Abstract
Bakgrunn
Det er velkjent at mange kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen (PC), har evnen til å unngå immunsystemet ved indirekte downregulating mononukleære celle maskiner nødvendig å lansere en effektiv immunrespons. Denne kunnskapen, i forbindelse med det faktum som har vist seg at trancriptome av perifere mononukleære blodceller som skal endres i sammenheng med mange sykdommer, inkludert nyrecellekarsinom, leder oss til å undersøke om en slik forandring i gen-ekspresjon eksisterer i PC som den kan ha diagnostisk verktøy.
Metoder og funn
PBMC prøver fra 26 PC-pasienter og 33 tilsvarende friske kontroller ble analysert av hele genomet cDNA microarray. Tre hundre åttitre gener ble funnet å være signifikant forskjellig mellom PC og friske kontroller med 65 ha minst 1,5 ganger endring i uttrykket. Pathway analyse viste at mange av disse genene falt inn trasé som er ansvarlige for hematopoietisk differensiering, cytokin-signalisering, og naturlige dreper (NK) celle og CD8 + T-celle-cytotoksisk respons. Unsupervised hierarkisk clustering analyse identifisert en åtte-genet prediktor sett, bestående av
SSBP2, Ube2b-RS1, CA5B, F5, TBC1D8, ANXA3, arg1, Kjøpe og
ADAMTS20; Eksporter som kunne skille PC pasientenes fra friske kontroller med en nøyaktighet på 79% i en blindet undergruppe av prøver fra behandlingsnaive pasienter, noe som gir en sensitivitet på 83% og en spesifisitet på 75%.
Konklusjoner
i sammendraget, vi rapportere første dyptgående sammenligning av globale genuttrykk profiler av PBMC mellom PC-pasienter og friske kontroller. Vi har også identifisert et gen prediktor sett som kan potensielt videreutvikles til bruk i diagnostiske algoritmene i PC. Fremtidige retninger av denne forskningen bør omfatte analyse av PBMC uttrykk profiler i pasienter med kronisk pankreatitt samt øke antall tidlig stadium pasienter for å vurdere nytten av PBMC i tidlig diagnose av PC
Citation. Baine MJ, Chakraborty S, Smith LM, Mallya K, Sasson AR, merke RE, et al. (2011) Transkripsjonell Profilering av perifere mononukleære blodceller i bukspyttkjertelen kreftpasienter Identifiserer nye gener med Potential Diagnostic Utility. PLoS ONE 6 (2): e17014. doi: 10,1371 /journal.pone.0017014
Redaktør: Ludovic Tailleux, Institut Pasteur, Frankrike
mottatt: 07.12.2010; Godkjent: 19 januar 2011; Publisert: 10 februar 2011
Copyright: © 2011 Baine et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (RO1 CA131944, RO1 CA78590, RO1 CA 133 774, EDRN UO1 CA 111 294, og SPORE P50 CA127297). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den UNMC Microarray Kjerne Facility får delvis støtte fra INBRE Program av National Center for Forskning Resources, NIH stipend nummer P20 RR016469
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) forblir en dødelig kreft med en samlet fem års overlevelse på bare ca 5% [1]. En betydelig bidragsyter til dårlig prognose av PC pasientene er unnlatelse av å oppdage svulsten på et tidlig og potensielt resectable scenen. Det er anslått at bare 8% av PC tilfeller er diagnostisert med tumorer lokalisert til bukspyttkjertelen, mens bare 15-20% regnes resectable. Videre av de pasienter som har hatt sin svulst resected, bare 20% bor mer enn 5 år etter diagnose [2]. Den vanligste dødsårsaken etter reseksjon er fjernmetastaser; lokalt tilbakefall er sjelden. Selv om studier viser forlenget overlevelse i PC-pasienter er sjelden, er det ubestridelig at tidlig påvisning og reseksjon av PC, spesielt i en lokalisert tilstand, vil trolig gi en betydelig økning i overlevelse.
