Abstract
Forekomsten av tykktarmskreft (CRC) øker med alder og tidlig debut indikerer en økt sannsynlighet for genetisk predisposisjon for denne sykdommen. De somatiske genetikk av svulst utvikling i forhold til pasientens alder forblir stort sett ukjent. Vi har undersøkt mutasjonsstatus av fem kjente kreft kritiske gener i forhold til alder ved diagnose, og sammenlignet den genomiske kompleksiteten av svulster fra unge pasienter uten kjent CRC syndromer med de fra eldre pasienter. Blant 181 CRC pasienter, stratifisert etter mikro ustabilitet status, ble DNA-sekvens endringer identifisert i
KRAS product: (32%),
BRAF product: (16%),
PIK3CA plakater (4 %),
PTEN product: (14%) og
TP53 product: (51%). Hos pasienter yngre enn 50 år (n = 45),
PIK3CA
mutasjoner ble ikke observert og
TP53
mutasjoner var hyppigere enn i de eldre aldersgruppene. Den totale genmutasjon indeksen var lavest i svulster fra de yngste pasientene. I motsetning til dette genomet kompleksitet, vurderes som kopitallavvik, var høyest i svulster fra de yngste pasientene. Et tilsvarende antall svulster fra unge ( 50 år) og gamle pasienter ( 70 år) var firemannsrom negativ for de fire prediktive genetiske markører (
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN
); Men 16% av unge versus bare 1% av de gamle pasientene hadde svulst mutasjoner i
PTEN /PIK3CA
eksklusivt. Dette innebærer at mutasjonstesting for prediksjon av EGFR behandlingsrespons kan begrenses til
KRAS Hotell og
BRAF
hos eldre ( 70 år) pasienter. Distinkte genetiske forskjeller som finnes i svulster fra unge og eldre pasienter, som er sammenlignbare for kjente kliniske og patologiske variabler, viser at unge pasienter har en annen genetisk risikoprofil for CRC utvikling enn eldre pasienter
Citation. Berg M, Danielsen SA, Ahlquist T, Merok MA, Ågesen TH, Vatn MH, et al. (2010) DNA sekvens Profiler av tykktarmskreft Kritisk Gene Set
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53
relatert til alder ved sykdomsutbruddet. PLoS ONE 5 (11): e13978. doi: 10,1371 /journal.pone.0013978
Redaktør: Kelvin Yuen Kwong Chan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 21 juni 2010; Godkjent: 14 oktober 2010; Publisert: 12.11.2010
Copyright: © 2010 Berg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert med tilskudd fra den norske Kreftforening (https://www.kreftforeningen.no/english) RAL (Tilskudd nummer 95068 /RAL, inkludert PhD-stipend til SAD, MB og THA, og Post doc stipend til TA), og tilskudd fra Norsk Stiftelsen Helse og Rehabilitering (https://www.helseogrehab.no/) gjennom EXTRA midler (tilskudd nummer HF-52015/002) for å ETE Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekomsten av tykktarmskreft (CRC, MIM # 114500) har økt i den vestlige verden, inkludert Norge i løpet av de siste 50 årene [1]. CRC er vanligvis funnet hos eldre mennesker med en median debutalder på 70 år, og bare om lag fem prosent av alle tilfeller er diagnostisert hos pasienter yngre enn 50 år. Arvelige syndromer som familiær adenomatøs polypose (FAP, MIM # 175100) og Lynch syndrom (HNPCC, MIM # 120435) er funnet i mindre enn fem prosent av alle CRC [2]. Selv om tidlig debut av sykdommen er generelt akseptert å være en indikasjon på en mulig genetisk risiko, de fleste unge til utbruddet tilfeller regnes som sporadisk som ingen kjent genetisk predisposisjon er funnet [3]. Få studier har fokusert på somatiske svulst utvikling hos unge pasienter med ingen kjente arvelige syndromer [4] – [6]
