Abstract
overexpressed CEACAM6 i tumorvev spiller viktige roller i invasjonen, metastaser og anoikis motstand i en rekke humane kreftformer. Vi har nylig rapportert at CEACAM6 uttrykk er oppregulert i Magekreft (GC) vev og fremmet GC metastasering. Her rapporterer vi at CEACAM6 fremmer peritoneal metastaser
i
vivo Hotell og er negativt korrelert med E-cadherin uttrykk i GC vev. Overexpressed CEACAM6 indusert epitelial-mesenchymale overgang (EMT) i GC, målt ved økning i EMT markører N-cadherin, vimentin og Slug mens E-cadherin uttrykk ble redusert i CEACAM6-overekspresjon GC-celler; motstridende resultater ble observert i CEACAM6-forstummet celler. Videre E-cadherin ekspresjon var negativt korrelert med dybden av tumorinvasjon, lymfeknutemetastase og TNM stadium i GC vev. I tillegg kan CEACAM6 forhøyede matriks-metalloproteinase-9 (MMP-9) aktivitet i GC, og anti-MMP-9-antistoffet reversere økende invasjon og migrering indusert av CEACAM6. CEACAM6 også økte nivået av fosforylert AKT, som er involvert i utviklingen av en rekke humane tumorer. Vi videre observert at LY294002, en PI3K inhibitor, kunne reversere CEACAM6-indusert EMT via mesenchymale-epitel overgang. Disse funnene tyder på at CEACAM6 forbedrer invasjon og metastasering i GC ved å fremme EMT via PI3K /AKT signalveien
Citation. Zang M, Zhang B, Zhang Y, Li J, Su L, Zhu Z, et al . (2014) CEACAM6 Fremmer Gastric Cancer Invasion og metastasering ved å fremkalle Epitelial-Mesenchymale Transition via PI3K /AKT signalveien. PLoS ONE 9 (11): e112908. doi: 10,1371 /journal.pone.0112908
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 7 august 2014; Godkjent: 16 oktober 2014; Publisert: 14.11.2014
Copyright: © 2014 Zang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation of China (No. 81172324, nr 91229106, nr 81272749, og nr 81372231) National, og Key prosjekt Shanghai Education Committee (No. 12ZZ105 og No.12ZZ102) og Science and Technology Commission av Shanghai kommune (No. 13ZR1425600). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
GC er en av de vanligste ondartede svulster og en stor helsemessig problem over hele verden, spesielt i Øst-asiatiske land som Japan, Korea, Kina, hvor det er den andre årsaken til kreft-dødsfall [1] – [3]. Carcinoembryonic antigen-relaterte celleadhesjonsmolekyl 6 (CEACAM6) er en glykosylfosfatidylinositol (GPI) -koblet immunoglobulin-superfamilien medlem som er overuttrykt i mange humane cancere, spesielt gastrointestinal-kreft [4], og fungerer som et intercellulært adhesjonsmolekyl [4] – [6]. Selv om CEACAM6 er et GPI-forankret celleoverflateglykoprotein det mangler en transmembran eller intracellulær domene, men er i stand til å påvirke intracellulære signaleringshendelser og spiller en viktig rolle i progresjon gastrointestinal kreft [4], [6] – [8]. GPI-forankrede molekyler blir ofte co-lokalisert til små membranmikroområder i plasmamembranen [9], som kan aktivere nedstrømssignalkaskader som integrinsignalveien [10]. CEACAM6 fungerer som et onkogen i tumorer og fremmer kreft invasjon, metastase, anoikis motstand og chemoresistance, og inhiberer differensiering [7], [8], [11]. Vi har nylig rapportert at CEACAM6 uttrykk er oppregulert og forbundet med lymfeknutemetastase i GC vev [12]. Imidlertid er mekanismene gjennom hvilke CEACAM6 påvirkninger intracellulær signaloverføring i GC gjenstår å bli bestemt.
