Abstract
Det er en økende trend for forskere å bruke
in vitro
3D-modeller i kreftstudier, som de kan bedre rekapitulere komplekset
in vivo
situasjon. Og det faktum at den progresjon og utvikling av tumor er nært knyttet til sin stromal mikromiljø er blitt mer og mer anerkjent. Etableringen av en slik svulst støttende nisje er viktig å forstå svulst fremgang og metastasering. Den mesenchymale opprinnelse mange celler bosatt i kreft nisje gir begrunnelsen for å inkludere MSC i ligne nisje i neuroblastom. Her co-kapsle vi og co-kultur NBCs og MSC i en 3D
in vitro
modell og undersøke morfologi, vekstkinetikk og matrise ombygging i den rekonstituerte stromal miljø. Resultatene viste at innlemmelse av MSCene i modellen fører til akselerert vekst av kreftceller, samt gjentagelse av i det minste delvis svulsten mikromiljøet
in vivo
. Den aktuelle studien viser derfor muligheten for kollagen mikrosfære til å fungere som en 3D
in vitro
kreft modell for ulike emner i kreftstudier
Citation. Yeung P, Sin HS, Chan S, Chan GCF, Chan BP (2015) microencapsulation av neuroblastom celler og Mesenchymale stromale celler i Kollagen Mikrokuler: En 3D-modell for Cancer Cell nisje Study. PLoS ONE 10 (12): e0144139. doi: 10,1371 /journal.pone.0144139
Redaktør: Stan Gronthos, The University of Adelaide, AUSTRALIA
mottatt: 21 august 2015; Godkjent: 14 november 2015; Publisert: 14.12.2015
Copyright: © 2015 Yeung et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ved hjelp av 2D monolagkulturer kreftcellelinjer som en enkel modell for å studere kreftforskningen kan spores tilbake til 1950-tallet [1, 2]. Men, i likhet med friskt vev, tumorvev er 3D enheter med celler, ekstracellulære matrise og andre mikromiljøet. Til dags dato, er det generelt enighet om at monolaget cellelinjen kultur dårlig representerer
in vivo
fenomen [3], hvor celle-celle og celle-matriks-interaksjoner eksisterer derfor å begrense dens evne til å forutsi kreftcellerespons i virkelighet [4].
i de senere årene, er det en økende trend for forskere å bruke
in vitro
3D-modeller i kreftstudier [3, 5, 6] på temaer som svulstens mikromiljø [7], angiogenese [8] og metastase [9]. Disse modellene har kuler [10] og kuler [11, 12]. De støtter co-kultur av flere celletyper, gjør at celle-celle og celle-matrise interaksjoner, og dermed bedre bevare
in vivo
karakteristikker av svulstvev. Noen modeller er i stand til å etablere den strukturelle diversitet av tumorvev med soner av prolifererende, hvilende eller nekrotiske celler [4]. Evnen til disse 3D-modeller for å inkludere flere nisje faktorer gjør delvis gjentagelse og nær likhet av
in vivo
mikromiljøet av kreftceller [4, 13, 14], som bidrar til tumorsykdom modellering og personlig kjemoterapi screening i lange løp.
tumorer ikke er homogene organer, men meget komplekse vev, som involverer forskjellige celletyper, inkludert, men ikke begrenset til cancerceller, kreft progenitorceller, endotelceller, inflammatoriske celler og cancerassosierte fibroblaster [3, 15-17 ]. Bortsett fra de prolifererende neoplastiske parenkymceller (kreftceller), det støttende stroma laget av celler av mesenchymale opprinnelse kan utgjøre halvparten av stromal masse [3]. Progresjon av kreft ikke utelukkende avhenge av cancerceller, men også på stromale celler som befinner seg i tumoren mikromiljøet [18, 19]. Det har vist seg at multipotente stamceller (MSC) ligge i voksent vev [20, 21]. Selv om hvorvidt disse cellene stammer fra benmargen er fortsatt kontroversielt, men nær likhet med MSC med pericytes langs blodkar veggen og gir en annen tiltalende forklaring [22, 23]. Økende bevis viser at kreft assosiert stroma spesielt fibrinoblast celler akselerert tumorvekst [3] og fremmet en givende mikromiljøet for kreft metastase [24, 25]. Noen funn tyder på at mesenchymale stamceller (MSC) ville transitt fra benmargen til svulst under svulst utvikling [26-29]. Ikke desto mindre, er rollen til MSC i tumorgenese fremdeles kontroversiell [26, 30-33]. En velkjent oppfatningen er at det heterotypic samspillet mellom flere celletyper er nødvendig for nøyaktig likhet med
in vivo
svar. For å oppnå dette målet, 3D-modeller gjør det mulig samspill mellom flere celletyper er attraktive i å studere slike kompliserte interaksjoner.