Å designe en tidlig diagnostisk test for PC imidlertid presenterer en spesiell utfordring på grunn av den relative sjeldenhet av sykdommen, og det faktum at sykdommen forblir ofte asymptomatiske inntil et avansert stadium. Ideelt sett ville et tidlig diagnostisk test for PC være minimalt invasiv, og relativt billig, men som samtidig er tilstrekkelig følsom til å identifisere alle eller de fleste tilfeller av PC. Når kombinert med en svært spesifikk bekreftende test, kan det potensielt tillate tidlig identifisering av pasienter med resektabel sykdom.
CA19-9 er i dag den eneste markøren godkjent av FDA for bruk i PC. Imidlertid, mens CA19-9 er nyttig som en markør for sykdomsbyrde, det mangler både sensitivitet og spesifisitet (ca. 80% og 73% henholdsvis) som en diagnostisk markør [3] – [8]. Likevel er det fortsatt gull standard som alle potensielle biomarkører blir sammenlignet. I de senere årene har flere nye lovende biomarkører dukket opp som potensielt kan oppdage tidlig stadium PC enten i vev (MUC4, MUC1, CECAM1) eller i blodet (MIC-1, NGAL, telomerase og microRNAs) [9]. Men ingen av disse potensielle biomarkører er fri for vesentlige feil, viser følsomhet og /eller særegenheter som enten svak eller inkonsistent mellom studier. Det er således et klinisk behov for nye markører for tidlig diagnose av PC-en.
Perifert blod mononukleære celler (PBMC) omfatter de sirkulerende mononukleære celler, inkludert monocytter, T-celler, B-celler og naturlige dreper (NK) celler, og har dukket opp i de senere år som surrogatmarkører for flere sykdommer, inkludert inflammatoriske (f.eks preeklampsi, revmatoid artritt, og kronisk pankreatitt) og ondartet (kronisk lymfatisk leukemi og nyrekreft) sykdommer [10] – [14]. Men fortsatt sin rolle i deteksjon og forutsigelse av solide svulster begrenset. I den foreliggende undersøkelse, hypotese vi at en endring i den globale genekspresjon profilen av PBMC oppstår hos pasienter med PC og identifisering av PC-spesifikke genet undergrupper i PBMC kan være potensielt anvendbare ved tidlig påvisning av denne malignitet.
Nylige utviklinger har tillatt utviklingen av genet brikker som inneholder et sett av sykdoms spesifikke gener for enten diagnose eller prognose av flere forutsi maligniteter, inkludert bryst og esophageal kreft [15] – [18]. Resultatene fra vår studie antyder at en åtte-genet prediktor sett (valgt fra 383 differensielt uttrykte gener ut av 39,200 gener) kan skille mellom PC og friske personer med en sensitivitet og spesifisitet på 83% og 64% henholdsvis.
Materialer og metoder
Study befolkningen
studiet av blodbaserte biomarkører i PC ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved University of Nebraska Medical Center (UNMC) (IRB nummer 209-00). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og kontroller før innmelding i studien. For denne studien, 26 PC-pasienter og 33 alder, rase og kjønn matchet friske kontroller ble rekruttert. I alt 35 prøver ble oppnådd fra PC-en og 33 fra den friske gruppe. Baseline demografisk informasjon for begge gruppene er beskrevet i tabell 1.
Diagnosen PC var basert på en positiv biopsi av en pancreatic masse eller en metastatisk lesjon. PC-pasienter ble ytterligere klassifisert som lokaliserte (trinn 1 og 2a) eller ikke-lokaliserte (trinn 2b og høyere), før eller etter kirurgi, og før eller etter kjemoterapi. En pasient ble klassifisert som å være post-kirurgi hvis de hadde gjennomgått en pancreaticoduodenectomy før prøven ble trukket. Alle andre prøver, inkludert prøver fra pasienter som aldri hadde kirurgi i løpet av sin sykdom, ble klassifisert som pre-kirurgi. Enhver prøve trukket før pasienten hadde gjennomgått noen kjemoterapi for PC ble klassifisert som pre-kjemoterapi. Dersom pasienten hadde hatt kjemoterapi for PC, uavhengig av om eller ikke pasienten ble gjennomgår kjemoterapi på det tidspunkt prøven trekningen ble prøven klassifiseres som post-kjemoterapi. For pasienter der flere prøver ble trukket på forskjellige datoer, ble alle prøvene brukes i dataanalyse, med mindre uttrykkelig angitt i resultatene delen
PC iscenesettelse var basert på en av fire kriterier:. 1) patologisk staging post- kirurgi, 2) MR /CT /ultralyd staging, 3) endoskopisk staging, eller 4) biopsi av metastatisk sykdom.
