Abstract
Utviklingen av en uavhengig blodtilførselen av en svulst er avgjørende for å opprettholde vekst utover en viss begrenset størrelse og for å gi en portal for metastatisk spredning. Host-avledet endotelceller (ECS) er bosatt i og kompromitterende tumorvaskulatur kommer via ulike prosesser kjent som spirende angiogenese og vaskulogenese. Mer nylig ECS som stammer direkte fra tumorcellene selv har blitt beskrevet, selv om den til grunn for dette fenomen er fortsatt dårlig forstått. Her beskriver vi
in vitro
forhold som gjør at lunge og eggstokkreft celler til å gjennomgå en rask og effektiv overgang til egenkapitalbevis som er umulig å skille fra de som oppnås
in vivo
. En rekke metoder ble brukt for å fastslå at de oppkjøpte fenotyper og atferd av disse tumor-avledet egenkapitalbevis (TDECs) likne de av autentisk egenkapitalbevis. Xenografter som følge av co-vaksinert
in vitro
avledede TDECs og kreftceller var også mer høyt vaskularisert enn kontroll svulster; dessuten deres blodårer var i gjennomsnitt større og ofte inneholdt blandinger av verts-avledede ECS og TDECs avledet fra det opprinnelige inokulum. Disse resultatene viser at kreftceller kan manipuleres etter veldefinert
in vitro
forhold til initiere en svulst celle-til-EC overgang som er i stor grad celle-autonome, svært effektiv og etterligner
in vivo
prosess. Disse studiene gir et egnet middel til å identifisere og kanskje endre de tidligste trinnene i TDEC generasjon
Citation. Elster JD, McGuire TF, Lu J, Prochownik EV (2013) Rapid
In Vitro
Utledning av endotelet direkte fra humane kreftceller. PLoS ONE 8 (10): e77675. doi: 10,1371 /journal.pone.0077675
Redaktør: Ken Arai, Massachusetts General Hospital /Harvard Medical School, USA
mottatt: 28. mai 2013; Godkjent: 11 september 2013; Publisert: 09.10.2013
Copyright: © 2013 Elster et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH bevilgning RO1 CA140624 til EVP og ved en St. Baldrick post-doc prisen til J.D.E. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de tidligste stadiene, oppfyller en begynnende svulst sin metabolske behov gjennom enkel diffusjon av næringsstoffer og avfallsprodukter [1-3]. Ved å nå en viss kritisk masse, men diffusjonen ikke lenger er tilstrekkelig for dette formålet, og videre vekst krever utvikling av en uavhengig vaskulatur [3,4]. Uten dette, følger svulst dvalen og kan vedvare i mange år og i denne tiden ytterligere tumor celleproliferasjon er balansert av apoptotiske eller nekrotiske død [5,6]. Induksjon av en «angiogene bryter», hvorved en vaskulær tilførsel er ikke lenger er hastighetsbegrensende, er nå anerkjent som en viktig determinant av en svulst påfølgende vekst, dens kommunikasjon med den systemiske sirkulasjon, og dens metastatisk spredning [3,4]. I samsvar med disse funnene, er vaskulær tetthet en godt anerkjent prognostisk faktor i mange typer kreft, inkludert brystkreft, neuroblastom, og astrocytom /glioblastom [7-10].
angiogenic switch er en kompleks prosess som involverer utdypning av avascular svulst av cytokiner og vekstfaktorer, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), fibroblast vekstfaktor (bFGF), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) , transformerende vekstfaktor beta (TGF-β), og en rekke angiopoietins [1,11-13]. Noen av disse er chemo-lokke som mobiliserer både modne og progenitorceller endotelceller (ECS) fra benmargen og drive sin modning og organisering i blodårene ( «vaskulogenese»), mens andre indusere endotelet av tilstøtende blodårene til å spre seg og invadere svulsten ( «spirende angiogenese») [14-16].
