Abstract
Cell-gjennomtrengende peptider (CPP) har vist seg svært effektiv som intracellulære levering kjøretøy for ulike therapeutics. Det er imidlertid noen bekymringer om ikke-spesifikk penetrasjon og cytotoksisitet av CPP for effektiv kreftbehandling. Heri, basert på celle-gjennomtrengende motiv av et anticancer peptid, buforin Ilb, vi utviklet flere CPP-derivater med kreftcelle spesifisitet. Blant de derivater, ble et 17-aminosyrepeptid (BR2) funnet å ha cancer-spesifisitet uten toksisitet overfor normale celler. Etter spesifikt rettet mot kreftceller gjennom samhandling med gangliosider, BR2 kom inn celler via lipid-mediert macropinocytosis. Videre BR2 viste høyere membran trans effektivitet enn den velkjente CPP Tat (49-57). Evnen til BR2 som en cancer-spesifikk medikamentbæreren ble demonstrert ved fusjon av BR2 til et enkelt-kjede variable fragment (scFv) rettet mot et muterte K-ras (G12V). BR2-kondensert scFv induserte en høyere grad av apoptose enn Tat-sammensmeltet scFv i K-ras muterte HCT116-celler. Disse resultatene tyder på at romanen celle-gjennomtrengende peptid BR2 har et stort potensial som et nyttig stoff levering bærer med kreftcelle spesifisitet
Citation. Lim KJ, Sung BH, Shin JR, Lee YW, Kim DJ, Yang KS , et al. (2013) En Cancer Spesifikk Cell-Penetrating Peptide, BR2, for effektiv levering av en scFv til kreftceller. PLoS ONE 8 (6): e66084. doi: 10,1371 /journal.pone.0066084
Editor: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 02.11.2012; Godkjent: 06.05.2013; Publisert: 11 juni 2013
Copyright: © 2013 Lim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Intelligent Syntetisk biologi Center of Global Frontier prosjekt finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2011-0031955). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de fordelaktige effektene av mange nylig oppdagede potensielle terapeutiske midler, slik som proteiner, nukleinsyrer, og hydrofile stoffer, er begrenset på grunn av deres manglende evne til å nå de riktige intracellulære mål [1], [2]. Således har en rekke tilnærminger som mikroinjeksjon, eletroporation, liposomal formulering og anvendelse av virale vektorer blitt utforsket for å fremme effektiv medikamentavgivelse [3], [4]. En stor bekymring om disse teknikkene er deres dårlige celle spesifisitet [4], [5]. Derfor er utviklingen av en mål-spesifikk medikamentavgivelsessystemet et hovedanliggende for å forbedre den terapeutiske effekt av medikamenter samtidig redusere deres effektive doser og bivirkninger [6], [7].
Cell-gjennomtrengende peptider ( CPP), også referert til som protein transduksjon domener, har trukket spesiell oppmerksomhet som et alternativ intracellulær levering av legemidler kjøretøy siden oppdagelsen av den første CPP, Tat, i 1988 [8]. CPP er korte peptider som består av færre enn 30 aminosyrer, og består for det meste av grunnleggende, positivt ladede aminosyrer (f.eks Arg, Lys og His) som har kapasitet til å translocate gjennom cellemembranen og for å levere en rekke celle-ugjennomtrengelig last på tvers cellemembranen [9], blant annet proteiner, [10], nukleinsyrer [11], siRNA [12], peptid nukleinsyrer (PNA) [13], små molekyl terapeutika [14], kvanteprikker [15], og MRI-kontrast agenter [16]. Selv om den eksakte mekanismen for CPP er ukjent, nyere mekanistiske undersøkelser antyder at deres cellulære opptak resulterer fra en initiell rask elektrostatisk vekselvirkning med plasmamembranen, etterfulgt av endosomale opptak [17], [18].
Ved hjelp av CPP for intracellulær avlevering av et bredt spekter av makromolekyler er en kraftig metode på grunn av deres allsidighet sammenkoblet med lett funksjonalisering av koblede last og høy leveringsdyktighet inn i ulike cellelinjer, vinne utfordringer ofte overfor andre utleveringsmetoder [19], [20]. Derfor har mange studier fokusert på utvikling av nye CPP; antall tilgjengelige CPP med ulike egenskaper, for eksempel økt stabilitet og effektiv last levering, fortsetter å øke [17].