Isolering av total RNA fra PBMC
PBMC ble isolert fra fullblod ved bruk av PharmLyse RBC lysis løsning (BD, San Jose, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av Qiagen RNAeasy RNA isolering kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) og deretter omdannet til cDNA ved hjelp av Superscript II-cDNA syntese-sett (Invitrogen, Carlsbad, CA) i henhold til en tidligere publisert protokoll [19].
cDNA microarray analyse av global genekspresjon profilen til PBMC
Microarray analyse ble utført av UNMC microarray kjernen anlegget ved hjelp av etablerte lab protokoll på Phalanx hele genomet cDNA microarray som inneholder 30,275 funksjoner sondering for ca 22 000 unike gener. En universell menneskelig referanse (Stratagene, Cat: 740000, Cedar Creek, TX) ble brukt som referanse mot der alle prøvene var normalisert
Statistical Analysis
Logg
2 transformasjon ble brukt. til alle forhold fulgt av normalisering til «center» hver array ved hjelp Lowess jevnere gjennom BRB ArrayTools utviklet av Dr. Richard Simon og Amy Peng [20]. Hvilket som helst gen i hvilken prosent av flekker mangler eller filtreres ut oversteget 50% ble utelatt. Duplicate flekker ble ikke gjennomsnitt, men behandles som separate gener for analyse. Blandede effektmodeller ble deretter brukt til å finne ut hvilke gener som var signifikant forskjellig uttrykt mellom PC og friske kontrollgrupper, noe som åpner for en 10% falske funnrate. Diagnosegruppe (kreft vs. normal) ble inkludert i modellen som en fast effekt og en tilfeldig gjenstand effekt ble også tatt med for å ta høyde for flere prøver per person.
hierarkisk clustering analyse av matriser basert på likhet i uttrykk profiler ble utført ved å bruke de normaliserte og log
2-transformerte data. Clustering ble gjort ved hjelp av Gene Cluster versjon 3.0, ved hjelp av «sentrert» Pearson korrelasjon likhet metrisk og komplett kobling clustering metoden, og visualisert ved hjelp av Java Utforsker.
Validering av microarray data av Q-RT PCR
De microarray resultatene ble validert av kvantitativ real time PCR (Q-RT PCR). Alle Q-RT PCR reaksjoner benyttes SYBR grønn basert kjemi. For validering, seks av de mest differensielt uttrykte gener: 3 oppregulert (
ANKRD22, ANXA3, ARG1
) og 3 nedregulert (
FCER1A, GRAMD1C, og MS4A1
) av microarray var valgt ut. Validering ble gjort i en tilfeldig valgt undergruppe av de originale prøvene (innsendt for microarray analyse) som inkluderte ni friske kontroller og tolv PC-pasienter. Den sammenleggbare forandring i gen-ekspresjon ble bestemt ved 2
-ΔΔCt fremgangsmåte ved bruk av samme referanse humane RNA som det som benyttes i mikromatrise. For å bestemme sammenhengen mellom microarray og Q-RT PCR resultater, vi beregnet median ganger endring i uttrykket (for et gitt gen) for PC vs. friske kontroller, og sammenlignet det til folden endringen sett av microarray for å avgjøre om genet var fortsatt forskjellig uttrykt i samme retning.
