Abstract
Cell-baserte aktiv immunterapi mot kreft er en lovende ny strategi, med første dendrittiske cellen (DC) vaksine oppnå regulatorisk godkjenning for klinisk bruk i fjor. Manufacturing er fortsatt krevende, spesielt for DC vaksiner, og utsiktene til å bruke cellebasert immunterapi ved adjuvant behandling eller i kombinasjon med cellegift forblir stort sett uprøvd. Her har vi brukt et sammenlignende onkologi tilnærming for å teste sikkerheten og potensielle effekt av tumor RNA-lastet, CD40-aktiverte B-celler i privateide hunder presenterer med non-Hodgkins lymfom (NHL), en klinisk situasjon som representerer ikke bare et stort problem i veterinærmedisin, men også en bona fide spontan dyremodell for den menneskelige tilstand. Når det gis til NHL hunder i remisjon etter induksjonskjemoterapi, CD40-B-celler electroporated
ex vivo
med autolog svulst RNA trygt stimulert immunitet
in vivo
. Selv om kjemoterapi pluss CD40-B-vaksinasjon ikke bedre tid til progresjon eller lymfom spesifikk overlevelse sammenlignet med hunder behandlet med kjemoterapi alene, vaksinering forsterkes effekten av berging terapi og forbedret hastigheten av holdbare andre remisjoner samt påfølgende lymfom spesifikke overlevelse etter berging terapi. Flere av disse tilbakefall hundene er nå langsiktige overlevende og fri for sykdom i mer enn et år. Samlet er disse kliniske og immunologiske resultatene tyder på at cellebasert CD40 kreft vaksinasjon er trygt og synergizes med cellegift for å forbedre klinisk utfall i canine NHL. I videre forstand, våre funn understreker den unike verdien av kliniske undersøkelser i tumorbærende selskapsdyr
Citation. Sorenmo KU, Krick E, Coughlin CM, overley B, Gregor TP, Vonderheide RH, et al. (2011) CD40-aktiverte B-celle kreft vaksine Forbedrer Second klinisk remisjon og overlevelse i privateide Hunder med Non-Hodgkins lymfom. PLoS ONE 6 (8): e24167. doi: 10,1371 /journal.pone.0024167
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 15 april 2011; Godkjent: 01.08.2011; Publisert: 31 august 2011
Copyright: © 2011 Sorenmo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Alliansen for Cancer Gene Therapy (RHV), Onyx og Breezy Foundation (KUS), Barry og Savannah puddel minnefond og Mari Lowe Comparative Oncology Senter (NJM), den Immunobiology Program av Abramson Cancer Center på University of Pennsylvania (NIH stipend P30 CA016520, RHV) og onkologi forskningsfond ved Veterinary Hospital ved University of Pennsylvania (KUS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
med den nylige FDA godkjenning av dendrittiske cellen vaksine sipuleucel-T for behandling av avansert prostatakreft [1], har det blitt fornyet innsats for å ytterligere optimalisere andre generasjons cellebasert terapi som tar sikte på å stimulere anti- svulst immunitet for behandling av kreft [2] – [3]. Fordi bruken av hvile eller uaktiverte antigenpresenterende celler (APC) faktisk kan utløse antigen-spesifikk T-celletoleranse og derfor være meget mot sin hensikt hvis de administreres til pasienter, er det viktig å utvikle og teste APC formuleringer som er spesielt utformet for å aktivere APC enten
in vivo
eller
ex vivo
. En tilnærming som har fremkommet er farmakologisk tverrbinding av CD40 uttrykt på overflaten av APC [4] for å oppregulerer MHC og ko-stimulerende molekyler, stimulerer sekresjon av inflammatoriske cytokiner som IL-12, og opp-regulerer anti-apoptotiske molekyler – en prosess kollektivt kjent som «APC lisensiering» som gjør det mulig grunning av naive CD4 + og CD8 + T-celler og forsterke robuste minne T-celle responser [5]. Kliniske reagenser som aktiverer CD40 er utviklet for systemisk bruk, og har vist klinisk løfte [6] – [8], men disse agentene ikke nødvendigvis kjøre T-celle responser