Vi har tidligere etablert en kollagen microencapsulation plattform, som fanget i levende celler innenfor en rekonstituert nanofibrous kollagen meshwork [34 ]. Kollagen nettvaren er biokompatibel, og gir et fysiologisk relevant mikromiljøet ettergivende for celleadhesjon, proliferasjon, migrering og differensiering i et bredt spekter av celler inkludert MSCer [34-37], HEK293-celler [38], embryonale stamceller [39], [kondrocytter ,,,0],40], kjernen pulposus celler [41] og osteoblaster [42]. En stor fordel med kollagen mikroinnkapsling modellen er det faktum at malen kollagen nettvaren støtter matrise remodellering, som refererer til samtidig nedbrytning og avsetning av ekstracellulær matriks, når dyrking av modne celler og differensierende stamceller i 3D. Dette begrunner sterkt dens nytte i å opptre som en modell rekapitulere
in vivo
cellulær mikromiljøet i løpet av strukturelle og funksjonelle vev formasjon. En annen stor fordel med kollagen mikroinnkapsling er de kontrollerbare og miniatyrisert (flere hundre mikron i diameter) størrelse [34] som et mikro-vev består av flere hundre celler muliggjør evnen til på økonomisk, personlig og high throughput screening.
Nevroblastom (NB) er en pediatrisk kreft sto for 6% av alle kreftformer som finnes i barn [43]. NB mikromiljøet består av ekstracellulær matriks, stromale fibroblaster, vaskulære celler og immunceller [3]. Nærmere bestemt har stromale fibroblaster blitt vist å øke tumor-vekst, angiogenese og metastase [44, 45]. Rapporter viser også at co-kulturen i neuroblastom celler (NBCS) med andre celletyper vil føre til vesentlig forskjellige virkemåter. For eksempel, ikke-kontakt co-kulturen i NBCs med hepatocytter føre til mindre apoptose aktivitet og høyere VEGF uttrykk [46, 47]. I et annet eksempel, co-kulturen i NBCs med HUVEC redusert detectability av kreftceller til å nøytrofile [48]. Dessuten har kryss samtaler mellom NBCS og Schwann celler er vist å stimulere NB differensiering, redusere aggressivitet av svulsten [49, 50] Shedding lys på nye terapeutiske strategier. På den annen side har noen rapporter vist at tilstedeværelsen av MSC ville øke invasivitet av neuroblastom [27, 51, 52]. Selv om rollen til MSC på neuroblastom ikke er helt kjent, betyr tilstedeværelsen av MSC føre til atferdsendring i NBCs. I mellomtiden, selv om alle disse studiene har vist at NBCs aktivt samvirke med andre celletyper, disse forsøk er alle utført i 2D modeller. En 3D-modell givende til NBCs vekst og spredning, samt interaksjoner med stromale celler har ennå ikke blitt rapportert. I denne studien hypotese vi at det ko-mikroinnkapsling av NBCs med MSC i kollagenmikrokuler vil rekapitulere, i det minste delvis, svulsten mikromiljøet
in vivo
. Spesielt ønsker vi å undersøke morfologi, vekstkinetikk og matrise ombygging i co-mikroinnkapslingsreaksjonen miljø.