Epithelial-mesenchymale overgang (EMT) er ikke bare en fysiologisk prosess under embryonal utvikling eller regenerering av vev, men også en patologisk element i progresjon av kreft, som involverer tumormetastase, apoptose og begynnende alderdom motstand [13] – [15]. EMT indikerer alltid en dårlig klinisk prognose i kreft hos mennesker. En rekke mekanismer som er relevante for EMT initiering er blitt dokumentert, inkludert TGF-β, IL-6, PI3K /AKT, RAF /MAPK, og SRC trasé [15] – [18]. I vår forrige undersøkelse, observerte vi CEACAM6-indusert SRC aktivering i GC-celler [12], og observert økt antall spindel-formet CEACAM6-overekspresjon celler sammenlignet med kontrollceller. Derfor var vi veldig interessert i å bestemme forholdet mellom CEACAM6 og EMT i GC-celler. Selv negativ korrelasjon mellom CEACAM6 og EMT har blitt registrert i bukspyttkjertelen karsinom [19], mekanismer som CEACAM6 regulerer EMT er dårlig forstått.
I denne studien har vi ytterligere undersøkte effekten og potensielle veier av CEACAM6 i GC invasjon og metastasering, og undersøkt dens korrelasjon med EMT.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Skriftlig informert samtykke i studien er hentet fra alle deltakerne. Studien protokollen ble godkjent av etisk komité for Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Animal prosedyrer ble utført i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina.
Cellelinjer og prøver vev
Den menneskelige GC cellelinjer SGC-7901, MKN-45 og MKN-28 ble kjøpt fra Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. Celler ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2 og metning fuktighet i RPMI-1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum.
Gastrisk tumor og tilstøtende ikke-tumor vev ble oppnådd fra 93 pasienter med GC som gjennomgikk kurativ kirurgi ved Shanghai Jiaotong University School of Medicine Affiliated Ruijin Hospital fra 2010 til 2013. pasientene besto av 69 menn og 24 kvinner med en gjennomsnittsalder på 62,1 år (fra 30-85 år). Ingen av pasientene hadde fått strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. Clinicopathological data ble samlet inn og patologisk tumor iscenesettelse ble bestemt i henhold til UICC TNM klassifisering. Histologisk typing ble utført av minst to dyktige patologer som arbeider selvstendig i en dobbel-blindet mote. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Shanghai Ruijin Hospital, og alle pasientene ble fullt informert om eksperimentelle prosedyrer.
Vector konstruksjon og transfeksjon
Full-lengde CEACAM6 cDNA ble oppnådd ved RT- PCR fra total RNA hentet fra GC prøver. Primersekvensene var 5′-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 «(fremover) og 5′-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3» (bakover). Vi satt sammen en pIRES2-EGFP-CEACAM6 konstruere ved å sette CEACAM6 cDNA inn pIRES2-EGFP vektor. Vi neste transfektert pIRES2-EGFP-CEACAM6 eller pIRES2-EGFP vektor i SGC-7901 og MKN-45 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) i henhold til produsentens protokoll. Stabile kloner ble valgt ved kontinuerlig behandling med G418 (1,2 mg /ml, Gibco, New York, USA)
Lentiviral vektor konstruksjon
Basert på kliniske CEACAM6 genet data, et par oligonukleotid-sekvenser. og negative kontrollsekvenser ble utformet og syntetisert av Shanghai Novobio Scientific Co, Ltd shRNA sekvenser var som følger: CEACAM6, 5′-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 «(fremover), og 5′-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3′ (bakover); kontroll, 5»-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 «(fremover), og 5′-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3» (bakover). CEACAM6 shRNA ble subklonet inn i PL /shRNA /F lentiviral vektor for å få en PL /shRNA /SHR-CEACAM6 konstruere. Deretter PL /shRNA /SHR-CEACAM6 eller kontrollere lentiviral vektorer ble transfektert inn MKN-28 GC-celler. Stabilt transfekterte celler ble valgt ved behandling med 5 mg /ml blasticidin og ble brukt for identifisering og videre forskning.