in vivo
grunn av restriktive funksjoner i svulsten mikromiljøet [8]. Her studerer vi en
ex vivo
tilnærming til APC lisensiering. Selv om dendrittiske celler i de fleste modeller er de cellene hovedsakelig ansvarlig for fysiologisk T-celle-priming
in vivo
, B-celler kan også virke som APC og kan også være lisensiert av CD40-aktivering [9] – [10]. CD40-aktiverte B-celler (CD40-B), som DC, kan prime naive T-celle responser mot neoantigener
ex vivo Hotell og kan øke minnet T-celle responser [9] – [11], noe som tyder på at antigen-loaded , CD40-B kan representere et levedyktig alternativ til DC i celle-baserte vaksinestrategier. I skarp kontrast til DC, men B-celler kan lett utvides
in vitro
ved hjelp av CD40-ligering, fjerner nødvendigheten av store volum leukaferese (som er nødvendig for å fremstille sipuleucel-T) for å skaffe et tilstrekkelig antall for APC tilbakevendende vaksiner [9] – [10], [12]. Selv om CD40-B kan øke antigen-spesifikke effektor T-celle responser
in vitro
mot virus- og tumorassosierte antigener, lite er kjent om disse alternative APC kan stimulere effektive anti-tumor immunresponser
in vivo
.
for å ta opp dette spørsmålet, har vi utført en klinisk studie med en CD40-B-vaksine i privateide hunder (dyr) med non-Hodgkin lymfom (NHL). Canine NHL representerer et stort helseproblem i hunder og aksjer tilsvarende kliniske, atferdsmessige, genetiske og cytogenetiske egenskaper til NHL hos mennesker. Det er nå allment akseptert som en klinisk relevant modellsystem der for å vurdere sikkerhet og effekt av nye terapeutiske midler før de oversettelse til kliniske studier [13]. Som hos mennesker med NHL, standarden på omsorg for innledende behandling av hjørnetann NHL består av kombinasjonen kjemoterapi protokoller. Selv kjemoterapien er svært effektiv og 60% -85% av behandlede hunder oppnå fullstendig klinisk remisjon etter induksjonsterapi, nesten alle hunder tilbakefall innen ett år med multiresistent sykdom og dø av lymfom [14] – [15]. Den kur priser på hjørnetann NHL har ikke endret seg vesentlig i løpet av de siste tiårene til tross for bruk av flere dose intense protokoller.
I denne studien har vi klinisk testet en terapeutisk plattform som vi tidligere har beskrevet i prekliniske studier [12 ] hvori B-celler fra NHL hunder ekspanderes
in vitro
ved hjelp av CD40L transfektert K562-celler (KtCD40L) og deretter lastet med autologe tumor RNA for å generere et cellebasert vaksine. RNA-lastet CD40-B er avledet fra hunde perifere blod B-celler stimulerer funksjonelle, antigen-spesifikke T-celle responser
in vitro
fra friske hunder og hunder med fra spontant forekommende NHL [12]. Bruken av hele tumoren RNA som det antigene nyttelast gjør det mulig for et HLA-uavhengig, helt antigen metode som tar sikte på å fremme et polyklonalt anti-tumor T-cellerespons. Her rapporterer vi den første kliniske studien i noen arter av en svulst RNA lastet CD40-B kreftvaksine, utført i innstillingen av minimal restsykdom. Våre resultater viser at CD40-B kan stimulere immunresponser
in vivo
som påvirker andre remisjon og overlevelse i en spontan, stor dyremodell av NHL. Disse resultatene tyder på at tumor antigen lastet CD40-B kan tjene som et praktisk alternativ til DC i cellebasert vaksinestrategier for både hunder og mennesker med kreft.