Selv om potensialet for CPP som leveringsmidler er stor, deres mangel på celle spesifisitet, cytotoksiske effekter og uventede bivirkninger er store bekymringer for deres utvikling som narkotika levering kjøretøy [21]. For kreftbehandling, er CPP celle spesifisitet spesielt viktig slik at bivirkninger på normale celler er minimert [22], [23]. Derfor er det et sterkt behov for utvikling av cancer-spesifikk og ikke-toksiske CPP for effektiv kreftbehandling.
Vi har tidligere rapportert at en sterk antimikrobiell peptid, buforin Hb (RAGLQFPVG [RLLR]
3), har en sterk celleinntrengningsevne og anticancer aktivitet mot forskjellige kreftcellelinjer [24], [25]. Selv om buforin Ilb viste selektiv cytotoksisitet mot kreftceller, er det også påvirket levedyktigheten av normale celler ved høye konsentrasjoner. Å utvikle buforin IIb som en effektiv levering av legemidler kjøretøy bør sin cytotoksisitet mot normale celler minimaliseres samtidig opprettholde sin kreftcelle spesifisitet.
I denne studien har vi designet en ny kreft-spesifikke og ikke-giftig celle-gjennomtrengende peptid, BR2, basert på celle-gjennomtrengende motiv av buforin Ilb og undersøkt potensial som en effektiv medikamentavgivelses kjøretøyet inn i kreftceller ved å fusjonere BR2 til et enkelt-kjede variable fragment (scFv) antistoff mot muterte K-ras.
Materialer og metoder
Cell Culture
humant livmorhalskreft cellelinje HeLa, humane koloncancer cellelinje HCT116, musemelanomcellelinje B16 /F10, musfibroblastcellelinje NIH 3T3, human keratinocytt cellelinje HaCaT og human-fibroblast-cellelinje BJ ble alle erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), og dyrket i et fullstendig medium [Dulbeccos modifiserte eagle medium] (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) , 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin. Celler ble dyrket i fuktede betingelser ved 37 ° C med 5% CO
2.
Peptide Design and Synthesis
designet flere derivater av buforin Ilb (BR3) ved trinnvis eliminering av C-terminale vanlige a-heliks-motivet RLLR gjentakelser av buforin Ilb å skape en kreftcellespesifikke og ikke-toksiske CPP. De designede peptider besto av ulike antall C-terminal vanlig α-heliks motiv RLLR og heter BR1 og BR2 (tabell 1).
CPP Tat, BR1, BR2 og BR3 ble kjemisk syntetisert ( Anygen, Kwangju, Korea) på en Igen 9050 peptid synthesizer. Fluorescein-rest (FITC) ble festet til den N-terminale ende via en aminoheksansyre spacer ved å behandle en resinbundne peptid (0,1 mM) med FITC (0,1 mM) og diisopropyletylamin (0,5 mM) i N, N-dimetylformamid ( DMF) i 12 timer. Alle rå peptider ble renset og analysert ved reversfase-væskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) på en C18-kolonne, og de rensede peptidene ble karakterisert ved elektrospray ionisering-massespektrometri (ESI-MS).
Confocal Laser skanning mikros~~POS=TRUNC
for å undersøke celle-gjennomtrengende evne og den intracellulære fordeling av intern peptider, leve konfokalmikroskopi ble utført på tre kreftlinjer (HeLa, HCT116 og B16 /F10) og tre normale cellelinjer (HaCaT, BJ og NIH 3T3). I korthet ble celler (2 x 10
5) ble sådd ut på et glass dekkglass plassert i en 6-brønns plate, dyrket over natten, og deretter inkubert med FITC-merkede peptider (5 uM for hver cellelinje) i 30 min. Cellene ble deretter skylt tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4), og som er montert på objektglass med fluorescens monteringsløsning (Dako Corp., Carpinteria, CA). Colocalization av BR2 med lysosomer ble observert ved hjelp LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probe, Eugene, Oregon). For å unngå virkningene av feste gjenstander, som involverer både metanol og paraformaldehyd ble cellene ikke løst [26], [27]. Fordelingen av FITC-merkede peptider ble analysert ved hjelp av en konfokal laser-skanning Zeiss LSM 510 mikroskop (Jena, Tyskland) utstyrt med en 40 x og 20 x objektiv. Fluoroforer var begeistret med en argon laser (488 nm) for FITC og en HeNe laser (543 nm) for LysoTracker Red.