Korrelasjonen av genet signaturer med clinicopathologic egenskaper i PC
for å finne ut om det er differensial uttrykket av gener i PC-pasienter korrelerer med pasientens egenskaper, en blandet effekter modellen ble brukt på PC-prøvene som ble gruppert etter følgende kriterier: kirurgisk status (pre- vs. etter kirurgi), kjemoterapi status (pre- vs. etter kjemoterapi), historie av type-II diabetes mellitus før diagnostisering av PC (tilstede vs. fraværende), plassering av svulsten (hode vs kropp /hale), og stadium av PC (lokalisert vs ikke-lokalisert, og metastatisk vs. ikke-metastatisk). Betydelige gener ble valgt basert på et tillatt falske funnrate på mindre enn 10%. Stage 1a og 2a PC ble ansett lokalisert, mens trinn 2b, 3, og 4 stk ble ansett som ikke-lokalisert, og scene 4 svulster ble vurdert metastatisk. For to pasienter rekruttert til studien, kan informasjon om tumorstadium, svulst plassering og historie av type-II diabetes mellitus ikke innhentes.
Identifisering av et gen prediktor sett som skiller PC fra friske individer
BRB-ArrayTools versjon 3.8.0 ble brukt til å analysere alle mulige kombinasjoner av de 21,671 gyldige gener identifisert ved microarray for å avgjøre om en genetisk signatur kan bli identifisert som ville skille PC pasienter fra friske kontroller med en optimal kombinasjon av sensitivitet og spesifisitet . Microarray data for 24 tilfeldig valgte PC prøver og 20 friske kontroller ble inngått i analysen. Gener som skal velges for prediktor settet ble pålagt å være vesentlig forskjellig mellom PC og friske kontrollgrupper med et signifikansnivå på p≤0.0001 og med en fold forskjell uttrykk mellom de to gruppene ≥1.5. Kryssvalidering av genet prediktor settet ble gjentatt en ganger K-fold (K = 10). Genet prediktor sett kommet frem til gjennom disse metodene ble analysert ved ulike metoder, inkludert Compound kovariat Predictor, Diagonal Linear diskriminant analyse, en-nærmeste nabo, 3-nærmeste naboer, Nærmeste Tyngdepunktet, Support Vector Machines, og Bayesiansk forbindelse kovariat Predictor. Av disse er forbindelsen kovariat Varsels ga de beste prediktive evner å bruke genet prediktor settet og følgelig benyttes.
Validering av genet prediktor satt
Når prediktoren settet ble etablert, ble validert i et andre sett av tilfeldig valgt PC og friske prøver. Den statistiker ble blindet til identiteten til prøvene. Anvendelse av cut-off oppnås gjennom forbindelsen kovariat Prediction metode, ble prøvene klassifisert som enten «PC» eller «ikke-PC». Analysatoren (M.B.) ble deretter blindet og nøyaktigheten av forutsigelsen bestemt ved sammenligning med den aktuelle diagnosen. Vi har også benyttet den samme ligning for en undergruppe av pre-kjemoterapi pre-kirurgiske PC-pasienter for å bestemme evnen av prediktoren satt til riktig å klassifisere pasienter inn i PC vs. ikke-PC. Dette er viktig ettersom innflytelsen av kjemoterapi og /eller kirurgi på genekspresjon profilen av PBMC kan ikke utelukkes. Videre, den sistnevnte gruppe av pasienter som representerer den ideelle pasientpopulasjonen i hvem testen, hvis validert ville bli brukt i en klinisk sammenheng.
Resultatene
Etter normalisering og filtrering av mikroarray data, 21671 gener forble for analyse. Av disse ble 383 gener funnet å ha en betydelig differensial uttrykk mellom PC-pasienter og friske kontroller (tabell S1). Av disse ble 65 gener observert å ha en differensial uttrykk ≥1.5 ganger mellom de to gruppene (tabell 2-3).
En hierarkisk clustering av microarray data identifisert to klynger av prøver, er vist i figur 1 og i dendrogrammet skjemaet i figur 2, en PC-gruppe og en frisk kontrollgruppe. To PC-prøver imidlertid gruppert med friske kontroller, mens en frisk kontrollgruppe falt i klyngen som inneholder de fleste (32/35) av PC-prøvene. I tillegg gjorde genuttrykket profilen til en PC prøven ikke klynge med enten friske kontroller eller andre PC-prøvene.
hierarkisk klyngeanalyse av global genekspresjon profil ved cDNA hele genomet microarray sammenligne sunn kontroll og PC-prøver ved hjelp av alle gener funnet å være statistisk forskjellig uttrykt mellom de to gruppene (FDR 0,10, n = 383 gener). Ikke i noe tilfelle ble prøver samlet.