Nevroblastom (NB) er en pediatrisk kreft sto for 6% av alle kreftformer som finnes i barn [43]. NB mikromiljøet består av ekstracellulær matriks, stromale fibroblaster, vaskulære celler og immunceller [3]. Nærmere bestemt har stromale fibroblaster blitt vist å øke tumor-vekst, angiogenese og metastase [44, 45]. Rapporter viser også at co-kulturen i neuroblastom celler (NBCS) med andre celletyper vil føre til vesentlig forskjellige virkemåter. For eksempel, ikke-kontakt co-kulturen i NBCs med hepatocytter føre til mindre apoptose aktivitet og høyere VEGF uttrykk [46, 47]. I et annet eksempel, co-kulturen i NBCs med HUVEC redusert detectability av kreftceller til å nøytrofile [48]. Dessuten har kryss samtaler mellom NBCS og Schwann celler er vist å stimulere NB differensiering, redusere aggressivitet av svulsten [49, 50] Shedding lys på nye terapeutiske strategier. På den annen side har noen rapporter vist at tilstedeværelsen av MSC ville øke invasivitet av neuroblastom [27, 51, 52]. Selv om rollen til MSC på neuroblastom ikke er helt kjent, betyr tilstedeværelsen av MSC føre til atferdsendring i NBCs. I mellomtiden, selv om alle disse studiene har vist at NBCs aktivt samvirke med andre celletyper, disse forsøk er alle utført i 2D modeller. En 3D-modell givende til NBCs vekst og spredning, samt interaksjoner med stromale celler har ennå ikke blitt rapportert. I denne studien hypotese vi at det ko-mikroinnkapsling av NBCs med MSC i kollagenmikrokuler vil rekapitulere, i det minste delvis, svulsten mikromiljøet in vivo. Spesielt ønsker vi å undersøke morfologi, vekstkinetikk og matrise ombygging i co-mikroinnkapslingsreaksjonen miljø.
Metoder
Nevroblastom cellekultur
Nevroblastom cellelinjen var en slags gave fra Dr. NKV Cheung fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center i USA. Celler ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med høy glukose (Gibco), med tilskudd av 10% føtalt bovint serum (Gibco), 1% penicillin streptomycin (Gibco), 1% glutar-max (Gibco).
Mesenchymale stilk /stromal celle (MSC) kultur
Menneskelige MSC fra benmarg [53] var velvillig gitt av Prof. GCF Chan, Institutt for pediatri og unges medisin, Universitetet i Hong Kong og dyrket som monolag som tidligere beskrevet [53]. Den nåværende protokollen er godkjent av den kombinerte klinisk etikk-komité ved University of Hong Kong og Hong Kong West Cluster Hospitals of Hospital Authority. I korte trekk, ble MSC dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator i DMEM med lav glukose (Gibco), med tillegg på 10% føtalt bovint serum (Gibco), 1% penicillin streptomycin (Gibco) og 1 % glutar-max (Gibco). Vekstmediet ble erstattet hver 3-4 dager. På rundt 80% konfluens, ble hMSCs isolert ved trypsinering med 0,05% trypsin-EDTA-kort (1X) (Gibco) før re-suspendering i fullstendig medium for etterfølgende eksperimenter. Celler på P6 ble brukt for senere eksperimenter.
Kollagen microencapsulation
Celler ble mikroinnkapslet som tidligere rapportert [34]. I korte trekk, HMSC og NBCs ble dyrket til sub-konfluens og ble deretter avspaltes ved behandling NBCs og MSC med 0,25% og 0,05% trypsin-EDTA (1X) (Gibco) i 5 minutter. NBCs og MSC ble blandet på ulike forhåndsbestemte Skjermstørrelse (NBCs: 100, 80, 50, 20 og 0%) før microencapsulation. Rottehale type I kollagen (Becton Dickenson Biosciences, Bedford, MA) ble nøytralisert med 0,1 N NaOH og fortynnet til forskjellige sluttkonsentrasjoner (0,5, 1 og 2 mg /ml). Celleblandinger ble suspendert i nøytralisert kollagen løsning for å gjøre opp celle-matriks-blandinger med forskjellige endelige celletettheter (2.5x10e5, 5x10e5 celler /ml og 1x10e6 celler /ml, tilsvarende 1250, 2500 og 5000 celler /5 ul dråpe, henholdsvis). Væskedråper av celle-matriks-blandingene ble avsatt på en ikke-klebende overflate, som er UV-bestråles parafilm i en 90-mm diameter petriskål (STERILIN, London, United Kingdom), og deretter inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 for 45 minutter for å indusere gelering. Gelated kollagen mikrokuler som inneholder både NBCs og MSC ved forutbestemte forhold ble forsiktig spylt med en ko-kulturmedium inn i en petriskål for frittflytende suspensjonskulturer av forskjellig varighet (7, 14 og 21 dager). Totalt 100 mikrokuler ble dyrket i hver petriskål. Den ko-kulturmedium ble blandet ved NBC og MSC kulturmedium ifølge celle innkapsling forhold, etterfylles etter 2-3 dager.