In vitro
Cvtotoksisitetsmålinq
cytotoksisitet av peptider til pattedyrceller ble undersøkt ved å vurdere utgivelsen av laktat dehydrogenase (LDH) fra kreft og normale celler. Mengden av LDH frigjøres fra skadede celler i supernatanten ble målt ved anvendelse av Cytotoksisitet Detection Kit (Roche Applied Science, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk ble celler sådd ut på 96-brønners mikroplater (1 x 10
4 celler per brønn) i komplett DMEM supplert med 10% FBS og inkubert over natten ved 37 ° C for å tillate festing og utspredning av celler. Etter 24 timer inkubering ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av peptider (0-100 uM) og inkubert i ytterligere 24 timer ved 37 ° C. Det ekstracellulære mediet fra hver brønn ble overført til en ny mikroplate og inkubert i 10 minutter med 100 ul /brønn reaksjonsblandingen, etterfulgt av en stoppløsning. Absorbans ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en ELISA-plateleser. LDH-frigjøring fra celler lysert med 0,2% Triton X-100 i PBS ble definert som 100% lekkasje og LDH-frigivelse fra ubehandlede celler som 0% lekkasje.
Hemolyse Assay
Hemolytisk aktivitet ble analysert som beskrevet av AboudY
et al
med små modifikasjoner [28].; 3 ml nylaget humane erytrocytter ble vasket med isoton PBS, pH 7,4, inntil fargen av supernatanten ble klar. De vaskede erytrocytter ble deretter fortynnet til et sluttvolum på 20 ml med den samme buffer. Peptid prøver (10 pl), seriefortynnet i PBS, ble tilsatt til 190 ul av cellesuspensjonen i mikrosentrifugerør. Etter forsiktig blanding ble rørene inkubert ved 37 ° C i 30 minutter og deretter sentrifugert ved 4000 x g i 5 min. Supernatanten (100 pl) ble fjernet til et nytt rør og absorbansen ved 567 nm ble bestemt. Den relative optiske tetthet, sammenlignet med den av cellesuspensjonen ble behandlet med 0,2% Triton X-100, ble definert som prosentandelen av hemolyse. Den hemolyse prosent ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: Prosent hemolyse = [(Abs
567 nm i peptidløsningen – Abs
567 nm i PBS) /(Abs
567 nm i 0,2% Triton X-100 – Abs
567 nm i PBS)] × 100
Karakterisering av Peptide opptak
for å evaluere internalisering av FITC-merkede peptider, ble HeLa-celler sådd ut på 12-brønners plater på. en tetthet på 2 x 10
5 celler pr brønn og inkubert i 24 timer. FITC-merkede peptider, ved forskjellige konsentrasjoner varierende fra 2 til 10 uM, ble så inkubert med cellene i 30 minutter ved 37 ° C. For å sammenligne cellulært opptak av peptider, kreft og normale celler ble behandlet med FITC-merkede peptider (hver, 10 mM) og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Etter inkubering ble cellene vasket tre ganger med iskald PBS for å fjerne overskudd ekstracellulære komplekser. Deretter ble cellene behandlet med trypsin (1 mg /ml) i 10 minutter for å fjerne eventuelle gjenværende peptider bundet til celleoverflaten. Etter trypsinering ble cellene oppsamlet ved sentrifugering (1000 x g i 5 min), resuspendert med 500 ul iskald 2% FBS /PBS inneholdende propidiumjodid (PI), og deretter umiddelbart analysert (10.000 hendelser /prøve) ved fluorescensaktivert celle sortering (FACS).