Red
indikerer gener hvis uttrykk er forhøyet i forhold til universell menneskelig referansen (brukes til å normalisere alle arrays) og
grønn
indikerer gener hvis uttrykk er redusert i forhold til universell menneskelig referanse.
En dendrogram prøve slektskap fra klyngeanalyse er vist i figur 1 ved hjelp av statistisk signifikante forskjellig uttrykt gener. Prøvene gruppert i hovedgrupper, samkjøre godt med klassifisering av PC eller HC. PC PBMC prøvene er markert med
grå søyler
mens sunne PBMC prøvene er merket med
gule streker
.
Q-RT PCR Validering
seks av de differensielt uttrykte gener (
ANKRD22, ANXA3, ARG1, FCER1A, GRAMD1C
, og
MS4A1
) ble valgt for validering av Q-RT PCR i en tilfeldig valgt undergruppe av 21 PBMC prøvene (bestående av 12 PC-prøver og 9 friske kontrollprøver fra den opprinnelige 68 brukes i mikromatrise). Median fold uttrykk for fem av dem var i samme retning som i microarray, noe som gir oss en valideringsrate på 83%.
FCER1A
var den eneste gen som en positiv korrelasjon ble ikke oppnådd. Resultatene er vist i Tabell 4.
Korrelasjonen av PBMC uttrykk profil med clinicopathologic egenskaper
For å avgjøre om en korrelasjon eksisterte mellom PBMC genuttrykk profil i PC-pasienter og klinisk relevant pasient egenskaper, fordelt vi PC prøvene basert på kirurgisk status (23 pre-kirurgi vs. 12 etter kirurgi), historien om kjemoterapi (15 pre-kjemoterapi vs. 20 etter kjemoterapi), diagnostisering av type-II diabetes mellitus før diagnostisering av PC (14 med en positiv historie vs. 19 med en negativ historie), plassering av primærtumor (25 hode mot 8 kropp /hale), og stadium av PC ved diagnose (6 lokalisert (stadium 1 /2A) vs 12 ikke-lokaliserte ikke-metastatisk (Stage 2B /3) vs. 15 metastatisk (Trinn 4) PC). Vi har imidlertid ikke observere noen signifikant forskjell i genekspresjon mellom noen av disse pasientgruppene som gjelder kriteriet om en FDR. 10%
Gene Predictor Set
Vi neste undersøkt om vi kunne identifisere en minimal gen-prediktor sett som ville nøyaktig diskriminere PC tilfeller fra friske kontroller. For å gjøre dette, ble 44/68 prøver bestående av 24 PC og 20 friske kontrollprøvene tilfeldig valgt. Alle 21,671 gener for hver av prøvene ble lagt inn i analysen. En åtte-genet prediktor sett ble innhentet og består av
SSBP2, Ube2b-RS1, CA5B, F5, TBC1D8, ANXA3, ARG1
og
ADAMTS20
. Ved anvendelse av forbindelsen kovariat beregningsmetode (ccpm), dette prediktor settet gav en korrekt klassifisering av PC vs. ikke-PC med en nøyaktighet på 73%, noe som gir en sensitivitet på 71% og en spesifisitet på 75%. Vektene gitt til hvert gen ved hjelp av ccpm var -4,97, -4,83, -4,38, 4,43, 4,44, 4,53, 4,84, 4,96 og henholdsvis med en terskelverdi på 38,98 slik at hvis Σ
i
w
i
x
jeg var terskelen for en prøve det ble spådd å være fra en PC pasient (der
w
i = gen vekt,
x
i = log
2 genuttrykk intensitet).
Validering av Gene Predictor Set
Ved hjelp av denne åtte-genet prediktor sett, klassifisering av en prøve som enten PC eller en frisk kontrollgruppe ble forsøkt i en blindet måte ved hjelp av et prøvesett bestående
bare
av prøvene som ikke ble brukt til å lage prediktor sett (dvs. 24/68). I denne blindet validering, ved hjelp av ligning utledet ovenfor, genet prediktoren innstilt nøyaktig forut diagnostisering av PC med 73% nøyaktighet, noe som gir en sensitivitet på 83% og en spesifisitet på 64%.
