Abstract
Anemi av kreft (AC) kan bidra til kreft-relatert tretthet og forringe livskvaliteten. Bedre forståelse av patogenesen av AC kunne legge til rette for bedre behandling, men dyremodeller for å studere AC mangler. Vi karakterisert fire syngeniske C57BL /6 mus kreftformer som forårsaker AC. Mus med to forskjellige raskt voksende metastatisk lungekreft utviklet de karakteristiske funn av anemi av betennelse (AI), med dramatisk ulike grader av anemi. Mus med raskt voksende metastatisk melanom også utviklet et alvorlig anemi av 14 dager, med hematologisk og inflammatoriske parametre som ligner på AI. Mus med en saktevoksende peritoneal eggstokkreft utviklet en jernmangelanemi, sannsynligvis sekundær til kronisk svekket ernæring og blødning inn i bukhulen. Av de fire modellene, ble hepcidin mRNA nivåer økte bare i mildere kreft modell lunge. I motsetning til i vår modell av systemisk inflammasjon indusert av varme-drepte
Brucella abortus
, ablasjon av hepcidin i eggstokkreft og de mildere lungekreft musemodeller ikke påvirke graden av anemi. Hepcidin uavhengige mekanismer spiller en viktig rolle i disse murine modeller av AC
Citation. Kim A, Rivera S, Shprung D, Limbrick D, Gabayan V, Nemeth E et al. (2014) mus modeller av anemi av kreft. PLoS ONE 9 (3): e93283. doi: 10,1371 /journal.pone.0093283
Redaktør: Kostas Pantopoulos, Lady Davis Institute for Medical Research /McGill University, Canada
mottatt: 20 desember 2013; Godkjent: 28 februar 2014; Publisert: 28 mars 2014
Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH Lunge Critical Care Institusjonell Opplæring Grant T32 (HL072752) til AK, 09/2008 – 06/2011; og Roche Foundation for Anemi Forskning til TG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. T.G. og E.N. er cofounders, aksjonærer og tillitsvalgte i Indre Lifesciences, et selskap som utvikler hepcidin diagnostikk. E.N. og T.G. hold patenter relatert til den terapeutiske anvendelsen av hepcidin og dens regulatorer. Vennligst se under for patenter «detaljer, inkludert navn og tall: 1) Konkurranse Regulering av hepcidin mRNA ved Løselig og Cell-Associated Hemojuvelin (Ganz, Lin, Goldberg) US Patent no. 7.534.764, dato for utstedelse 19 mai 2009 2) Mini-hepcidin Peptider og metoder for anvendelse derav (Ganz, Nemeth, Preza, Ruchala) US Patent no. 8.435.941, dato for utstedelse 7 mai 2013 3) Ventende: Erythroferrone og ERFE polypeptider og metoder for Regulering Iron Metabolism (Ganz, Nemeth) PCT patentsøknad PCT /US2013 /67771. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Innledning
Anemi er en bemerkelsesverdig vanlig komplikasjon av kreft, forekommer i . 30% av ubehandlede pasienter [ ,,,0],1]. Forekomsten av anemi er ytterligere økt med kreftbehandling, inkludert kjemoterapi og strålebehandling. Anemi av kreft (AC) korrelerer med dårlig WHO funksjonstilstand og livskvalitet [2], [3]. Effektiv behandling av AC avtar subjektive tretthet hos kreftpasienter [4]. I tillegg til effektene på livskvalitet, kan tilstedeværelsen av AC være en uavhengig negativ prognostisk faktor [5].
Årsakene til AC er multifaktoriell og sannsynligvis varierer med opprinnelsen av primærtumor, samt som kronisiteten av sykdomsprosessen. Viktige medvirkende faktorer inkludere jernmangel sekundært til blødning eller ernæringsmangler [6], hemolyse som skyldes immun fenomener, aktivering av clotting kaskader eller unormal tumor-assosiert blodkar [7], svekket erythropoiesis sekundære utilstrekkelig erytropoietin produksjon eller deprimert respons av erythroide marg til erytropoietin [8], og direkte invasjon av margen av tumorceller med forstyrrelse av erytropoietisk miljø. En spesielt viktig bidragsyter til AC er betennelse, som AC deler mange av egenskapene til anemi inflammasjon (AI). AI er en normocytic, normochromic anemi med en forkortet erytrocytt levetid og deprimert erytropoiese. AI er også preget av en sinnsforvirring av systemisk jern homeostase preget av hypoferremia med intakte jernlagre [9] og redusert tilgjengelighet av jern for erytrocytt produksjon.