for å forstå ytterligere celle-gjennomtrengende mekanisme av peptider, effekten av temperatur og metabolske hemmere ble undersøkt. Til belysning av temperaturavhengigheten, ble HeLa-cellene inkubert ved 4 ° C i 30 minutter før tilsetningen av peptidene. Deretter ble cellene behandlet med FITC-merkede peptider (hver, 5 uM) ved 4 ° C i 30 minutter. For den energi uttømming studien ble HeLa-celler preinkubert med natriumazid (NaN
3, 10 mM) ved 37 ° C i 1 time og deretter inkubert med FITC-merkede peptider (hver, 5 um) ved 37 ° C i . 30 min
for å studere rollen til endocytose i peptid-opptaket ble cellene forbehandlet med flere endocytose-inhibitorer ved 37 ° C i 1 time: (i) amilorid (5 mM), noe som er kjent for å blokkere macropinocytosis etter inhibering av en natriumkanal; (Ii) nocodazol (100 ng /ml), som hemmer den clathrin-mediert reaksjonsvei; og (iii) metyl-ß-cyklodekstrin (MßCD, 5 mM), som hemmer lipid flåte-medierte prosesser ved å tappe kolesterol fra plasmamembranen [29]. Alle hemmere ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO).
For å undersøke effekten av negativt ladede komponenter på celleoverflaten for peptid intern ble HeLa-celler forbehandlet med gangliosider (monosialoganglioside GM3 fra hjørnetann blod), heparinsulfat, eller sialinsyre (Neu5Ac, alle fra Sigma) (20 ug /ml) i 30 min. For inhibering av gangliosid-biosyntesen, ble celler forbehandlet med D-
treo
-1-fenyl-2-heksadekanoyl amino-3-morfolino-1-propanol (PPMP, 5 uM) i 48 timer.
for alle disse eksperimentelle forhold, flowcytometri analyser ble utført med levende celler ved hjelp av en Becton Dickinson FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Diego, California). I hvert tilfelle ble fluorescensen på 10.000 levedyktige celler anskaffet. Levedyktige celler ble inngjerdet basert på en sideveis og fremover scatter. For dataanalyse, WinMDI programvare (Joe Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) ble brukt. Den statistiske signifikans ble evaluert av t-test med 95% konfidensintervall.
Kloning og ekspresjon av Peptide-fusjonsproteiner
For å ansette BR2 som et redskap for levering av terapeutiske proteiner, et cDNA av den Y13-259 enkeltkjede variabel-fragment (scFv) genet ble syntetisert ved Bioneer (Daejeon, Korea). De Tat- eller BR2-kondensert Y13-259 scFv-gener ble oppnådd ved rekombinant PCR. De rekombinante cDNA som koder for anti-Ras scFv, Tat-scFv og BR2-scFv fusjoner ble fordøyd med
Nco
jeg og
EcoRI
jeg (begge fra New England Biolabs, Beverly, MA), og klonet inn i
Nco
jeg og
EcoRI
i områder av pET21c, produsere pscFv, PTAT-scFv og pBR2-scFv, henholdsvis. Anti-Ras scFv, Tat-scFv og BR2-scFv fusjonsproteiner ble uttrykt i
E. coli
Origami (DE3) etter induksjon med 0,1 mM IPTG i 4 timer ved 37 ° C. Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 3000 x g i 15 min ved 4 ° C. Cellepelleten ble resuspendert i fosfatbuffer (10 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,4); Cellene ble ødelagt ved sonikering ved 4 ° C (B. Braun instrumenter, Allentown, Pennsylvania). Proteaseinhibitoren fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, 1 mM) ble tilsatt før ultralydbehandling. De oppløselige og uoppløselige fraksjoner ble separert ved sentrifugering ved 14 000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Pelleten inneholdende inklusjonslegemene ble resuspendert i vaskebuffer (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA og 1% Triton X-100, pH 8,0) og sentrifugert ved 8000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
De vaskede inklusjonslegemer ble denaturert og løst i lyseringsbuffer (0,3% N-lauroylsarkosin, CAPS 50 mM buffer, og 0,3 M NaCl, pH 11,0) i 3 timer og sentrifugert ved 14000 x g i 15 minutter ved 4 ° C . Alle proteiner ble affinitet-renset ved hjelp av Ni-IDA agarose harpiks (ELPIS biotech, Daejeon, Korea). I korte trekk, ble det Ni-IDA His-Bind harpiks pakket i en kolonne ekvilibrert med bindende buffer (identisk med lysis buffer). Supernatanten ble langsomt tilført til kolonnen, hvoretter vaskebuffer (0,3% N-lauroylsarkosin, 50 mM CAPS-buffer, 150 mM NaCl, og 30 mM imidazol, pH 11,0) ble påført. Proteinene ble eluert med elueringsbuffer (0,3% N-lauroylsarkosin, CAPS-buffer 50 mM, 150 mM NaCl og 250 mM imidazol, pH 11,0) og analysert ved 10% SDS-PAGE. De eluerte proteiner ble refoldet ved dialyse i PBS inneholdende 200 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM GSH, 0,2 mM GSSG og 0,4 M arginin med gradvis reduksjon pH (pH 10, pH 9, pH 8 og pH 7,4). Hver dialyse trinn ble utført ved 4 ° C i 12 timer mot 20 × prøvevolum for å fjerne vaskemiddel helt.