Måling av dimensjonen av de celle-matriks-mikrokuler
Tids morfologisk endring av de NBC-MSC-kollagen mikrokuler ble ført under et fasekontrastmikroskop opp til 21 dager. Diameteren på ca 10% av mikro populasjoner ble tilfeldig valgt ut og måles ved hjelp av et øye-brikke mikrometer.
Vekst kinetikk celler
Hver 200. sfærer ble innkapslet med 2.5e5 celler med forskjellig NBC : MSC forholdstall på dag 0, og de ble dyrket i 7, 14 og 21 dager. På hvert tidspunkt ble 200 mikrokuler fra hver gruppe spaltet enzymatisk ved kollagenase fra Clostridium histolyticum (Sigma) ved 200 enheter /ml for 45-60 min. Enkeltceller suspensjoner ble oppnådd ved behandling av fordøyd aggregatene med 0,25% trypsin-EDTA (1X) (Gibco) før numeration ved trypan blå analyse. Veksten av celler i mikrosfærer kan deretter beregnes.
Flowcytometri analyse på hvor stor andel av NBCs
Enkeltcellesuspensjoner (1x10e6 celler) hentes fra collagenase-trypsin fordøyelsen av NBC-MSC- kollagen mikrokuler ble re-suspendert i 500 mL av ko-kulturmedium, inkubert ved romtemperatur i en time for å tillate gjenvinning av celleoverflateprotein ekspresjon, og ble deretter fiksert med 0,01% PFA i 15 minutter. Cellene ble deretter blokkert med 2% geiteserum (Vector Laboratories) i PBS i 30 minutter før indirekte farging av antistoffer. Til hver prøve, 1 ul av mus monoklonalt antistoff mot Neuroblastom (NB84a, Abcam) i 2% geiteserum (fortynning 1: 100) ble tilsatt. Isotype kontroller (normal mus IgG antistoff, Millipore) ble utført på hvert tidspunkt. Etter beising ved romtemperatur i 30 minutter, ble 1 ml PBS tilsatt til hvert rør for å vaske av det overskytende antistoffer. Etter sentrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter, supernatanten ble fjernet og 0,5 ul av Alexa Fluor 647 geite-anti-muse-sekundært antistoff (Invitrogen) i 2% geiteserum (fortynning 1: 200) ble tilsatt til hver prøve. Etter farging i mørket ved romtemperatur i 30 minutter, ble 1 ml PBS tilsatt til hvert rør for å vaske av det overskytende antistoffer. Etter sentrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter, supernatanten ble fjernet og cellepelletene ble resuspendert og bevart i 500 ul 1% PFA ved en celletetthet ikke mindre enn 4x10e5 celler /ml for strømningscytometri-analyse i FACSCanto II Flowcytometer (BD Biosciences, Bedford , MA). 10.000 hendelser av hver prøve ble analysert. Resultatene ble analysert med Flowing Software 2.5.1.