Resultater
Privateid hund protokollen
Tretti privateide hunder med NHL ble immatrikulert ved sykdom presentasjon i denne pre-klinisk forundersøkelse og gjennomgikk induksjonskjemoterapi (Gruppe 1, intent to treat). Pasientkarakteristikker er vist i Tabell 1. Nitten hunder (63%) ble bekreftet å være i fullstendig cytologiske og klinisk remisjon ved slutten av kjemoterapi, og ble derfor kvalifisert for vaksinering med autologe CD40-aktiverte B-celler (annenhver uke i tre intradermale injeksjoner i flanken) som hadde blitt lastet med total RNA tidligere isolert fra autologe lymfom celler (metoder og materialer, og supplerende metoder) (gruppe 2). Et likt antall autologe CD40-B lastet med valpesykevirus hemaglutinin mRNA ble injisert i den motsatte flanken som en immunologisk kontroll. Seksti-fire hunder med NHL ble valgt ut fra en gruppe på 130 hunder som kontroller for den uvaksinerte gruppe (gruppe 3). Disse hundene ble valgt basert på det faktum at de ble behandlet med den samme induksjonskjemoterapi regime som den vaksinerte gruppe (gruppe 2), og ble bekreftet å være i fullstendig klinisk og cytologiske remisjon ved slutten av kjemoterapi-protokollen, men de har ikke fått CD40 -B celle vaksiner. Det var ingen incentiver for hunder i en gruppe for å motta kjemoterapi og dermed unngår skjevheter i behandling tilnærming eller intensitet av behandlingen. Selv om antall hunder i kontrollgruppen (gruppe 3) var større enn den vaksinerte hunden gruppe (gruppe 2), var det ingen statistisk signifikante forskjeller i prognostiske faktorer, inkludert immunfenotypen mellom gruppene 2 og 3 (tabell 1).
Toxicity
Vaksinasjon med RNA lastet CD40-B ble svært godt tolerert. En hund viste tegn på akutt systemisk reaksjon, inkludert svakhet, hypotensjon og oppkast i løpet av få timer motta den første vaksinen. Behandling med intravenøse væsker, difenhydramin og antiemetika resulterte i en begivenhetsløs utvinning. Denne spesielle hunden ble forbehandlet med difenhydramin umiddelbart før de 2 påfølgende vaksinasjoner, og ingen ytterligere systemiske reaksjoner forekom. Milde reaksjoner på injeksjonsstedet, inkludert erytem og hevelse skjedde i flere hunder. Det var ingen signifikante endringer i fullstendig blodkjemi under eller etter vaksinering i en hvilken som helst av hundene. Videre ble ingen langsiktige komplikasjoner etter vaksinasjon som autoimmunitet identifisert klinisk, clinicopathologically (overvåket av serie CBC) eller ved obduksjon.
Kliniske utfall
Median tid til sykdomsprogresjon (TTP) var 236 dager (95% konfidensintervall [CI], 158-314 dager) i gruppe 1 (intent to treat), 366 dager (95% KI, 349-383 dager) i gruppe 2 (vaksinert hunder), og 327 dager (95 % CI, 223-431) i gruppe 3 (uvaksinerte hunder). Det var ingen statistisk signifikante forskjeller i TTP mellom gruppene 1 og 3 (p = 0,16), eller gruppene 2 og 3 (p = 0,34). Kaplan Meier-kurver for TTP er vist i fig. 1A og 2A. Median lymfom spesifikk overlevelse (LSS) var 489 dager i Gruppe 1 (95% CI, 309-669 dager), 809 dager i gruppe 2 (95% KI, 289-1335 dager), og 594 dager i Gruppe 3 (95% CI, 536-652 dager). Kaplan Meier-kurver for LSS er vist i fig. 1B og 2B. Selv om det var en forbedring på 36% i median LSS i den vaksinerte gruppe 2 i forhold til den uvaksinerte kontroll gruppe 3, var forskjellen ikke statistisk signifikant (p = 0,18). Likeledes er det ikke var noen statistisk signifikant forskjell i median LLS mellom gruppe 1 og gruppe 3 (p = 0,37). Den totale overlevelsen i gruppe 2 og gruppe 3 hunder på 1 år var 89,5% og 74,1%, henholdsvis, og ved utgangen av året 2 var 41,4% og 25,4%, henholdsvis. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i total overlevelse, noe som indikerer at vaksinering ikke økte dødeligheten.