reseptortyrosinkinasehemming (RTK) signalering er viktig for å opprettholde forbrenningen, spredning, overlevelse og bevegelighet. av en celle [7]. Således blir feil i komponenter som er regulert av reseptor-tyrosin-kinaser (RTK) ofte observert i humane cancere [8], [9]. De onkogener
KRAS plakater (HGNC: 6407),
BRAF plakater (HGNC: 1097), og
PIK3CA plakater (HGNC: 8975) og tumorsuppressorgenet
PTEN product: (HGNC: 9588). er alle berørt som følge av cytokiner, vekstfaktorer og hormoner signal gjennom RTK
Begge
KRAS Hotell og
BRAF
har vist seg å har aktiverende mutasjoner i ~70% av CRC [10], som fører til autonom ERK-signalisering [11], [12]. Mutasjoner i komponenter i PI3-kinase pathway er rapportert som mutert i ~40% i CRC [13], og analyser av genomiske landskapet av CRC svulster har vist PI3K veien for å bli påvirket på en statistisk signifikant måte [14]. I to av disse komponentene,
PTEN Hotell og
PIK3CA
, mutasjoner føre til konstitutiv aktivering av PI3K veien ved opphopning av phosphatidylinositol (3,4,5) trifosfat (PIP
3) , som så katalyserer fosforylering av AKT. Den aktiverte serin-treonin-kinase AKT regulerer et bredt spekter av target-proteiner som er involvert i en rekke nedstrøms signalveier [15]. Blant AKTs nedstrøms mål er tumorsuppressorgenet
TP53 plakater (HGNC: 11998), en transkripsjonsfaktor som integrerer informasjon fra mange ulike typer cellulært stress og gjennomføre nedstrøms reaksjonsformer tilpasset den gitte innspill [16].
TP53
er funnet mutert i omtrent halvparten av alle kolorektal karsinom [17]
MSI status i den primære svulsten har prognostisk effekt i CRC pasienter [18] -. [20].
KRAS Hotell og
TP53
status har vært assosiert med kliniske endepunkter, den tidligere bare med svak tilknytning i større serie, og sistnevnte bare hvis undergrupper av mutasjoner regnes [21] – [23] . Nylig har en studie vist at
PIK3CA
mutasjoner kan bære prognostisk informasjon i tumor etapper I-III [24]. Denne type informasjon er ikke publisert for
PTEN
mutasjoner.
metastatisk sykdom behandling rettet mot EGFR er funnet å være effektiv bare hvis
KRAS Hotell og
BRAF
er ikke mutert [25]. Men selv blant pasienter med villtype
KRAS Hotell og
BRAF
ikke alle svare på denne behandlingen [26,26]. I det siste har det blitt foreslått at dette kan skyldes mutasjoner i
PIK3CA Hotell og
PTEN
, dvs. kun firemannsrom mutasjonsnegative svulster vil reagere på behandlingen [26] -. [29]
i denne studien har vi sammenlignet DNA-sekvensen mutasjonsstatus av genene
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA, PTEN
, og
TP53
i tumorprøver fra pasienter yngre enn 50 år på diagnose og uten kjente arvelige syndromer, og stratifisert etter MSI status og eldre CRC pasienter.
Resultater
Clinicopathological data for hele serien (n = 181), delt inn i tre aldersgrupper, er presentert i tabell 1.
mikro instability- og genmutasjon status
MSI- og mutasjonsfrekvenser av de analyserte gener som er presentert i Tabell 1, og et varme kart som representerer mutasjonsdata for alle prøvene er vist i figur 1. i den totale serie, ble MSI funnet i 18% av prøvene, som strekker seg fra 13% i 50 aldersgruppen 20% i 70 aldersgruppe. MSI var signifikant assosiert med lokalisert sykdom, Tabell S1. Genene ble mutert innenfor forventet område av frekvenser. Mutasjonsfrekvenser for hvert gen uavhengig og frekvenser av kombinasjoner av mutasjoner i genene som ble testet, ble likt fordelt mellom alle ledd. Forskjeller knyttet til debutalder er påpekt under.