Histologi og immunhistokjemi av NBC-MSC-kollagen sfærer
NBC-MSC-kollagen mikrosfærer ble løst i 4% PFA ved romtemperatur i mørket for 30 minutter og ble dehydrert ved hjelp av en seriell gradient etanol behandling før behandling for parafinsnitt av 5 um tykkelse. Rutinemessig hematoxylin og eosin (Sigma) farging ble gjennomført for å avsløre cellens morfologi i mikrokulene. For å evaluere tilstedeværelsen av NBCs, et primært antistoff (ab49501, Abcam) ble anvendt. Anti-muse-sekundært antistoff (BA-1000, Vector Laboratories) ble anvendt i immunhistokjemi, etterfulgt av ABC-farging, diaminobenzidin merking, og kontra ved hjelp av hematoxylin. For å evaluere tilstedeværelsen av type I kollagen, et primært antistoff (C2456, Sigma), ble anvendt. Anti-muse-sekundært antistoff (BA-1000, Vector Laboratories) ble anvendt i immunhistokjemi, etterfulgt av ABC-farging, diaminobenzidin merking, og kontra ved hjelp av hematoxylin. For å evaluere nærværet av matriks-metalloproteinase 9, et primært antistoff (ab38898, Abcam) ble anvendt. Anti-kanin sekundært antistoff (BA-2000, Vector laboratorier) ble brukt i immunhistokjemi, etterfulgt av ABC flekker, diaminobenzidine merking, og kontra hjelp hematoxylin.
dataanalyse og statistikk
Kvantitative resultater inkludert microsphere dimensjon, celletall og NBC proporsjoner ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik hvis ikke annet er angitt. To-veis ANOVA med passende post hoc tester ble benyttet for å avdekke statistisk signifikante forskjeller mellom forskjellige grupper. Signifikansnivået ble satt til 0,05 og SPSS 19.0 (IBM, NY, USA) ble brukt til å utføre statistisk analyse.
Resultater
Morfologisk karakterisering av NBC-MSC-kollagen sfærer
fig 1A1-1E6 viser brutto utseende NBC-MSC-kollagen mikrosfærer i forskjellige grupper. De sfæriske skinn var like i begynnelsen av kulturen, men ble variert på senere tidspunkt, som mikrokuler i grupper med høyere start NBC andel gradvis mistet sin kuleform og ble uregelmessig i konformasjon, noe som tyder på overvekst. Under kultur, ble ørsmå mikro masser i suspensjon observert i NBC 100%, 80% og 50% grupper etter den første uken. Mens i NBC 20% gruppe, observerbare masser dukket opp etter den andre uken. The NBC 80% gruppen hadde relativt større mengde mikro masser enn i andre grupper. Det var ingen overgrowth mikro massene i NBC 0% gruppen (100% MSC gruppe). Figur 1F viser endringen i dimensjonen av mikrokulene under kultur. Det var betydelig sammentrekning av mikrokulene i den første uken for alle grupper, etterfulgt av økninger i diameter i alle kreftceller inneholdende grupper, noe som tyder på at tumorigen vekst. I mellomtiden, fusjon og aggregasjon av mikrokuler er observert. Diagrammet viser også at graden av sammentrekning og utvidelse er avhengig av NBCs innhold. Alle grupper unntatt NBC 100% en dramatisk redusert i størrelse i den første dagen etter innkapsling. Sfærer som inneholder sunne MSC bare (NBC 0%) kontinuerlig nedgang i størrelse over tid. Den NBC 20% gruppen viste en konstant dimensjon etter at begynnelsesfallet i størrelse, mens grupper med 50% eller mer NBCs begynte å øke i størrelse etter 7 dager, noe som tyder på rask vekst av tumorcellene. To-veis ANOVA viste at både tidsfaktoren (p 0,001) og NBC: MSC-forhold (p 0,001) betydelig påvirket dimensjonen av mikrokulene. Bonferroni post hoc tester viste at bortsett fra day1-day14 (p = 0,518) og day3-day7 (p = 1.000) par, alle andre sammenligninger var statistisk signifikant forskjellig fra andre (p 0,001), mens alle NBC: MSC forhold grupper var statistisk signifikant forskjellig fra andre (p 0,001)