Western blotting
For å overvåke peptid-mediert intracellulære opptaket av scFv proteiner, den internaliserte fusjonsproteiner ble undersøkt ved Western blotting. HCT116-celler (1 x 10
6) ble behandlet med PBS, renset scFv, Tat-scFv, eller BR2-scFv-fusjonsproteiner (hver, 2 mM) i 2 timer ved 37 ° C. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS (4 ° C), skrapet inn i 0,5 ml PBS og sentrifugert ved 1000 x g ved 4 ° C i 5 minutter. Cellepelletene ble resuspendert i 100 ul lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na
2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM beta -glycerophosphate, 1 mM Na
3VO
4, 1 ug /ml leupeptin og 1 mM PMSF (Cell Signaling Tech., Danvers, MA) og holdt på is i 30 minutter. celle~~POS=TRUNC ble deretter sentrifugert ved 12 000 x g ved 4 ° C i 15 minutter og supernatantene ble samlet. protein~~POS=TRUNC konsentrasjoner~~POS=HEADCOMP i celleekstrakter ble bestemt ved Bradford-metoden [30] (Bio-Rad, Hercules, CA). 50 pg av protein fra celle-ekstrakter ble fraksjonert på en 10% SDS-PAGE-gel. etter elektroforese, proteiner ble overført på en nitrocellulosemembran i overføringsbuffer (192 mM glycin, 25 mM Tris-HCl, pH 8,8, og 20% metanol [vol /vol]) ved elektroblotting. etter blokkering med 5% skummet melk i 1 time, ble membranen inkubert med en 1:1,000-fortynnet anti-His primære antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ble vasket tre ganger med TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, og 0,5% Tween-20), og deretter inkubert med et peroksydase-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) i melk inneholdende TTBS i 1 time. Etter endelig vasking, ble membranen så eksponert og proteinbånd ble påvist ved hjelp av Enhanced Chemiluminescence (WESTSAVE GOLD, AbFrontier, Seoul, Korea).
Cell Proliferation Analyser (MTT-analyse)
For å vurdere anti-proliferativ aktivitet av peptider og anti-Ras scFv-fusjonsproteiner, HCT116-celler (K-ras-muterte celler) ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 2 x 10
4 celler /brønn i 100 ul DMEM supplert med 10% FBS og dyrket i 24 timer ved 37 ° C. Etter 24 timer inkubering ble cellene behandlet med scFv eller peptid-scFv-fusjonsproteiner (0, 0,5, 1 og 2 uM) og inkubert i ytterligere 24 timer. Cellelevedyktigheten ble målt med 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse ved hjelp av CellTiter 96® ikke-radioaktiv celle proliferasjonsanalyse kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbansen av oppløsningen ble målt ved 570 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Rad). Cellelevedyktigheten ble uttrykt som prosent av levedyktige celler behandlet med scFv eller peptid-scFv-fusjonsproteiner sammenlignet med PBS-behandlet kontrollgruppe (100%). Alle forsøk ble utført in triplo.