Distribusjon av mutasjoner i genet sett
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53
, og MSI status, innenfor hver aldersgruppe. Fargekoding: mørk blå = MSI, lys blå = MSS, rød = mutasjon, grønn = villtype, hvit = ikke påvist
I alt ni forskjellige mutasjoner ble observert hos
KRAS
, påvirker kodon 12, 13 og 61. Tjueåtte åtte~~POS=HEADCOMP svulster hadde
BRAF
V600E endring. Åtte
PIK3CA
mutasjoner ble identifisert i eksoner ni og tyve. Fjorten og femten svulster hadde henholdsvis
PTEN
mutasjoner og slettinger,. Ninety-tre svulster
TP53
mutasjoner. Detaljer om alle mutasjoner observert, kan finnes i tabell S2.
Sammenligning av aldersgrupper
Forholdet mellom de kliniske og mutasjons parametere innenfor hver aldersgruppe er gitt i tabell S1. For alle aldersgrupper, MSI-svulster var oftest til stede i høyresidig tumorlokalisasjon. I den eldste pasientgruppen MSI og
BRAF
mutasjoner ble statistisk signifikant korrelert (
P
0,001). Ingen slik sammenheng ble funnet i 50 aldersgruppe. MSI svulster innenfor 50 aldersgruppe, den 51-70 aldersgruppe og 70 aldersgruppen hadde 17%, 54% og 79%
BRAF
mutasjoner, henholdsvis (
P
= 0,04). Videre blant de seks MSI svulster i. 50 gruppe bare halvparten av prøvene gjennomføres mutasjoner i genene som ble analysert, mens blant MSI svulster i de to andre aldersgrupper, alle prøvene viste en eller flere mutasjoner
KRAS
mutasjoner ble funnet i 57 (32%) svulster i total serien. Mutasjonsfrekvenser var litt annerledes mellom aldersgruppene, Tabell 1. De fleste mutasjoner ble funnet i kodon 12 (68%) og 13 (28%) uavhengig av aldersgruppe. Kodon 61 mutasjonene ble bare funnet i prøver fra . 70 aldersgruppen
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjoner var gjensidig utelukkende i total serien. Hyppigheten av tumor mutasjoner i enten
KRAS
eller
BRAF
økt med pasientens alder, både når man sammenligner aldersgrupper og med alderen som en kontinuerlig variabel.
Overraskende, ingen av svulster i 50 aldersgruppen hadde
PIK3CA
mutasjoner, mens fem (7%) og tre (4%) ble funnet i 51-70-gruppen og . 70 gruppe, henholdsvis
Atten
PTEN
mutasjoner ble identifisert i syv av ni eksoner (ingen mutasjoner ble observert i exon 4 og 9). Mutasjonene ble observert i alle aldersgrupper, slik tilfellet var for
PTEN
slettinger. Slettinger oppdages av MLPA ble funnet i åtte prosent av prøvene totalt, og sameksistens av sletting og endringer som oppdages ved sekvensering ble funnet i tre svulster. Totalt 14% av svulstene hadde indikasjon på svekket
PTEN
funksjon. Hyppigheten av
PTEN
avvik viste ingen statistisk signifikant forskjell mellom aldersgruppene; 18%, 10% og 16% i 50-gruppen, 51-70 gruppe og . 70 gruppe, henholdsvis
Antall
TP53
mutert svulster skilte mellom de tre aldersgruppene (
P
= 0,02). Denne forskjellen var også betydelig når analysere MSS tumorer bare, (
P =
0,03). Mutasjoner var mest fremtredende i DNA-bindende domene, kodet av eksoner 5-8, og bare om lag fem prosent av mutasjonene ble observert i exon 4 og ekson 11. Videre, i 50 aldersgruppe,
TP53
mutasjoner og MSI var gjensidig utelukkende, og omvendt korrelert i 51-70 og . 70 grupper, henholdsvis
Genome kompleksitet og sekvens mutasjoner
for en undergruppe av prøvene (n = 41) en høyoppløselig datasett kopinummerendringer innhentet av utvalg komparativ genom hybridisering data (aCGH) var tilgjengelig (Roche NimbleGen, 385 000 oligo probe array) [30]. Som tidligere publiserte [30], fant vi 50 gruppe for å ha et betydelig større antall av aberrasjoner enn den ved 70 gruppe, selv om den totale del av genomet med aberrasjoner var lik i de to gruppene, tabell 2. En forskjell i kompleksitet ble også funnet på gennivå, vurdert som mutasjon Indeks: i den eldre gruppen hver pasient hadde 1,5 mutasjoner i gjennomsnitt, sammenlignet med 1,0 i den yngre aldersgruppen. Fordelingen av tumorstadier var noe skjevt mellom de to gruppene. Imidlertid er verken prosentandel av genomiske avvik, eller antall mutasjoner skilte mellom tumorstadier.