Western blotting
Celler ble høstet og lysert ved hjelp av RIPA buffer (Solarbio, Beijing, Kina ) inneholdende 1% PMSF proteaseinhibitorer. En BCA analysesett (Pierce, Rockford, USA) ble anvendt for å måle det totale proteinkonsentrasjonen. Ekvivalente mengder av protein ble separert ved 10% SDS-PAGE, og de oppløste proteinene overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert med 5% skummet melk i 2 timer og deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Primære antistoffer var som følger: CEACAM6 (1:500; Abcam, USA), E-cadherin (1:500, Cell Signaling Technology (CST), USA), N-cadherin (1:500, CST, USA), vimentin ( 1:1000; CST, USA), Slug (1:500; CST, USA), p-AKT (Ser473) (1:1000; CST, USA), total AKT (1:1000; CST, USA) og GAPDH ( 1:10000; Abcam, USA). Membranene ble deretter inkubert med sekundært antistoff i 2 timer ved romtemperatur og ble visualisert ved hjelp av et forbedret kjemiluminescens påvisningssystem (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) i henhold til produsentens protokoll.
Immunofluorescent farging
Cellene ble dyrket på dekkglass i 24 timer og deretter fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 min. Cellene ble vasket med PBS, deretter permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i 20 minutter og blokkert med 5% BSA i 30 minutter ved romtemperatur. Vi neste farget cellene med CEACAM6 antistoff (1:50; Abcam) ved 37 ° C i 2 timer, etterfulgt av inkubering med fluorescerende sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Kjernene ble farget med DAPI. Rhodamine phalloidin antistoff (1:150; Cytoskjelett) ble anvendt for å visualisere cytoskjelettet av GC-celler. Slides ble analysert og avbildes på en fluorescens mikroskop.
Immunohistochemistry
Deler av 4 mikrometer tykt ble kuttet fra parafininnstøpte vevsblokker og deretter deparaffinized og vannes ut. Immunhistokjemisk farging av delene ble utført i henhold til protokollen DAKO, ved bruk av mus anti-CEACAM6 (1:100; Abcam) og E-cadherin (1:100; CST) ved 4 ° C over natten. Platene ble deretter inkubert med HRP-merket sekundært antistoff og visualisert ved diaminobenzidin. To patologer som var blindet for noen pasientdata uavhengig evaluert og scoret seksjonene. Immunhistokjemi flekken poengsum = positiv celle poengsum + fargeintensitet poengsum. Prosentandelen av positive celler ble bedømt som følger: 0 (10%), en (10-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) og 4 ( 75%). Immunhistokjemisk fargingsintensiteten ble gradert som følger: 0 (ingen farging), 1 (svak farging), 2 (brun farging), og 3 (mørkebrun farging). Totalt score til ≥3 ble definert som positivt å forenkle dataanalyse. For å analysere sammenhengen mellom CEACAM6 og E-cadherin uttrykk, bilde-Pro Plus versjon 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) ble brukt til å kvantifisere uttrykk for CEACAM6 og E-cadherin på 20 prøver.
gelatin zymografi
For å undersøke MMP-9 aktivitet, ble zymografi utført ved hjelp av 10% SDS-PAGE-geler som inneholder 1 mg /ml gelatin (Sigma). I korthet, GC-celler ble dyrket i serumfritt RPMI-1640-medium i 24 timer, og supernatanten ble deretter samlet opp og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min. Gelene ble vasket to ganger i renatureringsbuffer (2,5% Triton X-100) i 30 minutter hver gang for å fjerne SDS etter elektroforese, og deretter inkubert ved 37 ° C i 24 timer i en reaksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl). Vi neste farget gelene med 0,5% Coomassie brilliant blue R-250 i 2 timer og avfarget gelene i buffer (30% metanol, 10% eddiksyre). Klare gjennomsiktig band i bakgrunnen av blå flekker representerte gelatinase aktiviteter.
Cell migrasjon og invasjon analyser
For celle migrasjon og invasjon analyser, totalt 1 x 10
5 celler suspendert i serumfritt RPMI-1640 med eller uten MMP-9-antistoffet (Abcam, 2 ug /200 ul) og sådd ut i Transwell kamre (8 mikrometer til 24-brønns plate, Corning Costar, NY, USA) med eller uten Matrigel ( BD Bioscience, CA, USA) i henhold til produsentens protokoller. For begge analyser, ble medium inneholdende 10% FBS tilsatt til det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter 24 timers kultur ble cellene fiksert med 10% formalin og farget med 0,5% krystallfiolett. Til slutt ble cellene i det nedre kammeret fotografert og telles ved invertert mikroskopi.