Påvisning av apoptose
HCT116-celler (1 x 10
6 /brønn i en 6-brønns plate) ble behandlet med peptid-kondensert scFv (hvert , 2 uM), eller en kjent induser apoptose staurosporin (0,5 pM) i 24 timer ved 37 ° C og celleekstrakter ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Spaltes poly (ADP ribose) polymerase (PARP), en indikator på apoptose, ble påvist ved Western-blotting som beskrevet ovenfor. Anti-PARP og anti-α-tubulin antistoff (Cell Signaling Tech.) Ble anvendt ved en fortynning 1:1,000 som de primære antistoffer, mens pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) ble brukt ved en . 1:10,000 fortynning som det sekundære antistoff
i tillegg ble apoptotiske celler identifisert ved farging med annexin V-FITC (150 ng /ml) og 7-amino actinomycin D (7-AAD, BD Biosciences, San Diego, CA). 1 x 10
6 HCT116-celler behandlet med PBS, staurosporin (0,5 uM), eller peptid-kondensert scFv (hver, 2 uM) som beskrevet ovenfor. På det angitte tidspunkt ble cellene vasket to ganger med PBS (pH 7,4), høstes og resuspenderes i 500 ul bindingsbuffer supplert med Annexin V-fluos (1:100 fortynnet, BioBud, Seoul, Korea), og inkubert i 15 minutter ved 25 ° C i mørket. For å oppdage nekrose, ble 7AAD tilsatt før måling. Prøvene ble umiddelbart utsatt for FACS analyse med en FACSCalibur flowcytometer (FL1 og FL3) og WinMDI programvare (Joe Trotter, Scripps Research Institute). 1 × 10
4 celler per prøve ble analysert ved flowcytometri.
Ras Aktivering analysen
For å studere peptid-scFv fusjonsprotein avhengig undertrykkelse av Ras aktivitet, nivået av Ras -GTP (aktiv form) ble målt ved hjelp av en Ras aktiveringstest kit (Millipore, Billecia, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. Denne metoden er basert på en selektiv binding av Ras-GTP hjelp av Ras bindingsdomene (RBD) av Raf-1 (en kinase nedstrøms for Ras) som ikke klarer å binde Ras-BNP (inaktiv form). I korthet ble 50 ul av RBD protein kondensert til glutation transferase (GST) ble belagt på en 96-brønners glutation-belagt plate ved 4 ° C i 1 time og vasket med TBST (50 mM Tris, 150 mM NaCl og 0,05% Tween -20, pH 7,6). HCT116-celler behandlet med scFv, Tat-scFv, eller BR2-scFv for 1 eller 2 timer, hvoretter cellene ble lysert ved bruk av 1 x Mg
2 + Lysis /vaskebuffer (Millipore). Proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved hjelp av Bradford-analysen. Cellelysater inneholdende 50 ug protein ble inkubert i 1 time i RBD-GST-belagte brønner ved 25 ° C. Etter vasking tre ganger med TBST, ble primært antistoff-løsning tilsatt og inkubert ved 4 ° C i 1 time. Etter vasking med TBST, ble den sekundære HRP-konjugert anti-mus-antistoff tilsatt og inkubert ved 25 ° C i 1 time. Etter en siste vasking med TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6), ble 50 ul av den kjemiluminescerende substrater tilsatt til hver brønn. Chemiluminescence signaler fra hver brønn ble overvåket ved hjelp av Berthold luminometer (MicroLumat LB96P, Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Resultatene ble uttrykt som relativ Ras aktivitet.
Resultater
BR2 internalizes effektivt i ulike kreftcellelinjer uten Cytotoksisitet til normale celler
cellulært opptak og intracellulær fordeling av de utformede peptider , BR1 og BR2, ble undersøkt ved hjelp av konfokal mikroskopi. BR2 ble lett internalisert inn i kreftceller (HeLa, HCT116 og B16 /F10) i løpet av 30 min og distribuert gjennom cytoplasma og kjernen av kreftceller (Fig. 1a). Men det var veldig dårlig internalisert inn i normale celler (HaCaT, BJ og NIH 3T3) under de samme forsøksbetingelser. I motsetning til dette, BR1 viste ubetydelig cellulært opptak nivåer i både kreft og normale celler, noe som indikerer at det ikke kunne translocate gjennom cellemembranen (Fig. 1A). Fluorescens fra Tat-behandlede celler ble også klart påvist i både kjernen og cytoplasmaet av kreft og normale celler. Flere Tat akkumulert i kjernen enn cytoplasma, mens de fleste BR2 ble jevnt fordelt i de intracellulære regioner (fig. 1A).