Mikrokuler med ulik andel av NBCs og dermed NBC. MSC forhold: (a): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (20% MSC) og (E): 100% NBC (0% MSC) ble dyrket i forskjellige tidsrom: 0 (A1, B1, C1, D1, E1); 1 (A2, B2, C2, D2, E2); 3 (A3, B3, C3, D3, E3), 7 (A4, B4, C4, D4, E4), 14 (A5, B5, C5, D5, E5) og 21 (A6, B6, C6, D6, E6 ) dager (skala barer: 100 pm: A2, A3, A4, A5, A6, B2, B3, B4, B5, B6, C2, C3, C4, C5, D2, D3, D4, 500 um: A1, D5, E3, E4, E6, 1000 um: B1, C1, C6, D1, D6, E1, E2, E5); (F): Linje diagram som viser tidsmessig endring i dimensjon (gjennomsnitt ± 1SD) av NBC-MSC-kollagen mikro populasjoner under kulturer
Morfologiske endringer av NBC-MSC-kollagen sfærer på forskjellig. NBC: MSC forholdstall, tidspunkter, initial celletetthet og kollagen konsentrasjon
figur 2 viser H E farging av NBC-MSC-kollagen sfærer med ulike innkapsling forhold og ved ulike tidspunkt i løpet av kultur. 0% NBC (ren MSC) gruppen viste stadig kompakte strukturer med tilfeldig fordelt MSC for inntil 2 uker (Fig 2A1 og 2A2), mens de fleste av de sfærer viste fullstendig frafall på 21 dager med kultur. Grupper med økende NBC: MSC forhold (20, 50 og 80%) (fig 2B1-2D3) viste en lignende trend at de segregert i to forskjellige lag av vev. I korte trekk, ved 7 dagers dyrking, et lag av celler pakket i nærheten av kollagen mikrokuler, hvor celler med lavere densitet var til stede (figur 2B1, 2C1 og 2D1). I 20% NBC gruppe, synes det å være en høyere andel av celler med langstrakt morfologi på 7 dager (Fig 3b1), mens relativt avrundede celler med høy celletetthet og lav matriksdensitet var dominerende på senere tidspunkter (Fig 2B2 og 2B3) . Videre er mikro-vevet masser ble fortsatt stort sett sfærisk form. I 50% NBC gruppe, figurer av mikro massene var uregelmessige og høy tetthet cellepopulasjoner synes å vokse kollagen mikrosfære og flere celler invadert inn i kollagen sfærer ved økende tid (Fig 2C1-2C3). I 80% NBC-gruppe, et tynt lag av celler med høy tetthet var innkapsle mikrokulene, som inneholder flere cellegrupper og «hulrom» ved 7 dagers dyrking (figur 2D1). Etter 14 og 21 dager, strukturer var meget uregelmessige i form og høyporøst med celler pakket med høy tetthet gjennom hele strukturen, mens de kollagenmikrokulene synes å være desintegreres (Fig 2D2 og 2D3). En forstørret bilde av Fig 2D3 viste tydelig høy tetthet cellelaget og mindre tett regionen (figur 2F). I 100% NBC gruppe, strukturen var fremdeles sfærisk men sterkt kompaktert ved 7 dager (fig 2E1), mens de kollagenmikrokulene var fullstendig revet fra hverandre i senere tidspunkter med meget porøse og irregulære strukturer med lav celletetthet (Fig 2E2 og 2E3) .
(A): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: dag 7; A2, B2, C3, D2, E2: dag 14; B3, C3, D3, D3a, E3: dag 21 etter kultur (Scale barer: 100 mikrometer)
(A1-A3):. 1250 celler /mikrosfære; (B1-B3): 2500 celler /mikrosfære; (C1-C3): 5000 celler /mikrosfære; 1: 7 dager; 2: 14 dager; 3: 21 dager (skala barer: 100 mikrometer)
Figur 3 viser H E farging av NBC-MSC-kollagen sfærer på ulike innkapsling celletettheter når NBC ble satt til 80%.. Ved 1250 celler per mikrokule,-celler synes å være innkapslet i kollagen mikrokule, mens et tynt lag av celler omfattet periferien av mikrosfære ved tidlig tidspunkt (7 dager) (Fig 3A1), men ved senere tidspunkter, ble uregelmessige celle utvekster funnet slik at bare meget få celler i mikrosfære (fig 3A2 og 3A3). Ved høyere celletettheter (2500 og 5000 celler per mikrosfære), ble åpenbare hulrom funnet i kollagen sfærer med tettpakkede celler i uregelmessig formede utvekster rundt mikrosfære 7 dager (Fig 3b1 og 3c1). . Ved senere tidspunkter, de utvekster ble større og mer porøse (Fig 3B2, 3B3, 3c2 og 3C3)
Figur 4 viser H E farging av NBC-MSC-kollagen sfærer med ulike kollagen konsentrasjoner. En høyere konsentrasjon kollagen synes å innkapsle cellene bedre innenfor mikro mens et tynt lag av celler som vokste ved periferien av mikrokulen (Fig 4B1). Etter 14 dager var uregelmessig og massiv utvekst som finnes i den nedre kollagen konsentrasjon gruppe (figur 4A2), men tette kolonier av celler og hulrom ble funnet i mikrokulene i den høyere collagen-konsentrasjon (fig 4B2).