Kliniske foreninger
Ingen forskjell i overlevelse ble funnet sammenligne aldersgrupper, selv når du justerer for stadium ved diagnose. Det var en trend at andelen av endetarmssvulster ble redusert med økende alder (
P
= 0,08), og de yngre pasienter hadde en tendens til å ha en mer avansert tumor stadium enn eldre pasienter. Forekomsten av stadium III-IV svulster var 54%, 46% og 36% i 50, 51-70 og . 70 grupper, henholdsvis
I den totale prøvesett, tumorstadium var den mektigste prognostisk variabel med hensyn til tre års total overlevelse, (
P
0,001). I univariat analyse, pasienter med
TP53
muterte tumorer hadde dårligere overlevelse enn pasienter med villtype
TP53
, 938 ± 31 dager vs. 1016 ± 23 dager (
P
= 0.04), respektivt. Men denne forskjellen var ikke signifikant når man korrigerer for tumorstadiet.
TP53
mutasjoner var av høyere prognostisk betydning i høyresidig svulster, 1051 ± 26 dager vs. 883 ± 65 dager for villtype og mutert
TP53
, henholdsvis (
P
= 0.005).
Blant pasientene i den yngste aldersgruppen, de med
KRAS
mutasjon hadde signifikant kortere overlevelse enn pasienter med
KRAS
vill type prøver, 841 ± 101 dager vs. 1033 ± 35 dager (
P
= 0,02), henholdsvis. Ingen av de andre mutasjons parametrene viste noen statistisk signifikant forskjell med hensyn til overlevelse, verken innenfor eller mellom aldersgruppene.
Diskusjoner
Vi fant at mutasjonsstatus av en kjent kreft genet sett varierer i CRC pasienter avhengig av alder ved utbruddet av sykdom, og gi ytterligere bevis på forskjeller i den somatiske utviklingen av svulster hos yngre og eldre pasienter.
mikro ustabilitet status
i alle aldersgrupper, MSI var statistisk signifikant assosiert med høyresidig svulster, som forventet [18], [18], [31,32]. Frekvensen av MSI i den foreliggende serie var noe høyere enn rapportert andre steder [33], [34], som er best forklares ved en tilfeldig overskudd av høyre-sidede tumorer i total serie. Men for den gruppen av pasienter yngre enn 50 år på diagnose hyppigheten observert var noe lavere enn forventet [33], noe som delvis kan forklares ved å utelukke pasienter med kjente CRC syndromer i denne studien.
I pasienter som er yngre enn 50 år bare 50% av MSI prøvene ble mutert i ett eller flere av genene som ble analysert, mens det hos pasienter eldre enn 50 alle MSI eksempler som vises gen forandringer. I tillegg
BRAF
mutasjoner ble ikke statistisk signifikant assosiert med MSI i 50 år gruppe, i motsetning til hva som var forventet [35]. Mutasjonen i
BRAF
V600E er observert å indusere nedregulering av essensielle DNA reparasjonsgener [36], med potensial til å indusere MSI i cellen, forklarer denne sammenhengen. Som
BRAF
mutasjoner er ikke observert i svulster fra pasienter med Lynch syndrom [37], kan vi ikke utelukke at MSI /
BRAF
villtype prøver i dagens serie er fra klinisk uoppdaget Lynch syndrom pasienter.