hepcidin, en 25-aminosyre peptid hormon som produseres hovedsakelig av hepatocytter [ ,,,0],10], er den primære regulator av jern homeostase i helse og i løpet av inflammasjon [11]. Hepcidin virker ved å binde seg til ferroportin, den eneste kjente cellulære jern eksport, fremvist på overflaten av celler som leverer jern i plasma: makrofager, hepatocytter og enterocyttene. Hepcidin binding til ferroportin fører til ferroportin endocytose og degradering [12], noe som begrenser flyten av jern i plasma og dermed redusere tilgjengeligheten av jern for erytropoiese. I løpet av betennelse, er hepcidin uttrykk sterkt indusert, i stor grad ved hjelp av IL-6 [13] via JAK-reaksjonsveien STAT [14] – [16] og dette hepcidin overskudd er antatt å bidra til utvikling av AI. Interessant nok har IL-6 er kjent for å være forhøyet hos flere tumortyper, inkludert lungekreft [17] og eggstokk-kreft [18]. I hvilken grad økt hepcidin produksjon bidrar til AC ikke har vært direkte testet av genetisk ablasjon av hepcidin, delvis på grunn av mangelen på musemodeller av AC.
Til tross for den høye forekomsten av AC med sine negative effekter på kvalitet av liv og overlevelse, er det få dyremodeller er utviklet for sin studie. Vi har preget fire syngene C567BL /6 mus modeller av kreft: to raskt voksende modeller av lungekreft, en raskt voksende modell av melanom, og en saktevoksende modell av eggstokkreft. Etter en omfattende undersøkelse av hematologisk, jern, og inflammatoriske parametre av disse modellene, undersøkte vi omfanget av hepcidin engasjement i utviklingen av AC i to av disse modellene ved å sammenligne C57BL /6 mus til hepcidin knockout mus på samme belastning bakgrunn.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr arbeid og omsorg ble utført i henhold til retningslinjene ved University of California, Los Angeles (UCLA) kanslerens forsøksdyr~~POS=TRUNC (ARC) . Særlig godkjenning for muse eksperimenter ble oppnådd med protokollen # 2008-129-12 tittelen «Rollen til IL-6 og hepcidin i anemi av kreft.» Alle rimelige anstrengelser ble gjort for å bøte lidelse, inkludert anestesi for smertefulle prosedyrer.
dyre~~POS=TRUNC modeller~~POS=HEADCOMP av anemi av kreft
Alle dyrestudier ble godkjent av forsøksdyrutvalget ved University of California, Los Angeles (UCLA). 6 uker gamle C57BL /6J mus ble oppnådd fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA), eller Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). For de tre raskt voksende kreftmodeller, mannlige og kvinnelige villtype (WT) mus ble anbragt på en jern tilstrekkelig diett (20 ppm jern, Harlan Teklad, Indianapolis, IN) i 2 uker før injeksjon av tumorceller eller saltvann. Den samme dietten ble brukt gjennom resten av forsøket. Denne kosten condition ble brukt fordi det høye jerninnholdet i standard chow (ca 7-8 ganger det daglige behovet) øker dramatisk hepcidin uttrykk og gjør det ikke svarer til inflammatoriske stimuli [19]. I tillegg kosttilskudd jern absorpsjon i mus står for så mye som 50% av de daglige jern flukser i mus matet standard chow, men bare ~5-10% hos mennesker [20]. Denne økte kosttilskudd jern absorpsjon i mus kan redusere den relative bidraget av jern resirkulering av makrofager [21] og fører til progressiv jern lasting. Dermed ble reduksjon av kosttilskudd jerninnhold i musen chow designet for å modellere jern fluks av menneskelig homeostase. For saktevoksende modell av eggstokkreft, ble hunnmus opprettholdt på et jern tilstrekkelig diett av enten 20 ppm jern eller 50 ppm jern.