Femten av 19 (79%) vaksinert hunder i gruppe 2 til slutt tilbakefall, men 4 hunder (21 %) har ikke, og oppnådde en holdbar ( 16 måneder) første remisjon etter kjemoterapi og CD40-B vaksinasjon. En av disse fire hundene døde av urelaterte årsaker på 492 dager uten tegn til lymfom bekreftet av obduksjon. De andre 3 hundene er i live uten tegn til lymfom på 959, 1103 og 1287 dager etter oppstart av kjemoterapi (med klinisk oppfølging pågår). Ti av de vaksinerte hunder (52,6%) har dødd som følge av lymfom; seks forbli i live i holdbar første eller andre remisjon, og tre ble avlivet på grunn av andre årsaker. To av de tre hundene avlives hadde hemangiosarcoma, med ingen bevis for lymfom, og den andre hunden ble avlivet på grunn av «sviktende helse.» Begrenset work-up var tillatt på denne hunden, men obduksjon fant ingen bevis for lymfom. Årsaken til sviktende helse var ikke identifisert; men det var ingen tegn på autoimmunitet og alle celle linjer med fullt modning var tilstede i benmargen. Totalt 7 hunder gikk obduksjon når de døde eller ble avlivet. Med unntak av de 3 tidligere diskutert hunder, ble alle de andre hundene (4 hunder) avlives på grunn av avansert stadium lymfom og hadde ingen bevis for sent toksisitet av vaksinen. Fire av de 64 hundene i kontrollgruppen (gruppe 3) ble ikke fulgt opp etter restaging, og utfallet informasjonen var ikke tilgjengelig. Av de resterende 60 hunder, 46 (76,7%) fikk tilbakefall og 14 (23,3%) ikke gjorde det. Det var ingen signifikant forskjell i antall tilbakefall mellom gruppene 2 og 3 (p = 1,0).
Salvage terapi og dødsårsak
Ti av de 15 vaksinerte hunder (66,7%) i gruppe 2 at tilbakefall ble behandlet med cyklofosfamid, vinkristin og prednison (COP) som berging terapi og fire av disse hundene (40%) oppnådd varig andre klinisk remisjon ( 22 måneder) og ikke tilbakefall. De andre 5 vaksinert hunder som tilbakefall mottatt mono prednison som berging terapi, hvorav oppnås en varig andre remisjon og ikke tilbakefall. Tre av disse fire vaksinerte hunder med kjemoterapi-indusert holdbar andre remisjon er fortsatt i live uten tegn til lymfom på 689, 1209 og 1216 dager etter starten av sin opprinnelige kjemoterapi. De to andre hundene (en behandles med COP kjemoterapi og en behandlet med prednison alene) ble avlivet ved 722 og 958 dager på henholdsvis; som nevnt ovenfor, den første hunden hadde hemangiosarcoma og den andre hunden ble avlivet på grunn av «fallende helse». Ingen av hunden hadde tegn på lymfom ved obduksjon. De øvrige ti Hundene fikk tilbakefall i løpet av berging terapi og ble avlivet på grunn av deres lymfom
I uvaksinerte gruppe 3, 39 av 46 hunder (84%) som fikk tilbakefall ble behandlet med berging kjemoterapi og en hund mottok prednison alene.; imidlertid bare 3 (7,7%) av hunder i gruppe 3 som mottok berging terapi oppnådd en varig andre remisjon, sammenlignet med 40% av de vaksinerte hunder som er oppnådd en varig andre remisjon for å berge terapi, en forskjell som var statistisk signifikant (p = 0,025). Denne forskjellen resulterte i en statistisk signifikant forbedring i overlevelse etter berging terapi for tilbakefall Gruppe 2 hunder som fikk berging terapi i forhold til tilbakefall Gruppe 3 hunder som fikk berging terapi (p = 0,038) (Fig. 3). Viktigere var det ingen signifikant forskjell i bruken av berging terapi mellom hunder som fikk tilbakefall i gruppe 2 (66,7%) og gruppe 3 (84%), (p = 0,15).