(A) Intracellulær fordeling av FITC-merkede peptider undersøkt ved konfokal lasermikroskopi. Begge kreftceller (HeLa, HCT116 og B16 /F10) og normale celler (HaCaT, BJ og NIH 3T3) ble sådd i 6-brønners plater 1 dag før eksperimentet for å nå 70% samløpet. Celler ble inkubert med FITC-merkede peptider (5 uM) i 30 minutter ved 37 ° C og vasket tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS). Peptid fordeling ble deretter analysert ved hjelp av et konfokalt scanning LSM 510 laser mikroskop utstyrt med et 40 x objektiv. (B, C)
In vitro cytotoksisitet
av peptider. (B) Membran forstyrrelse ble målt ved hjelp av laktatdehydrogenase (LDH) lekkasje fra de angitte cellelinjer 24 timer etter behandling peptid. LDH lekkasje fra celler utsådd i en 96-brønn plate med 10.000 celler /brønn ble målt etter eksponering for 1, 2, 5, 10, 20, 50 eller 100 uM peptider i 24 timer. LDH-frigivelse fra PBS-behandlede celler ble ansett som 0% lekkasje og LDH frigjøres fra 0,2% Triton X-100-behandlede celler som 100% lekkasje. (C) Den hemolytiske aktivitet av hvert peptid mot humane erytrocytter ble analysert ved graderte konsentrasjoner (0-200 uM) og sammenlignet med en 0,2% Triton X-100 positiv kontroll, hvor hemolyse ble definert som 100%. Feil barer i alle tallene representerer standardfeil av midlene (n = 3).
For å vurdere
in vitro
cytotoksisitet av de utformede peptider, LDH lekkasje ble målt i kreft cellelinjer (HeLa, HCT116 og B16 /F10) og normale cellelinjer (HaCaT, BJ og NIH 3T3). BR2 behandling (20-100 uM) ble forbundet med LDH lekkasje fra kreftceller; lekkasjen gradvis økt med BR2 konsentrasjoner, og nådde omtrent 40-60% ved 100 uM (fig. 1B
a-c
). Imidlertid LDH lekkasje fra BR2-behandlede normale celler ble ikke påvist ved BR2 konsentrasjoner under 70 um, og en svak lekkasje (~17%) ble observert ved 100 uM (fig. 1B
d-f
). BR3 induserte betydelig LDH lekkasje fra både kreft (ca. 80-90%) og normale cellelinjer (ca. 30%), selv ved 50 uM (fig. 1B
a-f
).
for å undersøke cytotoksisiteten av peptider ytterligere, ble det hemolytiske aktivitet av BR1, BR2, BR3 og Tat mot humane erytrocytter også undersøkt. I samsvar med LDH lekkasjeresultatene, ble det ikke hemolyse indusert selv etter at erytrocyttene ble behandlet med Tat, BR1 og BR2 på ≥200 uM, mens BR3 utløst hemolyse (≥5%) ved ≥ 25 uM (fig. 1C). Deretter ble omtrent 34,3% av erytrocyttene ble lysert etter å ha blitt behandlet med 200 pM BR3. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at BR2 effektivt penetrerer kreftceller uten cytotoksiske effekter i normale celler, mens Tat viste lignende inntrengning i begge celletyper.
BR2 Spesielt Penetrerer kreftceller i en konsentrasjonsavhengig måte
å sammenligne mengden av internalisert peptider i ulike celletyper, utførte vi flowcytometrisk analyse. BR2 ble internalisert mer effektivt inn i kreftceller (HeLa, HCT116 og B16 /F10) enn i normale celler (HaCaT, BJ og NIH 3T3); mer enn 95% av BR2-behandlede kreftceller internaliseres BR2, mens bare 23-34% av BR2-behandlede normale celler gjorde. Imidlertid Tat penetrert både kreft og normale celler uten mye diskriminering (fig. 2A). Spesifikk penetrering av BR2 og Tat til kreftceller ble også analysert i nærvær av både HeLa og BJ fibroblast celler ved konfokal lasermikroskopi. BR2 ble fortrinnsvis uptaken av HeLa-celler, mens cellulært opptak av Tat var lik i begge HeLa og BJ fibroblast celler (fig. S1). Disse resultatene viser klart at buforin-derivatet BR2 har kreftcelle spesifisitet, mens Tat ikke gjør det.