For å generere en metastatisk lungekreft modell, dyrene ble injisert intraperitonealt (IP ) med 0,1 × 10
6 til 0,5 × 10
6 murine TC-en eller Lewis lungekarsinom (LLC) celler (ATCC, Manassas, VA). Fordi disse er metastatiske kreftceller, og vi etterforsker den systemiske responsen på disse kreftformene, valgte vi å utføre intraperitoneal injeksjon i stedet for å inkubere tumorceller i sin primære organ. Den LLC celler ble dyrket som adherente celler i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin G-streptomycin, og TC-1-celler ble dyrket som adherente celler i RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) supplert med 10% FBS og 1% penicillin G-streptomycin. På dagen for behandling ble tumorceller resuspendert i fosfatbufret saltvann (PBS), telles med en hematocytometer, og injisert i et volum på 500 ul PBS. Kontrollmus ble injisert IP med 500 ul PBS. Musene ble avlivet på 13-15 dager, og blod, lever og milt ble samlet ved obduksjon.
For musemodell for metastatisk melanom, ble dyrene injisert IP med 0,1 × 10
6 til 0,3 × 10
6 B16-F10-celler (ATCC, Manassas, VA). B16-F10 celler ble dyrket som adherente celler i DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) supplert med 10% FBS og 1% penicillin G-streptomycin. På dagen for behandling ble tumorceller resuspendert i PBS, tellet med en hematocytometer, og injisert i et volum på 500 ul PBS. Kontrollmus ble injisert IP med 500 ul PBS. Musene ble avlivet på 14 dager, og blod og lever ble samlet ved obduksjon.
For peritonealt spres eggstokkreft, ble dyrene injisert IP med 1 × 10
6 ID8 celler som ble sjenerøst gitt av Dr. Oliver Dorigo. Den metastatisk ID8 cellelinjen ble avledet fra spontan malign transformasjon av C57BL /6 mus eggstokkreft overflaten epitelceller
in vitro product: [22]. Cellene ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin G-streptomycin. På dagen for behandling ble tumorceller resuspendert i PBS, tellet med en hematocytometer, og injisert i et volum på 500 ul PBS. Kontrollmus ble injisert IP med 500 ul PBS. Musene ble avlivet på 18,5 uker.
For å studere rollen til hepcidin i anemi av kreft, vi brukte mannlige og kvinnelige hepcidin-en knockout (HKO) mus for TC-1-modellen, og kvinnelige HKO mus for ID8 modell. HKO mus ble opprinnelig gitt til vårt laboratorium av Dr. Sophie Vaulont [23] og ble backcrossed på C57BL /6 bakgrunn som tidligere beskrevet [24]. For denne delen av studien, HKO mus gikk kostkondisjonering for å hindre utvikling av jernoverskudd og opprettholde jernnivåer sammenlignbare med de av WT mus. Ved avvenning ble HKO musene startet på redusert jern dietter (4 ppm eller 20 ppm) for ca 2 uker for å hindre den massive jern lasting karakteristisk for denne knockout mus. Fra tidspunktet for injeksjonen, ble musene opprettholdt på 20 ppm jern diett for resten av studiet. For TC-1-modellen, ble HKO mus injisert og avlives som beskrevet ovenfor for WT mus. For ID8 modellen, ble HKO musene avlivet på 16,5 uker.
Måling av jernparametre og erytropoietin
Serum jern og lever ikke-heme konsentrasjoner av jern ble målt ved en kolo analyse for jern (Sekisui diagnostikk, Lexington, MA) som tidligere beskrevet [20]
Hematologiske studier
Fullstendige blodtellinger ble oppnådd med en HemaVet blod analysator (Drew Scientific,. Waterbury, Connecticut). For å vurdere jern begrenset erytropoiese, ble sink protoporfyrin (ZPP) målt ved hjelp av en hematofluorometer (AVIV, Lakewood, NJ). Retikulocytter ble tellet ved strømningscytometri. Blod (5 ul) ble tilsatt til 1 ml tiazol orange i PBS med 0,1% natriumazid (PBS-azid, BD Bioscience, San Jose, CA) og inkubert ved romtemperatur i 1-3 timer. Som en kontroll uten flekker, ble blod tilsatt til PBS-azid uten tiazol orange. Prosentandelen av røde fluorescerende retikulocytter (Retic-%), ble målt ved flowcytometri ved UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) og Senter for AIDS Forskning flowcytometrisystemer Kjerne Facility som er støttet av National Institutes of Health utmerkelser CA-16042 og AI -28 697, og ved JCCC, UCLA AIDS Institute, og David Geffen School of Medicine ved UCLA. Ufargede kontroller ble brukt til å etablere en port for å utelukke bakgrunnsfluorescens. Resultatene er uttrykt som retikulocytter produkt Indeks:. RPI = Retic-% × Hgb /baseline Hgb
RNA isolering og sanntids kvantitativ PCR
Total RNA ble isolert fra leveren og analysert ved real -time RT-PCR, som beskrevet tidligere [25].