Immunologisk vurdering
for å finne ut om kreft RNA-lastet CD40-B-celler indusert funksjonelle tumor-spesifikke T-celle responser
in vivo
, perifere mononukleære blodceller (PBMC) oppnådd ved diagnosetidspunktet og 3 uker etter den siste vaksinering ble analysert for tilstedeværelse av IFN-γ produserende tumorspesifikke T-celler etter ELISPOT. IFN-γ ELISPOT-analyse var tilgjengelig for 9 hunder i gruppe 2 (fig. 4). En positiv IFN-γ respons på behandling ble definert som 50% økning i antall cytokin-utsondrende celler etter vaksinasjonen i forhold til grunnlinjen og med en p-verdi 0,05. Positive immunresponser til CDV HA ble observert i fire av 9 vaksinerte hunder; en positiv IFN-γ immunrespons mot autologe tumorantigenet ble også observert i en hund, og en trend mot signifikans (p 0,1) ble observert i ytterligere 2 hunder. I 2 andre hunder (hund 1 og hund 16) var der 50% økning i antall cytokin utsondrende celler som svar på autologe tumorantigenet etter vaksinering sammenlignet med grunnlinjen, men statistisk signifikans kunne ikke tilordnes grunn til å duplisere i stedet for triplikat analyse. Det var ingen korrelasjon mellom immunologisk reaksjon og det gjennomsnittlige antall av CD40-B-celler administrert til hver hund i løpet av de tre vaksiner. Fordi bare 9 hundene var i stand til å bli analysert (på grunn av manglende tilgjengelighet av PBMC ved alle tidspunkter), var vi ikke i stand til å oppdage en statistisk signifikant sammenheng mellom immunologiske respons og klinisk utfall.
PBMC ble oppnådd fra hunder på diagnosetidspunktet (pre) og 3 uker etter vaksinasjon (post) og antigen-spesifikke immunresponser rettet mot (A) CDV-HA og (B) lymfeknutetumorantigener ble bestemt ved IFN-y ELISPOT. * P 0,1, ** p. 0,05
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å finne ut om svulsten RNA-transfekterte CD40-aktiverte B-celler kan trygt indusere anti- svulst immunitet og påvirke naturhistorie av spontan NHL i hunder etter remisjon induksjon med kjemoterapi. I en klinisk studie av privateide hunder, RNA-lastet autologe CD40-B-celler administrert intradermalt i innstillingen for minimal sykdom fungerte som APC
in vivo Hotell og stimulert IFN-γ sekresjon celler. Selv om vår vaksinasjon tilnærmingen ikke påvirke TTP eller LSS sammenlignet med en kontrollgruppe av hunder behandlet med kjemoterapi alene, observerte vi en statistisk signifikant forbedring i den vaksinerte gruppen i frekvensen av holdbare andre remisjoner samt påfølgende lymfom spesifikk overlevelse i tilbakefall hunder etter behandling med berging terapi. Dette funnet er spesielt interessant fordi berging terapi brukes inkluderte bare medisiner som allerede hadde blitt brukt i den innledende kjemoterapi. Det har lenge vært klart at det store flertallet av hunder med NHL som tilbakefall etter første remisjon lider rask tumorprogresjon og dø til tross for berging behandlinger [15]. Som en illustrasjon på dette, i kjemoterapi (ingen vaksine) gruppen i denne studien, ble varig andre remisjon oppnås i bare 7,7% av hundene. I motsetning til hunder som fikk tilbakefall etter å ha fått kjemoterapi pluss CD40-B-vaksinasjon, oppnådde 40% av hundene en annen, varig remisjon. Videre lymfom spesifikk overlevelse var lenger i tilbakefall hunder som hadde vært tidligere er vaksinert enn de hundene som ikke hadde (med aktiv klinisk oppfølging pågår). Selv om antall hunder i den vaksinerte gruppen er liten, er de kliniske funn i denne forundersøkelse oppmuntrende og garanterer videre testing i en større, dobbeltblind, randomisert klinisk studie. Totalt sett, våre kliniske og immunologiske resultatene tyder på at cellebasert CD40 kreft vaksinasjon synergizes med cellegift for å forbedre klinisk utfall i denne sykdommen.