Genmutasjoner
mutasjoner frekvenser i
KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN
, og
TP53
ble funnet å være innenfor tidligere rapportert rekkevidde støtte representativiteten av serien [38].
sameksistens av
BRAF Hotell og
KRAS
mutasjoner antas å være uforenlig med spredning, derav en negativ seleksjon for samtidig eksistensen av begge mutasjoner [12]. Vi gjorde bekrefte en invers korrelasjon mellom mutasjoner av disse to genene [39]. I tillegg et økende antall svulster med enten
KRAS eller BRAF
mutasjon ble observert med økende alder, i samsvar med en fersk rapport om unge pasienter med tykktarmskreft [6].
I total serien, svulster viser
BRAF
V600E ble typisk
TP53
villtype og
PTEN
mutert (tabell S1), som også var tilfellet for svulster innenfor 70 aldersgruppe. Dermed «
BRAF
V600E,
TP53
vekt,
PTEN
mut» kan betraktes som en funksjon av ekte sporadiske svulster.
i forhold til den rapporterte 14% frekvensen av
PIK3CA
mutasjoner i kolorektal karsinom i COSMIC databasen [38], viser gjeldende serien bare 4% mutasjoner. Dette kan delvis forklares ved at den nåværende serien er beriket med prøver fra unge pasienter, og deres svulster ikke har
PIK3CA
mutasjoner. Men dette er siste observasjon i motsetning til to tidligere studier [6], [40] som rapporterer to /ett pasienter yngre enn 50 år med
PIK3CA
mutasjoner. De ulike metoder som brukes, utvalgets type, formalinfiksert eller fersk frosset vev, og størrelsen av serien kan delvis forklare denne forskjellen i mutasjonsfrekvens blant studiene. Mutasjon i enten onkogen
PIK3CA
eller tumorsuppressorgenet
PTEN
kan føre til en opphopning av PIP
3, og nedstrøms AKT aktivering. Imidlertid, siden en endring i sekvens
PTEN
innebære en resterende villtype-allel, ytterligere aktiverende mutasjon i det samme reaksjonsvei kan være fordelaktig for tumorceller [41]. Vi fant 32 svulster med endring (er) i hver av
PIK3CA Hotell og /eller
PTEN
, inkludert syv svulster med flere
PTEN
avvik. Det hele kodende sekvensen til
PTEN
er blitt undersøkt [42] – [48], men ingen av de studier har undersøkt svulster fra unge pasienter spesifikt. Så vidt vi vet er dette den første rapporten som kombinerer
PTEN
hele kodesekvensdata med brutto sletting mønster i CRC fra ulike aldersgrupper.
TP53
mutasjonsfrekvens var signifikant høyere i 50 aldersgruppe, enn i de andre aldersgruppene, som er best forklart av høyere frekvens av venstre ensidige og endetarms kreft i 50 aldersgruppe. Som forventet,
TP53
mutasjoner ble assosiert med MSS svulster, og vesentlig forskjell mellom aldersgruppene var fortsatt gyldig når analysere MSS svulster bare.
En mutasjon indeksen ble beregnet og svulster fra eldre pasienter ble funnet å ha samlet flere gensekvensendringer enn de fra unge pasienter (1,5 vs 1,0) som kan tyde på en tidsforskjell på tumorutvikling.
Tydelig genetisk sminke av svulster fra unge og eldre pasienter
fra aCGH data på en undergruppe av 41 prøver, observerte vi at pasienter under 50 år hadde signifikant flere avvik i sine svulster enn pasienter 70 år gjorde,
dvs.
. en høyere grad av genomisk kompleksitet. Tvert imot, som nevnt ovenfor, tumorene fra eldre pasienter hadde høyest genmutasjon indeks, selv om denne gruppe inkluderte mindre avanserte stadier. Til sammen kan man spekulere at blant de unge pasientene er bærere med genetisk disposisjon påvirker gener som koder for proteiner som sikrer korrekt kromosom segregering under mitose, snarere enn konkrete veier.
Bardelli
et al.