I et forsøk på å ytterligere teste potensialet for diagnostikk av dette genet prediktor settet, en ny undergruppe av sampler, som består av 12 PC prøver oppnådd fra pasienter som var både pre-kjemoterapi og pre-kirurgi, sammen med et tilsvarende antall tilfeldig valgte friske kontroller, ble igjen blindet og analysert for å forutsi deres klassifisering. Denne gangen de åtte-genet prediktor var i stand til å korrekt klassifisere disse prøvene 79% av tiden, noe som gir en 83% sensitivitet og 75% spesifisitet for diagnosen.
Diskusjoner
I de senere årene har det blitt gjentatte ganger vist at genetisk ekspresjon i PBMC-er endret i forbindelse med malignitet [13], [14], [21], [22]. Denne observasjonen av en endret PBMC genetisk uttrykk profil i kreftpasienter ble først rapportert i diffuse store B-celle lymfom og kronisk lymfatisk leukemi og senere utvidet utover hematologiske maligniteter gjennom analyse av PBMC uttrykk profilering hos pasienter med avansert nyrecellekreft (RCC) [ ,,,0],13] – [14]. I begge hematologiske maligniteter og i RCC, ble det rapportert at variasjonen i genekspresjon mellom pasienter med sykdom og friske kontroller var mye større enn inter-prøven variasjon observert for de friske pasienter alene, noe som antyder at PBMC kunne være nyttige surrogatmarkører med potensial diagnostiske og prognostiske for kreft. Videre, i RCC, ble det vist at en 8-gen sortereren sett utviklet seg fra de differensielt uttrykte gener kunne forutsi malignitetsdiagnose med 100% nøyaktighet [14].
Nylig, Huang et al. har rapportert at en differensial genuttrykk profilen eksisterer i PBMC av PC pasienter [22]. Selv om denne studien også brukt microarray og Q-RT PCR validering å etablere differensial genuttrykk i perifert blod av PC pasienter, dens formål var å etablere potensielle biomarkører som kan skille nydiagnostiserte diabetikere med PC fra diabetikere uten PC. Mens forfatterne av studien rapporterte at 48 gener ble uttrykt forskjellig mellom PC-pasienter og friske kontroller ved mikromatriser, ble bare åtte prøvene som brukes i hver av de to gruppene, og de ga ingen ytterligere informasjon om disse genene. Jo mindre utvalgsstørrelse og en mangel på blindet validering ytterligere kontrast denne studien med denne rapporten. I tillegg har vi ikke fant noen signifikant forskjellig uttrykt gener basert på historien om enten før kirurgi eller kjemoterapi, historie av type-II diabetes mellitus, eller stadium av PC i vår studie. Viktigere, studiet av Huang et al. utnyttes
GAPDH
som husholdningsgenet mot der uttrykk for hver genet ble normalisert. I vår studie, men vi bemerket at
GADPH
var en av de mest betydelig overexpressed gener i PBMC av PC pasienter. Oppregulering av
GAPDH
har også blitt rapportert i flere maligniteter inkludert eggstokkene, skjoldbruskkjertelen, hepatocellulær og bukspyttkjertel kreft [23] – [26]. Valget av den ideelle intern referanse genet i studier som undersøker mulige kliniske biomarkører ved mikromatriser er fortsatt et viktig spørsmål som må tas opp i fremtidige studier.
Denne studien representerer den første inngående analyse av transkriptom av PBMCer fra pasienter med PC sammenlignet med friske kontroller, og bare den tredje eksempel på en slik profilering for faste tumorer generelt. Etablering av et slikt differensialuttrykk har potensial til å gi en rik kompendium av potensielle gener for videre forfølgelse som nye diagnostiske eller terapeutiske mål. Videre kan genet nettverkene som er identifisert i vår undersøkelse gir ny innsikt i disregulation av immunsystemet i PC (figur 3). Med det faktum at bare 15-20% av PC pasientene diagnostisert med resectable sykdom og fikk sta motstand av malignitet til kjemoterapi og radioterapi, tidlig påvisning av sykdommen gir størst håp for en umiddelbar innvirkning på å forbedre pasientprognose.