Vaksinen strategi ansatt i denne studien bygger på vår forrige preklinisk arbeid [10], [ ,,,0],12] viser at CD40-B kan bli anvendt som et alternativ til DC i vaksinestrategier kreft, med den ekstra fordelen av
ex vivo
celle utvidelse slik at flere vaksiner som skal genereres fra et lite volum av perifert blod. Våre resultater bekrefter at bruken av hele tumoren RNA transfektert CD40-B-celler som et alternativ til DC-vaksinasjon er både mulig og godt tolerert
in vivo
. I denne studien brukte vi hele svulsten RNA som antigen nyttelast som leverer både muterte tumor /lymfom spesifikke antigener og ikke-mutert selvantigener.
In vitro
, RNA-transfekterte CD40-B kan stimulere cytotoksiske T-celleresponser mot tumorantigener som er sammenlignbare med responsene indusert av antigen-lastet DC [10], [16]. Her har vi oversatt disse funnene i den kliniske arena og viser at, i likhet med antigen-lastet DC, CD40-B kan indusere immunresponser når det gis
in vivo
. Viktigere, fant vi at autolog RNA lastet CD40-B kan gis trygt til hunder med bare sporadisk og milde reaksjoner på injeksjonsstedet bemerket som akutte bivirkninger. En hund hadde en enkelt anafylaktisk-lignende reaksjon på den første vaksineringen som ikke tilbake etter den andre eller tredje vaksinasjon. Ingen langsiktige komplikasjoner etter vaksinasjon inkludert autoimmunitet ble identifisert enten klinisk eller ved obduksjon i noen av hundene. Videre vurderte vi også total overlevelse mellom den vaksinerte gruppen og kontrollgruppen og fant ingen statistisk signifikant forskjell, noe som indikerer at vaksinering ikke økte dødeligheten.
Våre observasjoner som før CD40-B vaksinasjons positivt påvirker frekvensen av andre remisjon og påfølgende overlevelse i tilbakefall hunder behandlet med berging terapi paralleller funn som dukker opp fra siste arbeid i menneskelige vaksineforsøk; nemlig til forlenget median total overlevelse [1] eller en uventet høy svarprosent berge terapi [17], uten nødvendigvis bedre progresjonsfri overlevelse hos mennesker vaksinert med antigen-lastet DC. Disse menneskelige studier dokumentert en sammenheng mellom tidlige immunresponser til vaksinasjon og uventede og holdbare svar på senere kjemoterapi, og foreslår et komplekst samspill mellom kjemoterapi og immunterapi som kan være terapeutisk utnyttes. Selv om de underliggende mekanismene bak disse observasjoner ikke er helt forstått, er det antatt at bruk av cytotoksisk kjemoterapi hos pasienter hvis immunsystem er blitt riktig primet for å gjenkjenne tumorantigenet via kreft vaksinering kan forsterke antitumorimmunitet [18] – [19] . Cytotoksiske midler så som antracyklinene kan indusere «immunogen» tumorcelledød og frigjøring av potente proinflammatoriske molekyler som fremmer DC-aktivering og antigen prosessering og presentasjon [20]. Videre kan de cytotoksiske effektene av berging terapi produsere en immunologisk anti-tumor booster effekt ved å bryte ned tumorceller og derved frigi tumorantigener for presentasjon [21]. Veldig nyere data tyder også på at kjemoterapi kan bevisst tumormål for drap etter spesifikke T-celler indusert ved vaksinasjon [22]. Cytotoksiske midler så som cyklofosfamid, kan også forbedre antitumorimmunitet gjennom hemming av regulatoriske T-celler [23] og ved å modulere balansen av dendrittiske celleundergrupper i lymfoide organer [24]. Derfor, i vår studie, er det mulig at berging terapi tjente til å forsterke anti-tumor immunresponser som hadde blitt riktig primet etter forhånds CD40-B-vaksine, som fører til varige andre remisjon tider og lengre total overlevelse.