[29] rapporterte at pasienter med metastaserende sykdom som er «quadruple negative» i
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN
genet sett har høyest sannsynlighet for respons på anti-EGFR terapi. Men foreløpig bare
KRAS
testing anbefales før beslutning med hensyn til slik behandling, og
BRAF
testing er valgfritt [49].
I denne serien av primær kreft, mutasjoner frekvenser i disse fire genene ble likt fordelt mellom alle kreft etapper. Derfor har vi i det følgende hypotese antall potensielle respondere basert på hele datasettet (figur 2). Når du vurderer svulster med nedsatt
PTEN Hotell og /eller muterte
PIK3CA
utelukkende, vises den yngste aldersgruppen 16% (n = 7) mutasjoner, sammenlignet med 1,4% (n = 1) i eldste aldersgruppen. Dette innebærer at for eldre pasienter,
KRAS Kjøpe og
BRAF
mutasjonsstatus alene vil avsløre 98% av pasientene uegnet for anti-EGFR terapi, sammenlignet med 71% hos pasienter 50 år . Effekten av mutasjoner i
PIK3CA Hotell og
PTEN
er diskutert med hensyn til anti-EGFR terapi [26], [28], [29]. Men dersom deres mutasjonsstatus ikke påvirke effekten av anti-EGFR behandling, de yngre pasientene vil bli forventet å ha en enda større andel av potensielle respondere til denne type behandling enn de eldre pasienter (figur 2).
Prosentmessig messig~~POS=HEADCOMP fordeling av avvik for
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA Kjøpe og
PTEN Kjøpe og deres kombinasjoner, i 50 aldersgruppe og ved 70 aldersgruppe. Pasienter negative for alle mutasjoner (firemannsrom negativ) er potensielle respondere til anti-EGFR-terapi. (Modifisert fra Bardelli
et al. Product: [
29
])
Foreningen til kliniske data
Den påfølgende prøven serie kolorektal karsinom fra et enkelt sykehus viste samlede fordelingen av clinicopathological data som forventet for en norsk kohort [1]. Andelen av endetarms kreft reduseres med økende alder ved debut, mens det motsatte trenden ble sett for høyresidig svulster, som rapportert av andre [50], [51]. Videre, en større del av pasientene diagnostisert før fylte 50 år hadde mer avansert stadium av sykdommen i forhold til de eldre aldersgruppene. Dette kan reflektere at CRC er uventet hos unge voksne, og symptomene er neglisjert både av pasienten og legen [52]. Rapporter om unge pasienter med kolorektal kreft er forskjellig med hensyn til aggressiviteten av sykdommen, og følgelig utfall [3], [52], [53]. Men i denne studien, treårs total overlevelse var lik i de tre aldersgruppene, selv når du justerer for tumorstadium. Dette kan tyde på en mer aggressiv sykdom hos unge pasienter, som eldre mennesker er ventet å ha en høyere dødelighet. Videre er den observerte høyere grad av genomisk kompleksitet i tumorer fra unge sammenlignet med eldre pasienter også kan være en indikasjon på en forskjell i aggressivitet. Det bør bemerkes at de unge pasientene inkludert er ikke bærere av kjente kolorektal kreft syndromer etter bare kliniske kriterier.
Den prognostiske og prediktive verdien av
TP53
er fortsatt kontroversiell [54]. I våre datasett pasienter med
TP53
mutasjoner hadde signifikant kortere overlevelse enn villtype pasienter. Videre, for pasienter med høyresidig eller MSI svulster
TP53
mutasjoner viste enda større prognostisk verdi, i tråd med resultater rapportert av
TP53
-CRC samarbeidsstudie gruppe [55].
i en fersk undersøkelse,
PIK3CA
mutasjoner ble funnet å tjene som surrogatmarkører for dårlig overlevelse i pasienter med kolorektal kreft [24]. Som noen
PIK3CA
mutasjoner ble observert i vårt prøvesett, kan vi ikke bekrefte disse resultatene. Men mutasjoner ble funnet bare i prøver fra eldre pasienter, og var ikke til stede hos pasienter med fjernmetastaser, og bare noen få i stadium III pasienter. Dermed våre data tyder på at
PIK3CA
mutasjoner er viktig for tumordannelse hos eldre pasienter, men ikke tjene som en markør for muligheten til å spre.