Alle genene viste seg å bli nedregulert større enn 1,5 ganger. Den respektive Mengden av differensiell ekspresjon per-genet, så vel som angitt funksjon kan finnes i tabell 3. Den differensielle ekspresjonen av disse gener tyder på at det er en global nedgang i celleantall, aktivering, og effektiviteten av det adaptive immunsystemet hos pasienter med PDAC som kan ha en betydelig effekt på både deres sykelighet og dødelighet. Stiplede linjer indikerer tilknytning av celler mens heltrukne linjer indikerer differensiering eller spredning av en bestemt celletype. Tallene representerer enkelte punkter for interaksjon mellom gener og immun differensiering og svar pathway: 1, Presentasjon av antigen til Th0 celler; 2, Differensiering av Th0 celler nedover Th1 eller Th2 vei; 3, Immune celleproliferasjon; 4, stimulering av cytotoksisk T-celleaktivitet av Th1-celler; 5, stimulering av humoral immunitet ved Th2-celler; 6, Recognition og respons på målceller ved cytotoksiske T-lymfocytter (CTL); 7, Differensiering av naive B-celler; 8, lyse av målceller med CTL. Letters representerer enkelte cellepopulasjoner: a, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL); b, B-celler. Nedgang i gener assosiert med poeng a og b kan representere en reduksjon i sine respektive forbundet celle befolkning.
Potensialet for PBMC differensial genuttrykk profilering, eller av en forhåndsbestemt genet prediktor sett etablert fra det , for å være nyttig for tidlig diagnose av PC er teoretisk ganske høy; spesielt når det anses at de to mest sannsynlige mekanismene bak denne differensial uttrykket er immunsystemets gjenkjennelse av kreft og unndragelse av immunsystemet ved kreft. Mens andre biomarkører, slik som CA19-9, er frigjort fra kreftceller og derved øker med økende tumorbyrde, differensiell ekspresjon i PBMC kan begynne, i det minste delvis, så snart som kreft immunogenisitet eller immunsvik er etablert. Immunsystemet unndragelser har vist seg å bli igangsatt så tidlig som pre-ondartet sykdom i PC-en, og dermed støtter forutsetningen at analyse av differensial genuttrykk i immunceller kan tilby muligheten til å oppdage en neoplastisk lesjon selv før det får invasive evner [27] .
selv om denne studien i seg selv ikke forsøke å se på de tidlige diagnostiske mulighetene i PBMC, resultatene oppnådd fra arbeidet er et nødvendig første skritt mot en multiplekset analyse basert på endring av genuttrykk i PC for potensiell anvendelse i høyrisikogrupper [28]. Det faktum at en 8-gen prediktor sett var i stand til å etablere en sensitivitet på 83% med en spesifisitet på mellom 64 og 75% i en blindet sett av prøver er lovende, og vil måtte bli validert i et stort prøvesett. Mens antallet sampler er for liten til å utføre noen ytterligere detaljert analyse, det faktum at følsomheten for genet prediktoren sett ikke reduseres når de anvendes på PC-pasienter før kjemoterapi eller kirurgi peker mot den potensielle nytten av denne 8-genet prediktor set i en diagnostisk omgivelser, det viktigste område som mangler CA19-9 [4] – [8]. I tillegg er PBMC genekspresjonsanalyser ikke mer invasive av en test enn CA19-9, begge er mottagelig for en enkel venopuncture, og den samlede analyse trenger ikke være vesentlig dyrere enn dagens kliniske metoder for testing CA19-9. Hvis bare 8-genet klassifikator sett blir brukt for analyse, kan PBMC-testing utføres ved anvendelse av mini-cDNA microarray chips eller ved multipleks PCR-reaksjoner, som begge er klinisk levedyktige og vil være ganske enkelt å legge til repertoaret av prøver levert av en standard kliniske laboratorie.