brukte data fra hunder behandlet med kjemoterapi protokollen ved samme institusjon som kontrollen befolkningen i TTP /LSS analyser. Ideelt sett kontroll befolkningen ville ha bestått av hunder randomisert til å motta kjemoterapi alene, og sammenligninger utført på intent-to-treat basis; Men så mange som 40% av hundene presentere vår institusjon med NHL mislykkes induksjonskjemoterapi, og vil derfor ikke være kvalifisert for vaksinasjon eller inkludering i kontrollpopulasjonen. Utvalgsstørrelsen er nødvendig for å ha tilstrekkelig kraft til en slik studie ville være ganske stor og derfor ikke praktisk for en mulighetsstudie. Som et alternativ, valgt vi hunder med den samme sykdom, behandlet med det samme 20-ukers kjemoterapiregime som førte til en fullstendig remisjon fra en større gruppe av hunder med NHL som en uvaksinert kontrollgruppe. Viktigere, ved å analysere tidligere dokumenterte negative prognostiske faktorer mellom gruppene 2 og 3 (tabell 1), vi bekreftet at det ikke var noen statistisk forskjell i disse forholdene mellom gruppene 2 og 3. Imidlertid, på grunn av en liten populasjon av gruppe 2 og mangfoldet variabler er det mulig at forskjeller i negative prognostiske faktorer mellom gruppene kan ha eksistert.
til slutt, våre funn understreker verdien av en sammenlignende onkologi tilnærming [13], [25] der privateide hunder med NHL representerer ikke bare et vesentlig klinisk problem i veterinærmedisin, men også en spontan dyremodell for den humane tilstand. Testingen av nye immunterapier på høy risiko, men minimal restsykdom innstillingen hos hunder er hensiktsmessig og etisk, og potensielt avgjørende for en vellykket utvikling av immunologiske tilnærminger som ellers ville bli undertrykket av store tumorbelastninger. Her, i stedet for å distribuere komplekse terapeutiske innsats for å løse problemstillinger av immunsuppresjon i svulsten mikromiljøet, vi først brukt standard kjemoterapi å massivt redusere tumormasser før immunterapi. I de aller fleste av fase I kliniske studier som evaluerer immunterapi hos mennesker, pasienter har betydelig tumorbyrde, avansert sykdom, og har lidd immunsuppressive effekten av flere runder med kjemoterapi og andre behandlinger. Studiet av hunder med spontan NHL gir en unik mulighet til å evaluere den terapeutiske effekten av immunterapi i innstillingen av minimal restsykdom. Resultatene fra denne studien tyder på at synergieffekter mellom kjemoterapi og immunterapi oppstår og at den optimale kombinasjonen av disse modaliteter kan føre til betydelige terapeutiske tiltak. Videre studier i privateide hunder med naturlig forekommende kreftformer kan gi en mulighet til å forstå de underliggende mekanismene bak denne effekten, og for å finne den optimale kombinasjonen og rekkefølgen av cellegift-immunterapi for terapeutisk suksess. Denne tilnærmingen kan fremskynde oversettelsen av slike kombinasjoner til menneskelige pasienter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Studiet ble godkjent av vår universitetets Institutional Animal Care og bruk Committee ( protokoll 800900) og det privateide Animal protokollutvalget ved University of Pennsylvania School of Veterinary Medicine (Protocol POAP-197).
Protocol studiepopulasjonen, kvalifikasjonskriterier og studiedesign
Hunder med nylig diagnostisert, ble ubehandlet multicentric NHL som veide mer enn 5 kg screenet for valgbarhet til å delta i denne studien. På tidspunktet for diagnose, komplett iscenesettelse, inkludert CBC, serum kjemi profil, urinalysis, thorax røntgen, abdominal ultralyd, immunfenotyping, benmarg aspirates, lymfeknute aspirates og biopsier, ble utført. Kriteriene inngår ingen alvorlig samtidig sykdom, mindre enn 30% lymfoblaster på benmargs aspirater, sjeldne å fraværende lymphoblasts oppdaget på perifert blodutstryk anmeldelse, og skriftlig informert samtykke fra eieren.