Konklusjon
Vi har fant tydelige forskjeller i den genetiske make-up av karsinomer fra yngre og eldre pasienter. Svulstene fra unge pasienter som ikke er bærere av kjente arvelige CRC syndromer har mindre genmutasjoner, men flere eksemplar nummer avvik over hele genomet. Disse data tyder på at noen unge pasienter kan ha en potensiell økt risiko for kreft forårsaket av endringer i gen (er) som er involvert i å opprettholde riktig kromosom segregering.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag inkludert. De forskningsbiobanker er registrert i henhold til nasjonal lovgivning og forskningsstudier er godkjent av Regional komité for medisinsk forskningsetikk (REK Sør-Øst: 1.2005.1629; REK Sør, 2003: S-02126)
Pasienter. og tumorprøver
totalt 181 pasienter ble inkludert i studien,
dvs.
en rekke av 132 pasienter beriket med en serie av 49 pasienter med sykdom i ung alder ( 50 år ). Hver serie er beskrevet i de følgende avsnittene. Kliniske data ble samlet inn prospektivt. Død data ble hentet fra enten sykehus poster eller fra Norsk Folkeregisteret. De kliniske og patologiske data fra disse to seriene er vist i tabell S3.
Fortløpende serie (n = 132).
Pasienter som gjennomgår elektiv reseksjon av kolorektal adenokarsinom i 2005-2007 ved Oslo universitetssykehus Aker, Oslo, ble inkludert. Pasienter med FAP- eller Lynch syndrom ble ekskludert basert på kliniske kriterier. Tumorvev ble prøvetatt umiddelbart etter reseksjon av prøven og umiddelbart frosset i flytende nitrogen. Alle vevsprøver ble evaluert av en patolog for å etablere differensiering karakteren av karsinom og tumor celleinnhold.
Tidlig debut serie (n = 49).
Prøver fra en biobank fra en multi-sykehus studie (INFAC-studie – personer med familiær risiko for kreft), inkludert Oslo universitetssykehus, Aker, Oslo og fem andre sykehus i samme geografiske region av Norge innrullert 2003-2008, ble inkludert i studien. Inklusjonskriteriene i INFAC-studien var alders 55 år, med unntak av de som oppfylte kriteriene for alle kjente CRC syndromer. Svulstvev og tilsvarende normal slimhinne prøver ble tatt fra resected prøven i operasjonen teater og raskt inkuberes i RNAlater. Vevet ble overført til nye rør etter 36-72 timer, og lagret ved minus 80 ° C inntil bruk. DNA fra normale og cancerøse vev ble ekstrahert og anvendt for analyse.
Prøver med i CGH analyse.
For en undergruppe av pasienter (n = 41) data fra aCGH analysene var tilgjengelig. Dette undergruppe inkluderte 24 pasienter yngre enn 50 år, og 17 eldre enn 70 år ved primærdiagnose. Kliniske og mutasjons data for disse pasienter er presentert i Tabell S2.
Gruppering av pasienter i henhold til alder.
Pasientene fra tidlig debut serie ble inkludert for å berike antall tidlig debut pasientene i total prøvesett. Pasienter fra tidlig debut serien ble valgt for å matche pasienter yngre enn 55 år i sammenhengende serie med hensyn til kjønn, median alder, tumorstadium og lokalisering, tabell S3. Deretter ble prøver fra de to seriene kombinert og delt inn i tre aldersgrupper; under alder 50 år, 51 til 70 år og over 70 år, omtalt som 50, 51-70 og 70, henholdsvis. Gjennomsnittlig alder ved primærdiagnose var 70 år i sammenhengende serie, og som ble valgt som cutoff for den eldste aldersgruppen. Den cutoff for den yngste aldersgruppen ble satt til 50 år, siden tidlig debut kan skyldes arvelige genetiske faktorer, og bare ~ 5% av alle CRC diagnostisert før 50 års alder. Svulster i tykktarmen proksimale til milten flexure ble definert som høyresidig: de i de resterende tykktarmen ble betraktet som venstre-sidig mens rektum ble definert som 15 cm fra analåpningen når målt med en stiv proctoscope. Lokalisert sykdom ble definert for UICC /AJCC stadium I og II og regional sykdom for trinn III og IV.
mikro ustabilitet analyse
For alle pasienter, tumor og tilsvarende normale vev eller blod ble analysert ved hjelp Bethesda markører [56]. Analysen ble utført som beskrevet av Wu
et al.