Utover den diagnostiske potensialet i dette PBMC differensial ekspresjonsprofilen, de normale funksjoner og retning av differensial ekspresjon av hver av de gener, spesielt de 65 som var ≥1.5 fold uttrykt forskjellig, hint på mulige patofysiologiske mekanismer. 18/65 gener har potensial til å direkte redusere T-celle proliferasjon, T-celle-reseptor-signalisering, eller cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) cytotoksisitet mens fire kan direkte modulere en reduksjon av B-celleaktivering /differensiering eller signalisere en reduksjon i antallet av sirkulerende B-celler. Tre av genene kan direkte redusere cytotoksisitet i NK-celler, og to kan redusere makrofag respons. Tatt sammen, resultatene av vår studie foreslår at PC er kjennetegnet ved en betydelig reduksjon i evnen av immunsystemet til å svare på ikke-selv-antigener, inkludert tumorassosierte antigener, som oppsummert i figur 3. En delvis antydning om mekanismene som ligger til grunn denne immun kompromiss kan komme fra den observerte oppregulering av
ARG1
, observert å være oppregulert mer enn to ganger i PBMC av PC pasienter. Et uttrykk for ARG1 er nært assosiert med en økning i nærvær av myeloide avledet suppressorceller (MDSCs) [29]. MDSCs er klassisk kjent for å redusere CTL-respons, for det meste ved destabilisering av T-cellereseptorer og redusert ekspresjon av visse CD3-subtyper, til syvende og sist fører til CTL apoptose. Imidlertid er MDSCs kjent for spesifikt å bevirke at nedregulering av CD3Z, som ikke ble vist å bli uttrykt forskjellig i PBMC-er analysert i denne studien [29]. I tillegg er MDSCs kjent for å forårsake en trakt av immunsystemet bort fra cellulær immunitet og mot humoral og allergisk respons immunitet, en egenskap som ikke er tydelig vist i PBMC differensial ekspresjonsdata. Derimot viser det seg (fra forandring i gen-ekspresjon) at antallet av sirkulerende B-celler avtar mens både
FCER1A
, en reseptor sentralt for allergisk reaksjon, og
MS4A1
, som spiller en rolle ved B-celle til plasmacelledifferensiering, blir regulert ned. Således, mens MDSCs kan spille en rolle ved modulering av den differensielle ekspresjonen sett i PBMC fra PC-pasienter, de sannsynligvis operere sammen med andre mekanismer for å påvirke en nedregulering av både kroppens cellulære og humorale immunrespons maskineri.
En sammenligning av genekspresjonen observert i vår undersøkelse med det som rapporteres for andre sykdommer avslørte liten likhet med andre benigne (pre-eklampsi, revmatoid artritt (RA), og kronisk pankreatitt (CP)) og ondartede sykdommer (RCC). I alt 6 gener (
CD160, GOLGA8B, RABGAP1L, MMP8, CRISP3
, og
ARG1
) som ble vist å være forskjellig uttrykt i PBMC av pasienter med svangerskapsforgiftning ble også uttrykt forskjellig i PBMC av PC pasienter, med 4 (
CD160, MMP8, CRISP3
, og
ARG1
) blir forskjellig uttrykt i samme retning (1% alminnelighet) [10]. Tolv gener (
BTG2, CCND3, CD151, CD7, CLU, CTSB, KLRK1, SPN, GSTO1, PCMT1, PRDX6
, og
PRF1
) som ble vist å være forskjellig uttrykt i PBMC av pasienter med RA ble også uttrykt forskjellig i PBMC av PC pasienter, hvorav 8 (
CCND3, CD151, CLU, CTSB, GSTO1, PCMT1, PRDX6
, og
PRF1
) var i samme retningen (2% alminnelighet) [11]. To gener (PDE3B og GADD45a) funnet å være forskjellig uttrykt i PBMCer fra pasienter i KF ble også forskjellig uttrykt i PBMCer fra pasienter PC, verken som blir differensielt uttrykt i den samme retning (0% alminnelighet) [12]. Imidlertid var det ingen likhet i listen over betydelig differensielt uttrykte gener mellom PC og RCC [14].