Murine β-aktin ble benyttet som en kontroll rengjøring mRNA. Grunning er oppført i tabell S1
Histocytopathology
Perifere blodflekker som ble utført med 10 mL fullblod ved obduksjon, og forberedt med Wright-Giemsa flekken. (Fisher, Hampton, NH) .
statistikker
SigmaStat ble brukt for alle statistiske analyser (Systat programvare; Point Richmond, California). For melanom, lungekreft, og hepcidin KO-modeller, ble normalfordelte data sammen hjelp Student
t
-test. Målinger som ikke var normalfordelte ble sammenlignet med den parametriske Mann-Whitney Rank Sum test. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. ID8 villtype mus data ble opprinnelig analysert ved hjelp av Two Way ANOVA, med ID8 /saltvann injeksjon og kosthold jern som de to variablene som påvirker utfallet. Denne statistiske analyser viste ingen signifikant interaksjon effekt mellom de to variablene. Den ID8 vill-type data blir presentert ved hjelp av Student
t
-test for parametriske data, og Mann-Whitney Rank Sum test for metriske data. Korrelasjonsmålinger ble oppnådd ved Pearson korrelasjon.
Både mannlige og kvinnelige WT og HKO mus ble brukt for de tre raskt voksende kreft musemodeller. Analyse av sentrale hematologiske parametere, inkludert hemoglobin og serumjern, viste at det var ingen signifikant forskjell mellom hann- og hunnmus. Derfor presenterer vi kombinerte mannlige og kvinnelige data.
Resultater
Mus med metastatisk lungekreft utvikle anemi med retikulocytose og jern begrensning
Vi ga to modeller av metastatisk lungekreft ved å injisere de syngene cancercellelinjer, TC-1 og LLC, inn i peritonea av mus. Kontroll mus fikk PBS. Før dødshjelp på 14 d etter injeksjon, alle kreft musene viste tegn forenlig med systemisk sykdom sekundært til tumorbelastning, herunder slapphet, dårlig stell, og ascites. Obduksjon viste intraperitoneale masser i de fleste mus. Hemoglobin var lavere i tumor mus sammenlignet med kontroller (figur 1A). (LLC 7,8 g /dl sammenlignet med PBS 15,6 g /dl, P 0,001; TC-1 14,2 g /dl sammenlignet med PBS 15,6 g /dl, P = 0,029). De anemiske kreft mus hadde økt retikulocytose sammenlignet med kontrollene (fig 1B.) (RPI i Advisor 10,7 vs. PBS 2.4, P 0,001; TC-1 6,1 vs. PBS 2.4, P 0,001). Av notatet, LLC-musene hadde lavere hemoglobinnivå enn TC-1 mus (P 0,001). Og større retikulocytose (P = 0,006)
C57BL /6 mus ble injisert intraperitonealt med 0,1 × 10
6 -0,5 x 10
6 murine TC-1 eller Lewis lungekarsinom (LLC) celler og avlivet etter 14 dager. Sammenlignet med kontrollene, de tumor-bærende mus har: (A) redusert hemoglobin; (B) økte retikulocytose. N = 8-19 mus per behandling og kontrollgruppe. * P 0,05, ** P 0,001; P av Mann-Whitney Rank Sum test. Barer og feilfelt er median ± 75
th /25
th persentil.