Før induksjonskjemoterapi et enkelt, perifer lymfeknute ble kirurgisk skåret og perifert blod ble samlet for vaksine generasjon og baseline immunfunksjonsstudier. Induksjonskjemoterapi besto av en kort, 20-ukers kombinasjonskjemoterapi protokollen inkluderer cyklofosfamid, doksorubicin, vinkristin, L-asparaginase, og prednison, som tidligere beskrevet [14]. Den samme induksjonskjemoterapi protokoll ble benyttet for hunder i gruppe 2 og 3. Alle hunder gjennomgikk fullstendig restaging, inkludert fine nål aspirater og cytologisk evaluering av en perifer lymfeknute, to uker etter fullføring av protokollen. Bare hunder som ble bekreftet å være i fullstendig remisjon var kvalifisert for vaksinering og bare disse hundene gikk ytterligere blod trekker for PBMC samling.
autologe vaksinen besto av totale kreft RNA-lastet CD40-B-celler og kontrollvaksine besto av CD40-B-celler lastet med CDV-HA mRNA. Vaksiner ble initiert 3 til 4 uker etter avslutningen av kjemoterapi. Vaksinerte områder ble barbert og aseptisk forberedt før vaksinasjon. Vaksiner fikk intradermalt (tumor RNA CD40-B i en flanke, CDV-HA CD40-B i motsatt flanke) hver 2 til 3 uker for totalt tre vaksinasjoner. Blood for immun studier og toksisitet overvåking ble samlet umiddelbart før hver vaksinasjon og 3 uker etter siste vaksine ble gitt.
Hunder som ikke klarte å oppnå remisjon, og derfor ikke får vaksinen og hunder som ble vaksinert, men tilbakefall senere ble tilbudt standard-of-care berging terapi i henhold til eiernes preferanser og veterinær anbefalinger. Alle vaksinerte hunder ble overvåket for tilbakefall gjennom månedlige undersøkelser for det første året, annenhver måned for to
nd året og hver 3. måned for det tredje året. Tilbakefall ble bekreftet av tynn nål aspirates i alle hunder.
RNA og mRNA forberedelse
Produksjons detaljer for CD40-B forberedelse, RNA isolering og electroporation har tidligere blitt rapportert [12]. I korte trekk, ble total RNA ekstrahert fra ondartet lymfeknute vev tatt på tidspunktet for diagnose og før kjemoterapi ved hjelp av RNAeasy kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA mengden ble bestemt ved å måle O.D. ved 260 nm og RNA kvalitet ble bestemt ved gel electophoresis. RNA ble lagret ved -80 ° C før bruk. mRNA som koder for full-lengde CDV-HA eller GFP ble fremstilt fra mal plasmider ved in vitro transkripsjon som tidligere beskrevet [12]. Transkribert RNA ble polyadenylert ved 3′-enden ved bruk av Escherichia coli Poly (A) Polymerase I (E-PAP), behandlet med DNAse for å fjerne plasmidsekvenser og renset ved sur fenol /kloroform-ekstraksjon og RNeasy-kolonne separasjon (Qiagen).
vaksineproduksjon
CD40-B ble samlet fra hunde perifere mononukleære blodceller (PBMC) ved hjelp av K562-celler transfektert med human CD40L (KtCD40L) som mateceller som tidligere beskrevet [12]. 5 × 10
6 PBMC ble ko-dyrket med 10
6 lethally bestrålte KtCD40L celler i nærvær av rekombinant canine IL-4 og ciklosporin. Etter 5-7 dager, ble B-celler høstet, tellet og re-stimulert med bestrålte KtCD40L celler i nærvær av IL-4 og cyklosporin. Cellene ble stimulert med KtCD40L cellene tre ganger. Fem dager etter den siste stimulering CD40-B høstet, vasket to ganger i PBS og resuspendert til 2 x 10
6 celler pr 100 ul Nucleofector B-løsning (Amaxa, Køln, Tyskland). Opp til 5 x 10
6-celler ble elektroporert med enten 10 ug autologe tumor RNA eller 2 ug CDV-mRNA ved hjelp av Amaxa Nuceofector anordningen (puls program U08). Den electroporator er designet og produsert i henhold til GMP-standarder fastsatt av FDA og er godkjent for bruk i menneskelig vaksineproduksjon. Etter elektroporering ble cellene vasket en gang i B-celle media og deretter to ganger i PBS. Electroporated celler ble resuspendert i 300 ul av PBS og administrert intradermalt over høyre flanke for kreft RNA-lastet CD40-B-celler og over på venstrekanten for CDV-lastet CD40-B-celler.
Vaksine forberedelse og generasjon
CD40-B-celler og tumor-RNA ble samlet fra alle hunder selv om antallet av CD40-B-celler produserte varieres per hund.