[57]. Høy grad av ustabilitet mikro (MSI-H) i tumor-DNA, sammenlignet med tilsvarende normal-DNA, ble definert dersom to eller flere markører viste avvikende topp-profil etter fragmentanalyse. Hvis både den normale prøven og tumorprøve fra en pasient viste det samme mønster for alle markører, ble tumoren ansett mikro stabil (MSS).
Mutasjonsanalyse for KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN og TP53
for
BRAF Hotell og
KRAS
, aktive mutasjoner i posisjonene er kjent for å ofte bære endringer er rapportert [11], [58]. I
PIK3CA
genmutasjoner i kolorektal kreft klynge i eksoner 9 og 20 [59], og for
TP53 Hotell og
PTEN
mutasjoner rapporteres gjennom hele kodende sekvens [ ,,,0],17], [60].
For
TP53 Hotell og
PTEN
, den totale kodende sekvens ble forsterket i multipleks PCR reaksjoner, ved hjelp av multipleks PCR kit som anbefalt av leverandøren (Qiagen, GmbH, Hilden, Tyskland) [30], [60]. Singleplex PCR reaksjoner ved bruk HotStar Taq (Qiagen) ble brukt til å forsterke
PIK3CA
,
KRAS Hotell og
BRAF
amplikonene [10], [59], [61]. I
PIK3CA
eksoner 9 og 20 ble forsterket i
KRAS
, eksoner 2 og 3, inkludert de ofte muterte kodon 12, 13 og 61, og i
BRAF
exon 15, omfattende mutasjonen i kodon 600, ble amplifisert. Grunning, driftsforhold og fragment detaljer er beskrevet i tabell S4.
PCR-produkter ble renset ved hjelp av Sephadex kolonner (Millipore, Bille, MA, USA og GE Healthcare, Chalfont St.Giles, UK) før inkorporering av fargestoff merket ddNTP og sekvensering på 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [30]. I tilfeller hvor en mutasjon ble oppdaget, ble en ny uavhengig PCR produkt utsatt for sekvensering for å bekrefte resultatet.
Multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MLPA) av PTEN
Salsa MLPA kit P225- B2 PTEN (MRC Holland, Amsterdam, Nederland) ble brukt i henhold til instruks fra distributøren. Totalt 25 sonder dekke
PTEN
genet, minst to prober for hver av de ni eksoner. Også, 10 prober som finnes andre steder på kromosom 10, og ytterligere 12 referanse sonder plassert på andre kromosomer tjener som kontroller. Amplifiserte fragmenter ble analysert på en 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Rådata ble analysert med Coffalyzer® (MRC Holland) med standardinnstillinger. Cutoffs på 1,2 og 0,8 ble brukt for scoring av gevinster og tap, henholdsvis, i tillegg til individuell vurdering av tomten fra hver prøve. Dette scoring fastsettes i henhold til følgende regnestykke: en kopi gevinst eller tap i 60% av cellene i en triploid svulst tilsvarer 1,2 og 0,8, henholdsvis. Minst to nabo sonder, som ligger i samme ekson, med samtidig gevinst eller tap, var begrenset for tildeling av avvikende eksemplar nummer i en region.
Statistiske analyser
Kliniske variabler ble testet for assosiasjoner mutasjons resultater for alle gener analysert, og alle genene ble testet for inter-relasjonelle foreninger. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av programvarepakken PASW 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Fishers eksakte test ble anvendt for kryss ordnet variabler.