Når utilstrekkelig jern er tilgjengelig for erytropoiese, økte nivåer av sink er innlemmet i protoporphyrin ringen. Derfor sink protoporfyrin (ZPP) nivåer er en god indikator på jern begrenset erythropoiesis [26]. ZPP nivåene i tumor-bærende mus ble økt i forhold til kontroller, hvilket indikerer jern-begrensede erytropoese (figur 2A). (LLC 160 versus PBS 84, P 0,001; TC-1 136 vs. PBS 84, P 0,001). LLC mus hadde en tendens til høyere ZPP nivåer enn de mindre blodfattig TC-1 mus (P = 0,129). Tumor-bærende mus hadde hypoferremia som indikert ved en serumjern analyse (figur 2B). (LLC 11,5 umol /l sammenlignet med PBS 39,8 umol /L, P = 0,004, TC-1 20,8 umol /l sammenlignet med PBS 39,8 umol /L , P = 0,031). For å avgjøre om dette var på grunn av jern-håndtering, som ville bli sett i anemi av betennelse, snarere enn jernmangelanemi sekundært til underernæring eller blødning, ble hele kroppen jernlagre estimert ved hjelp av lever og milt vev jern målinger. Begge lungetumormodeller hadde høyere lever nonheme jerninnhold enn kontroller (figur 2C.) (LLC 8,9 umol Fe /g vs. PBS 1,5 umol Fe /g, P 0,001; TC-1 3,9 umol Fe /g vs. PBS 1,5 pmol Fe /g, P = 0,002). LLC mus hadde også høyere milt nonheme jerninnhold enn kontrollene, og TC-1 mus hadde sammenlign milt jerninnhold (Fig. 2D) (LLC 15,9 umol Fe /g vs. PBS 10,4 umol Fe /g, P = 0,039).
C57BL /6 mus ble injisert intraperitonealt med TC-1-celler eller LLC og avlivet etter 14 dager. Begge tumor-bærende musemodeller viser: (A) forhøyet ZPP nivåer sammenlignet med kontroller, noe som indikerer jern-begrensede heme syntese; (B) hypoferremia; (C) økte lever jern. (D) Advisor-bærende mus har økt milt jern, og TC-1-bærende mus har en tendens til økt milt jern, TC-1 vs PBS, P = 0,381. N = 8-19 mus per behandling og kontrollgruppe. * P 0,05, ** P 0,001; P av Mann-Whitney Rank Sum test. Barer og feilfelt er median ± 75
th /25
th persentil.
Mus med metastatisk lungekreft manifest betennelse, men hepcidin økes bare i mindre alvorlige modellen
for å evaluere bidraget av inflammasjon og hepcidin aktivitet til utviklingen av anemi hos våre cancermodeller, målte vi hepatiske mRNA konsentrasjonene av SAA-1 og hepcidin. SAA-1 er et hepatisk akutt fase-reaktant som er kjent for å være økt i respons på inflammasjon og visse cytokiner, spesielt IL-6 [27]. Som IL-6 er antatt å være en viktig årsak til blodmangel av betennelse ved å indusere ekspresjon hepcidin [19], anvendte vi SAA-1-målinger som en indikator for IL-6-aktivitet. På dag 14 hadde både TC-1 og LLC mus forhøyede lever SAA-1 mRNA-nivåer sammenlignet med kontroller (fig. 3A). LLC mus hadde en 75-dobling i løpet av de PBS mus (P = 0,001), og TC-1 mus hadde en 340-dobling (P = 0,002). På dag 14, hadde mildt blodfattig TC-1 mus mildt forhøyet lever hepcidin mRNA nivåer sammenlignet med kontroller ( 2 ×, P = 0,012) (figur 3B), mens de mer alvorlig blodfattig LLC mus hadde lavere hepcidin nivåer (P = 0,022), kanskje på grunn av counterregulatory virkning på hepcidin av moderat anemi og de resulterende erytropoietiske stimulus [28]. For å vurdere påvirkning av betennelse på hepcidin mRNA uttrykk, vurderte vi sammenhengen mellom nivåene av SAA-en mRNA og tilsvarende hepcidin mRNA nivåer i enkelte mus, men sammenhengen var svak [data ikke vist]. Til tross for mye høyere SAA-1-nivåer i tumorbærende mus enn i kontroller, et tegn på tumor-indusert betennelser, ble hepcidin mRNA konsentrasjoner ikke økt proporsjonalt i TC-1-bærende mus, og selv ble redusert i Advisor-bærende mus. Disse dataene antyder at andre faktorer kan motvirke effekten av betennelse på hepcidin syntese, og disse kan inkludere blodmangel og økt erytropoiese.