Den ekstra tumor opprinnelsen til neovaskulaturen innebærer at komponent cellene er både genetisk normal og stabil, og dermed i stor grad immune mot utviklingen av kjemoterapeutiske motstand som ofte oppstår i genomisk ustabil tumorcellepopulasjon. Faktisk er anti-angiogenese-terapi delvis betinget på den antagelse at tumorvaskulatur beholder den genomiske stabiliteten av dens forløper-cellepopulasjonen [17,18]. Bevacizumab, den første klinisk nyttig angiogenese-inhibitor, er en humanisert anti-VEGF monoklonalt antistoff (mAb) som viste tidlig lovende i behandling av en rekke av avansert kreft [19-22]. Men nesten alle svar er ufullstendige og /eller forbigående som svulster slutt re-vascularize og ikke svarer til videre behandling med mAb. Som et resultat, har pasientene, og overlevelse er forbedret bare beskjedent, hvis i det hele tatt [19-23].
Nylig har vi og andre har gitt en potensiell forklaring på de ufullstendige respons til anti-angiogenese midler ved å vise at en signifikant sub-populasjon av tumorassosierte ECS stammer direkte fra selve tumorcellene [24-28]. Disse «tumor-avledet egenkapitalbevis» (TDECs) uttrykker en rekke EU-markører, ned-regulere epiteliale markører og danne funksjonelle fartøy
in vivo
der de blande med ekstra tumorally-avledet egenkapitalbevis. Fordi de inneholder de samme markør kromosomene som den tumorcellepopulasjon, ble det foreslått at, i likhet med selve tumorcellene, TDECs ble genomisk ustabil [24-28]. I samsvar med denne ideen, serie passering av TDECs fører til eventuelt fremveksten av clonally-avledet populasjoner som uttrykker stadig mer robuste EC fenotyper og er genetisk relatert til, men skiller seg fra både kreftceller og tidlig-passasje TDECs [24]. TDEC er har blitt identifisert i en murine modell av glioblastom [27] og i menneskelige glioblastom xenografter [26,28]. Tidligere men resultatløse studier har også antydet tilstedeværelsen av TDECs i andre primære humane tumorer [29-31]. Disse funnene antyder at TDEC generasjon er en utbredt, hvis ikke universelt, og det fenomen resistens mot anti-angiogene terapier kan oppstå som følge av iboende TDEC genomiske ustabilitet.
Oppdagelsen av at TDECs utgjør et funksjonelt betydelig og tydelig EC befolkning reiser en rekke spørsmål som er vanskelig eller umulig å løse ved å studere primære svulster eller tumorxenotransplantater. Disse inkluderer naturen og relative viktighet av signaler som initierer tumorcellen for å TDEC overgang, det tidsrom som dette skjer, enten TDEC utvikling og vedlikehold er celleautonome og hvorvidt alle celler i en tumor er i stand til å generere TDECs. Vi beskriver her utviklingen av en
in vitro
system som tillater oss å ta opp disse spørsmålene. Ved anvendelse av betingelser som favoriserer vekst av ECS og etterligner den hypoksiske og næringsmangel tumor mikromiljøet, viser vi at en robust EC fenotype kan lett genereres fra tumorceller og som en optimal induksjon krever synergistisk samarbeid av disse faktorene. Egenskapene til
i vitro-
avledet TDECs er nesten umulig å skille fra de isolert direkte fra svulster. Videre deres ko-inokulering med tumorceller fører til utvikling av xenotransplantater med en tettere tumor vaskulaturen og, i noen tilfeller, en raskere vekst. Disse studiene gir dermed en enkel og kvantitative middel som TDEC ontogeny kan studeres og manipuleres fra starten under definerte forhold.
