesteparten av
1H-NMR-signalet stammer fra membranen, men dette har vært omstridt siden [25]. Simuleringer rapportert i dette arbeidet gi innledende molekylære bevis for konstruksjoner der DU kan faktisk være til stede inne bilag membraner i fritt tumbling form av «mobile lipider». Størrelsen av aggregatene observert i våre simuleringer er ikke så stor som 60 nm, rett og slett fordi vi ikke kunne modelsystemer som er store nok for et slikt aggregat til å danne. Dermed simuleringer gir støtte til opprinnelige modellen av Mountford og Wright, med unntak at vi er nølende til å ringe våre aggregater «domener», fordi deres maksimale størrelse (så langt) er begrenset til 17 nm. Videre finner vi at aggregatene er svært dynamisk i naturen, og til molekyler kan utveksle mellom aggregat og grensesnittet på tidspunktet omfanget av mikrosekunder.
Små TO dråper kan også bli funnet i cytoplasma av flere typer av pattedyr- og gjærceller, i form av lipid-dråper. Lipid dråper (LDS), tidligere ansett: kun energilagre, har nylig blitt anerkjent som cellulære organeller. LDs har en kjerne dannet av nøytrale lipider, som f.eks i adipocytter er for det meste TGLs. Kjernen er omgitt av et lipid monolag, som er avledet fra mor membran av ER. Imidlertid lipid sammensetningen av LD monolaget skiller seg fra ER-membranen. Den monolayer er rikt på fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin og phosphatidylinositol som ER, men inneholder flere lysolipids og fritt kolesterol og mindre sphingomyelin og fosfatidsyreinnhold enn moren membranen [44], [45]. Årsakene til berikelse og uttømming av visse lipid arter i LD monolaget er ikke kjent. En av de foreslåtte teori er at den biogenese av disc på ER-membranen forekommer i spesielle områder eller domener.