Ved dag 14 (A) både tumormodeller har økte nivåer av lever SAA-en mRNA ; (B) TC-1-bærende mus har økt lever hepcidin mRNA nivåer sammenlignet med kontroller, og Advisor-bærende mus har sunket hepcidin. N = 8-19 mus per behandling og kontrollgruppe. * P 0,05; P av Mann-Whitney Rank Sum test. Barer og feilfelt er median ± 75
th /25
th persentil.
hepcidin mRNA nivåer ble også målt i svulstene å avgjøre om svulsten hepcidin uttrykk kan være medvirkende til utviklingen av anemi hos cancer. Verken TC-en heller LLC svulster hadde påvisbare hepcidin uttrykk, som illustrerer at disse svulstene ikke direkte bidra til systemiske hepcidin nivåer.
Mus med melanom utvikle anemi med jern-begrenset erythropoiesis og betennelse
neste genereres en musemodell for metastatisk melanom ved å injisere en melanom cellelinje B16-F10 og inn i peritonea av mus. Kontroll mus fikk PBS. Før dødshjelp 14 d etter injeksjon, tumor musene viste tegn forenlig med systemisk sykdom og tumorbelastning, herunder apati og ascites. Komplett blodprosent analyse viste en markert anemi i melanom mus sammenlignet med kontroller (Fig 4A.) (B16-B10 Hgb 8,2 g /dL vs. PBS Hgb 15,6 g /dL, P 0,001). Tumor mus også utviklet en robust retikulocytose 4 × det av (figur 4B.) Sine kontroll kolleger. Melanom mus viste betydelig jernfattig erytropoiese med a . 2-ganger økning i ZPP nivåer sammenlignet med kontroller (Fig. 4C)
C57BL /6 mus ble injisert intraperitonealt med 0,1 × 10
6 -0,3 x 10
6 B16-F10 celler, og avlivet etter 14 dager. De melanom-bærende mus utvikler: (A) en signifikant anemi; (B) økte retikulocytose sammenlignet med kontroller; (C) forhøyet sink protoporfyrin (ZPP) nivåer sammenlignet med kontroller, som indikerer jern begrenset heme-syntesen; (D) økte nivåer av lever SAA-1 mRNA, en markør for inflammasjon og IL-6-aktivitet; (E) lavere nivåer av hepcidin mRNA. N = 8-11 mus per behandlingsgruppen og kontrollgruppen. * P 0,05, ** P 0,001; P av Mann-Whitney Rank Sum test. Barer og feilfelt er median ± 75
th /25
th persentil
På dag 14, de melanom musene hatt en dramatisk økning ( 600 ganger). I SAA- 1 mRNA sammenlignet med kontroller, noe som indikerer robust betennelse (fig. 4D). Hepcidin mRNA-nivåer ble undertrykt i tumor mus i forhold til kontroller (fig. 4E). Fordi denne svulsten utløst en anemi med svært like egenskaper til at forårsaket av metastatisk LLC lungekreft, ble dens effekt på jern homeostase ikke karakteriseres videre.
Mus med eggstokkreft utvikle jernmangelanemi
Vi har også analysert utviklingen av blodmangel i mus med en saktevoksende eggstokkreft ved injisering av den syngeniske ovarian cancer cellelinje ID8 inn i peritonea av mus. De ID8-injiserte og PBS-injiserte kontroll mus ble avlivet 18,5 uker etter datoen for injeksjon. På denne tiden, alle tumorbærende mus viste tegn forenlig med systemisk sykdom, inkludert slapphet, dårlig stell, og ascites. Obduksjon viste synlige intraperitoneal massene i de fleste musene med blodig ascites i mange. Hemoglobin var lavere i tumorbærende mus sammenlignet med kontroller (fig. 5A) (ID8 10,4 g /dl sammenlignet med PBS 11,25 g /dl, p = 0,040). PBS mus seg hadde redusert moderat hemoglobinnivå, sannsynligvis som følge av å ha blitt matet en redusert jern diett i 18 uker. De tumor-bærende mus hadde forhøyet ZPP nivåer sammenlignet med kontroller, noe som indikerer jern-begrensede erytropoese (fig. 5B) (ID8 162 versus PBS 129, p = 0,008). Totalt kroppen jernlagre ble evaluert ved hjelp av lever og milt vev jern målinger. De ID8-bærende mus hadde lavere lever og milt jerninnhold enn kontrollene (fig 5C, D). (ID8 leveren jern 8,1 umol Fe /g vs. PBS leveren jern 14,9 umol Fe /g, P = 0,041; ID8 milt jern 63,1 umol Fe /g vs. PBS milt jern 138,5 pmol Fe /g, P = 0,011). Derfor er denne ovarial tumor modellen utvikler anemi med frank jernmangel, sannsynligvis delvis sekundært til blødning inn i bukhulen og svekket ernæring.