(A) Analyse av celle-gjennomtrengende effektiviteten av hvert peptid i forskjellige celletyper ved strømningscytometri. FITC-merket Tat, BR1 og BR2 peptider (10 uM) ble tilsatt til forskjellige celletyper: HeLa, HCT116 og B16 /F10 kreftceller og HaCaT, BJ og NIH 3T3 normale celler. Etter 30 min inkubasjon ved 37 ° C, ble FITC-positive celler tellet ved flowcytometri. Verdier representerer prosentandelen av fluorescens-positive celler i total cellepopulasjon. (B) Kvantitativ vurdering av cellegjennomtrengning av hvert peptid ved strømningscytometri. HeLa-cellene ble inkubert med FITC-merkede peptider i konsentrasjoner på 1, 2, 5 eller 10 mM i 30 min ved 37 ° C. Deretter ble cellene vasket med kald PBS og høstet og cellulær fluorescens ble analysert ved flow-cytometri. Kontrollceller fikk ikke peptid behandling. Før analyse ble ekstracellulære fluorescens av overflate bundet peptider fjernet ved en trypsin-behandling (1 mg /ml i 10 minutter).
Fluorescensintensiteten av peptid-behandlede celler ble forbedret med økende konsentrasjoner av BR2 eller Tat. Ved konsentrasjoner over 5 uM, BR2 angitt mer enn 80% av HeLa-celler i løpet av 30 minutter (Fig. 2B). BR2 penetrert celler mer effektivt enn gjorde Tat peptidet ved hver testet konsentrasjon. Videre BR2 internalisering for alle kreftcellelinjer (HCT116 og B16 /F10, data ikke vist) viste seg å være homogent i hele cellepopulasjonen som en enkelt topp på histogrammet. Blant de peptider, vises BR1 den laveste opptak, noe som indikerer dens manglende evne til å trenge gjennom cellemembranen selv på 10 mikrometer.
Første Elektro Interaksjon med positivt ladede BR2 og negativt ladet Gangliosider på Kreft cellemembranen er avgjørende for energi -avhengig Endocytose av BR2
cellulært opptak mekanismen for BR2 ble analysert med HeLa, den mest representative og brukte kreftcellelinje, for å sammenligne med de andre cellepenetrerende peptider. Vi først undersøkt effekten av temperaturen på BR2 penetrasjon. Senke temperaturen dramatisk redusert peptid opptak i HeLa-celler (figur 3A.); det cellulære opptak av BR2 og Tat ved 4 ° C ble redusert med 88,5% og 31,6%, respektivt, sammenlignet med det som ble observert ved 37 ° C. I tillegg ble en energiavhengig opptak av peptider også observert når det cellulære ATP bassenget var oppbrukt av preinkubasjon av cellene med natriumazid (NaN
3). ATP uttømming også redusert opptak av BR2 og Tat i HeLa-celler, med 67,7% og 42,5%, henholdsvis (fig. 3A). Disse resultatene støtter involvering av endocytose for BR2 og Tat opptak.
(A) Effekter av lav temperatur og energi uttømming på internalisering av FITC-merket peptider i HeLa-celler. HeLa-celler ble enten preinkubert ved 4 ° C eller forbehandlet med natriumazid (NaN
3) for å utarme ATP i 1 time, og deretter inkubert med 5 uM Tat eller BR2 i 30 minutter under de samme betingelser, som beskrevet i Materialer og metoder. Peptid opptak ble bestemt ved flow-cytometri. (B) Effekten av endocytiske inhibitorer for oppføring av BR2 og Tat. Påvirkningen av inhibitoriske medikamenter på peptid-opptak ble bestemt ved preinkubasjon av HeLa-celler med endocytose inhibitorer nocodazol, amilorid eller metyl-P-cyklodekstrin i 1 time før tilsetning av FITC-merkede peptider. Etter peptid behandling i 30 min ved 37 ° C, ble FITC-positive celler tellet ved flowcytometri. Verdier representerer prosentandelen av fluorescens-positive celler i total cellepopulasjon. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. (C) colocalization av BR2 med lysosomal markør LysoTracker rød DND-99 i levende HeLa-celler. Etter 30 min inkubasjon av BR2 (5 mm) med LysoTracker, ble levende HeLa celle bilder fås ved konfokalmikroskopi. (D) Virkninger av negativt ladede molekyler (gangliosider, hepariner, og sialinsyrer) på peptid-opptak. (A, b) HeLa-celler ble behandlet med BR2 og Tat i nærvær av gangliosider, hepariner, eller sialinsyrer (hver, 20 ug /ml) i 30 min. I (c, d), ble HeLa-celler forbehandlet med PPMP (5 uM) for å utarme gangliosider. Cellulært opptak av BR2 og Tat ble bestemt ved flow-cytometri. Som vist på fig. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse.