Nude mus xenograft modell
Fire uker gamle BALB /c naken mus (Institute of Zoology, Kina Academy of Sciences) ble brukt for å vurdere rollen til CEACAM6 i peritoneal spre
i
vivo
. Nakne mus ble plassert på et bestemt patogen-fritt miljø i Animal Laboratory Unit, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kina. Mus fikk human omsorg og studieprotokoller ble utført i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina. Totalt 2 × 10
6 SGC-7901-CEACAM6 eller SGC-7901-NC celler ble injisert i fem mus bukhulen i hver gruppe (randomisering). Musene ble avlivet på den 30. dagen etter injeksjon, og mage massene ble fotografert og fotografert. Alle forsøkene ble utført i samsvar med de offisielle anbefalingene fra den kinesiske dyresamfunn.
statistikker
Student
t
-test ble brukt for å undersøke statistiske forskjeller mellom de to gruppene . Sammenhenger mellom E-cadherin uttrykk i GC vev og clinicopathological parametere og CEACAM6 uttrykk ble analysert ved chi-square eller Fishers eksakte tester eller Pearson korrelasjonskoeffisient analyse. Data er vist som gjennomsnitt ± SD.
P
0,05 og
P
. 0,01 ble ansett som statistisk signifikant og stor betydning, henholdsvis
Resultater
CEACAM6 påvirker celle morfologi og cytoskjelettet
Våre tidligere resultater antydet at MKN-28 GC-celler iboende uttrykker høye nivåer av CEACAM6, mens SGC-7901 og MKN-45 GC-celler uttrykker lave nivåer [12]. Overekspresjon av CEACAM6 i SGC-7901 og MKN-45 GC-celler og demping av CEACAM6 uttrykk i MKN-28 GC-celler ved PL /shRNA /SHR-CEACAM6 lentiviral vektorer ble bekreftet på proteinnivået ved western blot analyse (Fig. 1a). Immunfluorescens analyser alltid viste at SGC-7901-CEACAM6 cellene uttrykte mer CEACAM6 protein enn SGC-7901-NC celler (Fig. 1B).
(A) Stabil overekspresjon og undertrykkelse av CEACAM6 i GC-celler. (B) CEACAM6-ekspresjon ble analysert ved hjelp av immunofluorescens, og mer CEACAM6 ekspresjon ble påvist i CEACAM6-overuttrykkende celler enn den i kontrollcellene (200 x). Blå: DAPI; red: CEACAM6. (C) Overuttrykte CEACAM6 i SGC-7901 og MKN-45 celler indusert en mesenchymale morfologi, mens knockdown av CEACAM6 i MKN-28 celler indusert en epitelial morfologi (200 ×). (D) Farging av F-aktin i CEACAM6-overekspresjon celler og kontrollceller (400 ×). Red: F-aktin; blå. DAPI
Interessant, celle morfologi ble endret ved CEACAM6 demping og overekspresjon. Sammenlignet med kontrollcellene, SGC-7901-CEACAM6 og MKN-45-CEACAM6 celler viste en mer mesenchymale-lignende morfologi, og var spindle- og fusiforme-formet (fig. 1C). Omvendt, ble typisk overgang fra mesenchymale til epitel morfologi påvist i MKN-28-SH-celler sammenlignet med MKN-28-nc-celler (fig. 1C). Det var imidlertid uklart om CEACAM6 overekspresjon hadde en effekt på cytoskjelettet, således immunofluorescerende farging av F-aktin-farging ble utført. Interessant nok var større størrelse fusiform-formede celler observert for MKN-45-CEACAM6 og SGC-7901-CEACAM6 linjer sammenlignet med kontrollcellene (fig. 1 D).