C57BL /6 mus ble injisert intraperitonealt med 1 x 10
6 ID8 celler og avlives etter 18,5 uker. Sammenlignet med kontroller, ID8-bærende mus: (a) er mer blodfattig; (B) har forhøyede ZPP nivåer; (C, D) har lavere lever og milt jern nivåer. N = 10-16 mus per behandlingsgruppen og kontrollgruppen. * P 0,05, ** P 0,001; P av Mann-Whitney rank-sum test (A, B) eller student
t
-test (C, D). Barer og feilfelt er median ± median ± 75
th /25
th persentil (A, B) eller gjennomsnitt ± SD (C, D).
Mus med eggstokkreft har undertrykte hepcidin nivåer responsive til leverjernlagre
på 18,5 uker hadde ID8 mus deprimert leveren hepcidin mRNA nivåer sammenlignet med kontroller (fig. 6A) (ID8 0,20 vs. PBS 14,08, p = 0,013), samt som sammenlign SAA-1 nivåene til kontroller (fig. S1) (P = 0,361), noe som indikerer at betennelse og hepcidin ikke spiller en viktig rolle i utviklingen av dette anemi. I tillegg, figur 6B viser en signifikant positiv korrelasjon mellom hepcidin og lever jern nivåer, noe som indikerer passende hepcidin undertrykkelse med utviklingen av jernmangelanemi i denne ovarial tumor modellen (ID8 hepcidin vs. leveren jern, R «sup> 2 = 0,64 ., P = 0,017)
på 18,5 uker, ID8-bærende mus sammenlignet med kontrollene (A) undertrykt hepcidin mRNA; (B) signifikant positiv sammenheng mellom leverjernlagre og hepcidin mRNA uttrykk. N = 11-16 mus per behandlingsgruppen og kontrollgruppen. * P 0,05; P Mann-Whitney Rank Sum test i (A), og ved Pearson korrelasjon i (B). Barer og feilfelt er median ± 75
th /25
th persentil.
Utviklingen av anemi i musetumormodeller er ikke sekundært til mikroangiopatisk hemolyse
listen over mulige årsaker til anemi hos kreft modeller inkluderer mikroangiopatisk hemolyse eller klipping av erytrocytter, som også kan sees i inflammatoriske anemias [6]. De perifere blodflekker av tumorbærende mus viste ingen schistocytes eller erytrocytt fragmenter. Figur 7B viser en nesten normal blodutstryk av TC-1-modellen, med minimal membranuregelmessigheter. Figurene 7C og 7D viser at mer anemiske LLC og ID8 modellene har mer alvorlige erytrocytt abnormiteter, inkludert dråpe celler og sentral blekhet, men igjen uten et betydelig antall schistocytes som skulle tilsi et bidrag på mikroangiopatisk hemolyse til anemi. [29]
(A) PBS-kontroll (B) TC-1 (C) LLC (D) ID8.
Anemi er ikke svekket i hepcidin-ablated TC-1- eller ID8 bærende mus
for å teste om hepcidin bidrar til utvikling av anemi i tumorbærende mus injisert vi to av tumorcellelinjer i hepcidin knockout mus. På dag 14 etter TC-en injeksjon, var det ingen signifikant forskjell mellom hemoglobin reduksjon av villtype og hepcidin knockout mus (Fig. 8A) (WT TC-1 -1,08 g /dl vs. HKO TC-1 -0,99 g /dL, P = 0,908). Selv om TC-1 mus hadde svakt forhøyede nivåer av hepcidin, er hepcidin åpenbart ikke er essensiell for utviklingen av denne anemi. Tatt sammen med økningen i SAA-1-nivå Disse data tyder på en hepcidin uavhengige inflammatoriske mekanisme for anemi.