Resultater
Uttrykk av EF markører i humane tumorceller under definerte
in vitro
forhold
Vi i utgangspunktet søkt å identifisere forhold som fremmer en svulst celle til TDEC overgangen
in vitro
. For disse studiene, benyttet vi den menneskelige H460 og CaLu1 ikke-småcellet lungekreft, prostatakreft den PC3 og OVCAR3 ovarian cancer-cellelinjer. Ved valget av dyrkningsforhold, hypotese vi at en kombinasjon av EC-spesifikk vekstmedium og moderat hypoksi, muligens kombinert med uttømming av visse næringsstoffer, kan rekapitulere
in vivo
miljø som tilveiebringer signal (er) for TDEC initiering. Tumor-celler ble derfor dyrket i enten EC-spesifikk EGM-2-medium + normoxia (tilstand 1), standard vekstmedium + hypoksi (tilstand 2), eller en kombinasjon av EGM-2 medium + hypoksi (tilstand 3). For OVCAR3 celler, har vi også brukt Glutamax medium supplert med EF-spesifikke faktorer som er identiske med de i EGM2 medium, men ute av asparagin, asparaginsyre, glutamin og prolin + hypoksi (tilstand 4) eller det samme medium + normoxia (tilstand 5). Vi viser til dette settet med forholdene kollektivt som «EF-fremme». Tumorceller opprettholdt i sin standard anbefales vekstmedium under normoksisk forhold tjente som utgangspunkt kontroller. Cellelysater ble fremstilt fra disse prøver og analysert ved immunblotting for ekspresjon av von Willebrands faktor (vWF), som på en pålitelig måte induseres i løpet av tumorcellen for å TDEC overgang
in vivo product: [24,25]. Som vist i fig S1, de fleste av tumorcellelinjer dyrket under standardbetingelser viste liten eller ingen ekspresjon av vWF. I kontrast, ble vWF indusert i varierende grad under forskjellige EF-fremme forhold med de høyeste og mest vedvarende nivåer vanligvis blir sett under forutsetning 3. Selv om tiden for å oppnå maksimal induksjon variert blant de testede linjer og noen ganger var forbigående, det var generelt maksimal mellom d 3-5 og ikke senere øke.
Etter å ha etablert betingelser under hvilke vWF for å oppnå maksimal ekspresjon i hver cellelinje, utvidet vi vår innledende analyser for å inkludere ytterligere EC-spesifikke markører ved hjelp av immuno-fluorescens-baserte analyser, som beskrevet tidligere [24,25]. For disse studiene, konsentrerte vi på H460 og OVCAR3 celler dyrket i 5 d under forhold 3 og 4, respektivt. EF-spesifikke proteiner analysert igjen inkludert vWF samt VEGFR1, VEGFR2, VE-cadherin og EC-selektiv adhesjon molekyl (ESAM). I tillegg er bindingen av
Ulex EuropeUS
lectin (E-lectin), opptak av acetylert low-density lipoprotein (AcLDL), og morfologi ble fulgt som indikatorer for mer komplekse EC-fenotyper. Cytokeratins 7 (CK7) og 19 (CK19) ble også undersøkt som markører for epithelial fenotype. Som vist i figur 1, ble alle EC markører som induseres i begge cellelinjene, mens begge cytokeratins ble markert nedregulert. Disse endringene er involvert både prosentandelen av celler som farget for markørene, så vel som intensiteten av positiv celle farging. Dermed uttrykk mønstre av alle merkene tett etterlignet de sett med TDECs avledet fra selve tumorxenotransplantater [24,25].
(
A
) H460-celler ble dyrket i 5 d under forutsetning tre . (
B
) OVCAR3 celler ble dyrket i 5 d under forutsetning 4. antistoff farging for EF-spesifikke markører vWF, VEGFR1, VEGFR2, VE-cadhherin, ESAM, binding av E-lectin og opptak av acetylert AcLDL ble utført på begge sett av celler som tidligere beskrevet [24,25]. Epitel markør farging ble utført for CK7 og CK19. Kontra med DAPI ble utført for å visualisere kjerner. Bright felt bilder av tumorceller og TDECs er også inkludert. Bilder ble oppnådd ved enten 40-60X forstørrelse (confocal) eller 10X forstørrelse (lyse felt). Tall i øvre høyre hjørne av hvert panel viser prosentandelen av hver populasjon som viste tegn til flekker, uavhengig av sin intensitet. Lignende resultater ble oppnådd i minst tre uavhengige eksperimenter. Scale bar = 25 um.