CEACAM6 er negativt forbundet med E-cadherin i GC vev
Immunhistokjemisk analyse ble anvendt for å bestemme nivået av E-cadherin ekspresjon i kreftvev og parvise tilstøtende ikke-tumorvevet. Immunhistokjemisk farging viste E-cadherin ekspresjon var lavere i tumorvev enn det i tilgrensende ikke-tumorøse vev, og avslørte at E-cadherin er hovedsakelig lokalisert i den cytomembrane av epitelceller (fig. 2D, E, F). Deretter undersøkte vi sammenhengen mellom E-cadherin uttrykk og clinicopathological funksjoner i GC, og funnet ut at downregulated E-cadherin var assosiert med dybde på invasjon (
P
= 0,046), lymfeknutemetastase (
P
= 0,013), og TNM stadium (
P
= 0,035), men ikke med andre clinicopathological faktorer, inkludert kjønn, alder eller differensiering (tabell 1). I tillegg CEACAM6 var negativt korrelert med EMT i bukspyttkjertelen karsinom [19] og CEACAM6 undertrykkelse kan øke E-cadherin promoter aktivitet i kolorektal kreft [20].
(A) Negativ CEACAM6 uttrykk i ikke-tumor mageslimhinnen. (B, C) Positiv eller negativ CEACAM6 ekspresjon i GC prøver. (D) Sterk positiv E-cadherin ekspresjon i ikke-tumor gastrisk mucosa. (E, F) negativ eller positiv E-cadherin ekspresjon i GC prøver. (G) Negativ sammenheng mellom CEACAM6 og E-cadherin uttrykk ble påvist i GC vev (R = -0,636,
P
0,01). (200 ×)
Videre undersøkte vi sammenhengen mellom E-cadherin og CEACAM6 uttrykk i GCer etter serie seksjon immunhistokjemi (20 prøver). CEACAM6 uttrykk i tumorvev var høyere enn i matchet ikke-tumor vev (Fig. 2A, B, C), i samsvar med våre tidligere resultater [12]. Interessant, fant vi ut at CEACAM6 uttrykket er negativt korrelert med E-cadherin uttrykk i GC vev ved Pearson korrelasjonskoeffisient analyse (
P
0,01; Fig. 2G).
CEACAM6 induserer EMT i GC celler
EMT-relaterte proteiner i GC-celler ble evaluert av western blot analyse. Vi har observert at N-cadherin, vimentin og Slug proteinnivåer ble øket, mens E-cadherin ble redusert i CEACAM6-overuttrykkende celler i forhold til deres respektive kontrollceller (Fig. 3A, B). Converse resultater ble oppnådd etter CEACAM6 ble slått ned i MKN-28 celler (Fig. 3 C, D). Resultatene antydet en funksjonell rolle for CEACAM6 i regulering av EMT i GC-celler. Videre disse observasjoner i GC cellene var lik med funnene i GC vev.
(A, C) Protein nivåer av EMT markører ble analysert ved western blot analyse i GC celler med CEACAM6 overekspresjon eller knockdown. (B, D) Relativ EMT markør uttrykk i CEACAM6-overekspresjon og -silenced GC celler ble beregnet ved grå skala ratio. Resultatene er gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk i søylediagrammer. *
P
0,05, **
P
. 0,01
CEACAM6 hever aktiviteten av MMP-9 i GC celler
Det er vel kjent at adhesjon, fornedrelse og migrasjon er store problemer i kreft metastasering. Gelatin zymografi ble utført for å undersøke effekten av CEACAM6 på aktiviteten til MMP-9, noe som er viktig i ECM-degradering. MMP-9 aktivitet i SGC-7901-CEACAM6 og MKN-45-CEACAM6-celler ble øket sammenlignet med deres kontrollgrupper (fig. 4A, B). Vi neste undersøkt om den økte aktiviteten til MMP-9 indusert ved CEACAM6 i GC-celler resulterte i en sann økning i antall invaderende og migrerende celler. Vi undersøkte derfor bidraget av aktive anti-MMP-9-antistoffet eller PBS for å CEACAM6-overuttrykkende GC-celler. Som forventet var det signifikante forskjeller i antall invaderende og trekkende celler i antistoff-behandlede celler sammenlignet med PBS-behandlede celler (
P
0,01; Fig. 4C, D, E, F).