(A ): 1 mg /ml; (B): 2 mg /ml; 1: 7 dager; 2: 14 dager (skala barer: 100 mikrometer).
Vekst kinetikk i NBC-MSC-kollagen sfærer
Fig 5A viser linjen grafen på celle nummer i NBC-MSC -collagen sfærer med ulike NBC: MSC forholdstall på ulike tidspunkter i løpet av co-kultur. Sfærer med 0% NBC, dvs. 100% MSC viste en kontinuerlig nedgang i celle nummer. På den annen side er alle grupper som inneholder kreftceller viste en positiv vekst over tid. 20%-gruppen viste en gradvis økning i de første 2 uker, og alle i en plutselig antallet økt dramatisk eksponensielt på dag 21. Den 100% NBC-gruppen (0% MSC) viste signifikant økning i tidlige kulturer på dag 7 enn andre grupper, men som ikke gi denne gruppen videre vekst fordel i senere dager. Lignende trender ble funnet i 50% og 80% NBC: MSC grupper. Toveis ANOVA viste at både tidsfaktoren (p 0,001) og NBC: MSC ratio faktor (p 0,001) betydelig påvirket celle nummer. Bonferroni post hoc tester viste at 0% NBC (100% MSC) signifikant forskjellig fra alle andre grupper (p = 0,003). 20% NBC-gruppen viste signifikante forskjeller på 0% (p = 0,003), 80% (p = 0,033) og 100% (p = 0,008), respektivt. Den 50% NBC gruppe, og 80%, og deretter 100% var ikke signifikant forskjellig mellom seg (p = 0,342). Den 100% NBC viste bare signifikant forskjell fra 0% og 20% NBC: MSC forhold (p = 0,008). Interessant, som starter med den samme celle nummer, viste 20% NBC gruppe en mye lavere (~ 2 dager) doblingstiden, som måler den tid det tar for cellepopulasjonen for å fordoble seg, sammenlignet med høyere NBC: MSC-forhold (fig 5B ). 0% NBC (100% MSC) gruppe viste ingen vekst mens den 100% NBC (0%) viste mye lavere doblings tid (mer enn 6 dager).
På dag 7, dag 14 og dag 21, 200 mikrokuler ble spaltet for å telle celletallet. (A): Vekstkurver som viser kinetiske endringene i antall celler over tid ved forskjellige innkapslingsmaterialer forhold (gjennomsnitt ± 1SD); (B). Befolknings dobling tid for ulike grupper
Temporal endring i andelen av NBC i mikrokulene
Fig 6A viser prosenter av NBCs mellom ulike grupper over tid. I 20% NBC gruppe ble prosentandelen av NBCs opprettholdt på omkring 20% på dag 7 og 14, men dramatisk økt til 33% ved dag 21 (figur 6A). På den annen side, 50% og 80% NBC gruppene viste tilsvarende nivå av NBCs over tid. Fig 6C viser representativt histogram av flowcytometri-base-telling av NBCs i forskjellige grupper. Figur 6B viser prosentandelen av NBCs beregnet fra data oppnådd ved strømningscytometri. To-veis ANOVA viste at NBC: MSC-faktor (p 0,001) betydelig påvirket prosentandelen av NBC overtid, men ikke den tidsfaktoren (p = 0,85). Bonferroni post hoc tester viste at 20% NBC gruppe signifikant forskjellig fra 50% (p 0,001), henholdsvis, og 80% (0,001 p (B): Tabellen viser den midlere prosentandel av NBCs i forskjellige grupper og ved forskjellige tidspunkter; (C): Representative histogram viser celler farget med isotypekontrollantistoff og cellene ble farget med NB84a antistoff i ulike grupper på forskjellige tidspunkter
Immunohistochemistry av type I kollagen