(A) ved dag 14, er det ingen signifikant forskjell mellom de hemoglobin endringer i TC-1 -bærende villtype og hepcidin knockout mus (P = 0,908). (B) Absolutte hemoglobinnivåer på mus er vist i A. (C) med 18,5 uker, er det ingen signifikant forskjell mellom de hemoglobin forandringer av ID8 bærende villtype og hepcidin knockout mus (P = 0,739). (D) Absolutte hemoglobinnivåer på mus er vist i C. N = 4-19 mus per behandlingsgruppen og kontrollgruppen. P av t-test. Barer og feilfelt er gjennomsnitt ± SD.
For å undersøke om hepcidin uttrykk er nødvendig for utvikling av jernmangel i en mer kronisk modell, vi sammenlignet utviklingen av anemi i WT og hepcidin knockout mus med ID8 eggstokkreft. På 18,5 uker, var det ingen signifikant forskjell mellom hemoglobin reduksjon av villtype og hepcidin knockout mus behandlet med ID8 (Fig. 8C) (WT ID8 -5,26 g /dL vs. HKO ID8 -4,50 g /dl, P = 0,739 ). Disse data bekrefter våre funn at ID8 bærende mus utvikler anemi som følge av blødning og ernærings jernmangel, snarere enn en hepcidin-mediert inflammatorisk mekanisme.
Diskusjoner
Anemi av kreft (AC) er en ofte oversett, men viktig manifestasjon av malignitet. Selv mild anemi har vist seg å påvirke pasientrapportert livskvalitet (livskvalitet) parametre [30]. Selv om en redusert hemoglobin er bare en faktor i utviklingen av deprimerte livskvalitet målinger i kreftpasienter, har den forbedring av anemi er vist å ha en betydelig og direkte sammenheng med generell livskvalitet [31]. Forbedringen i livskvalitet med anemi behandling vedvarte uansett partiell eller fullstendig respons til noen kjemoterapiregime. I tillegg AC har vist seg å være en uavhengig negativ prognostisk faktor for overlevelse på kreftpasienter [32].
Til tross for de uheldige virkninger av AC, er det i henhold til anerkjente og under-behandlet av leger [33] , delvis på grunn av mangel på sikker og effektiv terapi. Blant mulige behandlinger, røde blodlegemer transfusjoner forbundet med immunsuppressive effekter, infeksjon overføring og transfusjonsreaksjoner [34]. Erytropoesestimulerende legemidler, slik som rekombinant humant erytropoietin, har vært forbundet med høyere dødelighet hos pasienter med hode- og halskreft, brystkreft og ikke-småcellet lungekreft [35]. Prekliniske modeller bør legge til rette for utvikling av sikrere og mer effektive behandlinger.
I den sparsomme litteraturen på rollen hepcidin i AC, det er noe bevis på at betennelse og økt hepcidin konsentrasjoner kan bidra til AC. Butterfield et al. vist at serum hepcidin nivåene ble markert forhøyet hos mennesker med hematologiske eller nonhematologic kreft, inkludert melanom og lunge kreft [36]. En annen studie av anemiske kreftpasienter ved Ukarma et al. [37] viste en invers sammenheng mellom hepcidin nivåer og et hemoglobin respons på epoetin terapi. Dette forholdet mellom epoetin motstand og øket hepcidin indikerer en potensiell rolle hepcidin i mekanismen for AC utvikling. Sasu et al. ytterligere stratifisert anemiske kreftpasienter til de med inflammatorisk, blandede, og jern-mangel anemier, ved hjelp av hematologiske parametere og C-reaktivt protein nivåer [38]. Denne lagdelingen viste at de betente pasientene hadde de høyeste nivåene av serum hepcidin, etterfulgt av pasienter med blandet anemi. Det var også en direkte sammenheng mellom inflammasjonsmarkører (ferritin og CRP) og hepcidin i AC pasienter, noe som tyder på en rolle betennelse-indusert hepcidin økning i patogenesen av AC i en undergruppe av kreftpasienter med fremtredende betennelse.
Vi har nylig publisert en detaljert karakterisering av en musemodell som hjalp definere bidrag hepcidin i anemi inflammasjon (AI) [39].