(A) supernatanten av GC-celler ble samlet opp etter 24 timer. Deretter MMP-9 aktivitet ble undersøkt ved hjelp av gelatin zymografi. (B) Relative MMP-9-ekspresjon i GC-celler. (C, E) Transwell assay. Bildene viser celler som hadde reist gjennom Micropore membran med eller uten matrigel (200 ×). (D, F) Histograms viste antallet trekkende celler og invadere celler. Resultatene er gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk i søylediagrammer. *
P
0,05, **
P
. 0,01
CEACAM6 oppregulerer fosforylert AKT i GC celler
Vi har tidligere observert at SRC aktivitet ble indusert ved CEACAM6 i SGC-7901 GC celler. AKT er en nedstrøms protein av SRC og dramatisk forbundet med EMT, invasjon og metastasering i tumor progresjon. Vi vurderte derfor AKT aktivitet i CEACAM6-overekspresjon GC-celler. Western blotting viste at AKT-fosforylering ved serin 473 ble markert økt i CEACAM6-overekspresjon GC-celler sammenlignet med kontrollgruppene (fig. 5A, B). For å undersøke hvorvidt EMT endringer ble indusert ved CEACAM6 via PI3K /AKT vei, ble SGC-7901-CEACAM6 og MKN-45-CEACAM6-celler ble behandlet med 100 nM LY294002 i 24 timer. Interessant nok var E-cadherin øket og N-cadherin ble redusert i LY294002-behandlede CEACAM6-overuttrykkende celler sammenlignet med kontrollene, som målt ved hjelp av western blot-analyse (Fig. 5C, D).
(A) Western blot analyse viste at overekspresjon av CEACAM6 økt p-AKT (Ser473) fosforylering. GAPDH og total AKT ble brukt som laste kontroller. (B) Kvantifiseringen av p-AKT (Ser473) ekspresjon i GC-celler. (C) E-cadherin-ekspresjon ble øket mens N-cadherin ekspresjon ble redusert i CEACAM6-overekspresjon GC-celler behandlet med LY294002, en PI3K-inhibitor. (D) Relativ E-cadherin og N-cadherin uttrykk i CEACAM6-overekspresjon og LY294002 behandlet GC-celler ble beregnet ved grå skala ratio. Resultatene er gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk i søylediagrammer. *
P
. 0,05
CEACAM6 fremmer peritoneal spredning in vivo
Til slutt undersøkte vi effekten av CEACAM6 overekspresjon på peritoneal spredning og metastase
i
vivo
. Vi injisert SGC-7901-CEACAM6 og SGC-7901-NC celler inn i underlivet av nakne mus. Omfattende peritoneal spredning ble observert i SGC-7901-CEACAM6 gruppen sammenlignet med SGC-7901-NC gruppen (Fig. 6A). Det var betydelig mer synlige peritoneal knuter i SGC-7901-CEACAM6 gruppen enn i kontrollgruppen (5,400 ± 0,510
vs
1,400 ± 0,245,
P
. 0,01; Fig. 6B ). I tillegg overekspresjon av CEACAM6 styrke metastaser
i
vivo
har også blitt rapportert i bukspyttkjertelkreft [19].
(A) ble observert økt antall metastatiske knuter i SGC-7901-CEACAM6 gruppe enn kontrollgruppen, som indikert av de svarte piler. (B) Gjennomsnittlig antall peritoneale knuter i to grupper. Flere knuter skjedde i SGC-7901-CEACAM6 gruppe enn SGC-7901-NC-gruppen.
Diskusjoner
GC er den andre årsaken til kreft-dødsfall på verdensbasis [1] . Økende bevis indikerer at CEACAM6 spiller en viktig rolle i gastrointestinal kreft progresjon [7], [20] – [22], og CEACAM6 er mer utbredt enn CEA (CEACAM5) i normale vev, med sterk ekspresjon i mange epithelia [4]. CEACAM6 påvirkninger intracellulære signal hendelser gjennom homofilist og heterofile heft med andre CEACAMs eller inte [23], [24]. Hensikten med denne studien var å undersøke bidrag av GPI-forankret protein CEACAM6 i GC progresjon.