Figur 7. viser immunohistokjemisk analyse av kollagen type i i NBC-MSC-kollagen mikrokuler. I 0% NBC (100% MSC) gruppe, type I kollagen positiv mikrokule forble sfærisk selv om det blir mer porøs etter 14 dager (Figur 7A og 7B). I 20% NBC-grupper, mikrosfære var intakt på dag 7, men begynte å spaltes på dag 14 og ble nesten fullstendig dekomponert på dag 21 (figur 7B2 og 7B3). For 50% NBC gruppe, mikrokulene var fortsatt intakt i dag 7 (Fig 7C1), men mer porøs på senere tidspunkter (Fig 7C2 og 7C3). Denne trenden var lik i 80% NBC gruppe (Fig 5B). Type I kollagen uttrykker celler, som er sannsynlig å være MSC, ble stort sett begrenset innenfor mikrokulene selv om noen ble identifisert noen ganger i utvekst utenfor sfærer (Fig 7F og 7G)
(A). 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: dag 7; A2, B2, C3, D2, E2: dag 14; B3, C3, D3, D3a, E3: dag 21 etter kultur (Scale barer: 100 mikrometer).
Immunohistochemistry av MMP9
Figur 8 viser immunhistokjemisk farging av MMP9 av NBC-MSC-kollagen sfærer med faste 80% NBCs og med ulike celletettheter og kollagen konsentrasjoner. Kollagen regionene viste positiv farging mens MMP9-uttrykke celler ble funnet både i ut-vekst og de perifere lag av cellemasser (Fig 8A1, 8B1, 8B2 og 8C1)
(A):. 5000 celler /ml; (B): 2500 celler /ml; (C): 1250 celler /ml; 1: 0,5 mg /ml; 2: 1 mg /ml; 3: 2 mg /ml (skala barer: 100 mikrometer).
Diskusjon
In vitro kreft modeller
For å akselerere prekliniske narkotika screening og for å oppnå personlig medisin i fremtiden, utvikling av sykdom eller pasientspesifikk in vitro-modell er av stor viktighet [54]. Som omtalt ovenfor, er konvensjonelle 2D monolagsmodeller blir kritisert for sine ikke-fysiologiske kultur miljø, og de er ikke i stand til å rekapitulere in vivo tilstand, produserer derfor upålitelige data. Med fremskritt i feltet av vev teknikk er anvendelse av en in vitro tredimensjonal modell som etterligner tumorer stadig mer populært. [55-57]. Et viktig spørsmål i fabrikere en in vitro modell ville være valg av biomaterialer, som kan være av naturlig opprinnelse eller kunstig syntetiserte. Tallrike studier har vist lovende resultater ved hjelp av naturlige biomaterialer som kollagen, fibrin, Matrigel [58] og hyaluronsyre. Med sin lette tilgjengelighet, brukervennlighet og høy bioaktivitet, de er populære og attraktive valg for forskere. Collagen har en utmerket biokompatibilitet og ubetydelig immunogenisitet. Disse egenskapene gjør at forskerne å bruke kollagen som et egnet materiale for in vitro kreft modell. Men den enkle degradering, udefinert matrise sammensetning og svake mekaniske egenskaper er deres problemer. I tillegg er høy batch-til-batch heterogenitet i sammensetning gjør sammenligning mellom ulike studier meget vanskelig. På den annen side, syntetiske materialer som PA, polyester, PEG besitte avstembare parametre og tillater mer presis styring av materialegenskapene [59], som fører til mindre kompleksitet, høy reproduserbarhet og sammenlignbarhet mellom ulike studier. Men noen av dem er giftige, og de krever mer sofistikert prosesstrinn før de kan benyttes til modellering. PEG-baserte hydrogel, for eksempel, har ikke-fibrillære struktur og krever enten fysiske eller kjemiske tverrbindingsprosesser [60-62]. Disse vil påvirke cellulære atferd og brukervennlighet i forhold til naturlige polymerer som kollagen. Faktisk har en universell biomateriale som passer for alle sykdomsmodeller ikke eksisterer.