Interessant, observerte vi at cellen morfologi og cytoskeletal strukturen ble endret av stabil oppregulering og nedregulering CEACAM6 i GC-celler. CEACAM6-overuttrykkende celler ble mer mesenchymale aktig og oppviste en spindel og fusiforme form, og mer aktin spennings fibre ble detektert sammenlignet med kontrollgruppene, i en prosess som definert EMT. Den mesenchymale fenotype endows celler med flere trekkende og invasive egenskaper [15]. Denne observasjonen var i overensstemmelse med
i
vivo
resultater der CEACAM6 indusert omfattende peritoneal sprer seg i nakne mus. MET ble observert følgende stanse av CEACAM6 i GC-celler. Disse observasjonene viste at CEACAM6 kan være involvert i indusering av EMT i GC. Vi neste undersøkte sammenhengen mellom CEACAM6 og E-cadherin, en markør for EMT, i GC vev ved immunhistokjemisk farging. Som forventet, ble det observert signifikant negativ korrelasjon mellom CEACAM6 og E-cadherin, og E-cadherin-ekspresjon ble forbundet med dybden av tumorinvasjon, lymfeknutemetastase og TNM stadium i GC vev. I tillegg CEACAM6 fremmet lymfeknutemetastase (
P
= 0,001) i 98 GC vev i vår tidligere studie [12]. Tidligere resultater viste at CEACAM6 demping økte E-cadherin promoter aktivitet i kolorektal kreft [20]. Basert på de ovennevnte funn, postulerte at vi CEACAM6 fremmet GC invasjon og metastase ved å indusere EMT og kan tjene som en markør mesenchymale.
eller metastaser er den ledende årsak til kreft-assosiert død, men har vært vanskelig å studere fordi innebærer en rekke sjeldne, stokastiske hendelser. En rekke mulige signalveier som er relevante for kreft metastase er blitt illustrert, inkludert PI3K /AKT, MAPK /ERK, FAK-SRC, JAK /STAT, NF-kβ, og MMP trasé [25] – [27]. I denne studien ble overekspresjon av CEACAM6 forhøyede MMP-9-aktivitet, og anti-MMP-9-antistoffet kan reversere de økende invasive og trekkegenskaper indusert av CEACAM6. EMT start er signifikant korrelert med kreft metastase, og induserer stamcelleegenskaper, hindrer apoptose og senescence, og bidrar til immunsuppresjon i kreft progresjon [15]. EMT kan induseres ved aktivering av PI3K /AKT-signalveien [28], [29]. CEACAM6 fungerer som et intercellulært adhesjonsmolekyl og kan danne større lipid flåter ved å samhandle med seg selv eller andre CEACAMs, og dermed aktivisere de nedstrøms signalkaskader, slik som integrin og PI3K /AKT trasé [10], [30]. Derfor undersøkte vi effekten av CEACAM6 overekspresjon på nivåer av AKT-fosforylering i GC-celler. Fosforylerte AKT nivåene ble øket i CEACAM6-overekspresjon-celler, i overensstemmelse med tidligere resultater er angitt i pankreatiske karsinomer [8], [11]. I henhold til disse observasjonene foreslår en hypotese hvorved CEACAM6-indusert EMT skjer gjennom aktivering av PI3K /AKT signalkaskade i GC. Videre CEACAM6-overekspresjon celler behandlet med LY294002, en PI3K inhibitor, gjennomgikk en reversering av EMT via MET. Dermed konkluderer vi med at CEACAM6 induserer EMT ved å aktivere PI3K /AKT signalveien i GC, og kan tjene som et potensielt mål i svulst behandling.
I konklusjonen har vi illustrert at CEACAM6 fungerer som et onkogen ved å fremme EMT via PI3K /AKT-aktivering i GC. Videre er E-cadherin markert nedregulert i GC vev enn sammenkoblede tilstøtende ikke-tumorvevet. CEACAM6 fremmer invasjon og metastase
i
vitro Hotell og
i
vivo
, og kan være en potensiell ny diagnostisk og prognostisk markør og romanen mål for GC terapi.
Hjelpemiddel Informasjon
Sjekkliste S1.
ANKOMMER retningslinjer. Alle in vivo eksperimenter i vår manuskriptet ble eksportert i samsvar med de ankommer retningslinjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0112908.s001 plakater (DOC)
Takk
takker Xuehua Chen og Jianian Zhang for teknisk assistanse, til Beiqin Yu for hennes materiell støtte.