Funksjonell analyse av
in vitro
avledede TDECs
Å sammenligne ytterligere EF fenotyper av
i vitro-
avledet TDECs med de fra selve tumorxenotransplantater, undersøkte vi de tidligere celler for deres evne til å danne tube-lignende strukturer i halvfast medium. For disse studier ble H460-celler dyrket under standardvekstbetingelser (kontroll) eller under betingelser 1-3 for 5 d ved hvilket tidspunkt de ble sådd ut på halvfast medium og dyrket med normoxia i ytterligere 5 dager. Under både standard og EF-fremme forhold 1 eller 2, H460 celler faste som enkeltceller eller dannet amorphic acini mens dyrking under forutsetning tre kraftig forbedret tube dannelse (figur 2A). Kvantifisering av dette viste rør dannelsen av H460-celler til å økes med 10- til 50-ganger over det som sees under betingelser som er 1 eller 2 og med nesten 25 ganger over at av standard betingelser (figur 2B). Selv om antall rør dannet og kvaliteten var dårligere enn de som stammer fra menneskelige umbilical vein egenkapitalbevis (HUVECs) (figur 2C), de var utvisket fra rørene dannet av
in vivo
avledede TDECs [24,25 ]. Disse observasjonene indikerer at H460-avledet TDECs kunne danne rør i normoksisk betingelser under hvilke røret dannelsen analysen ble utført, og foreslo at det TDEC fenotype kan være stabil. For å teste dette, H460 celler, først utsatt for tilstanden 3, ble belagt direkte inn i semi-solgt medium som beskrevet for Figur 2A eller ble opprettholdt under standardbetingelser for en ekstra 7 dager før plating i en tube-analysen. Overraskende, i henhold til denne sistnevnte diett, idet røret danner evne TDECs ble ikke bare opprettholdes, men de resulterende rørene mer lignet de som er dannet av HUVECs (figur 2C). Således, mens TDEC tube dannende potensiale ble vist å kreve hypoksi, ble det oppbevares i minst 2 uker etter en retur til standard vekstforhold.
(
A
) H460 tumorceller ble indusert for å danne TDECs ved 5 d av eksponering for de angitte betingelser. 2 x 10
4 celler fra hver gruppe ble deretter sådd ut på Matrigel i et rør formasjon assay i henhold til normoksisk betingelser for 5 d, som tidligere beskrevet [24,25]. Ubehandlede H460-celler dyrket under standard betingelser tjente som kontroller. Typiske lette mikroskopiske felt er vist. Alle bilder er vist på identiske forstørrelser. (
B
) Resultatene vist i (
A
) er grafisk avbildet som det midlere antall helt lukkede rør per felt ± SEM. p-verdiene ble oppnådd ved hjelp av enveis ANOVA (**: p 0,01). (
C
) H460 tumorceller ble dyrket under standard betingelser eller tilstand 3 i de angitte tidsrom. Halvparten av cellene ble deretter øyeblikkelig sådd ut på Matrigel og dyrket under normoksisk betingelser i ytterligere 6 d. Resten av cellene ble returnert til standardbetingelser for 7 dager før de ble sådd ut i Matrigel for 6 d å vurdere utholdenhet av røret dannende potensiale. HUVECs ble anvendt som en positiv kontroll for rør formasjonen. Lysfelt bildene ble tatt på 10X forstørrelse. Lignende resultater ble oppnådd i fire uavhengige forsøk (A) og to uavhengige eksperimenter (C). Scale bar = 100 um.
En biosenser basert analyse for å overvåke
in vitro
TDEC induksjon
For å bekrefte og bedre kvantifisere
in vitro
tumor cellTDEC overgang, genererte vi atskilte populasjoner av H460 og OVCAR3 celler som stabilt uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under kontroll av EC-spesifikke Angiopoietin reseptor (Tie2) promoter [32]. Under standard vekstbetingelser, disse cellene uttrykte liten EGFP, selv når bestemt ved flowcytometri (figur 3). Etter TDEC induksjon under forutsetning av tre for H460-celler og tilstand 4 for OVCAR3 celler, ble 3-5-gangers økning i den EGFP signal rutinemessig observert (figur 3). Tjener således Tie2-EGFP-induksjon som en enkel, reproduserbar og kvantifiserbare surrogat assay for TDEC differensiering at i levende celler, avspeiler nøyaktig resultatene oppnådd ved flere standard analyser av EC fenotype. Det gir også direkte bevis for transkripsjonen oppregulering av i det minste noen av markørene i løpet av TDEC differensiering og bidrar til å underbygge deres koordinere opp-regulering i løpet av en 4-5 dagers tidsramme (figur S2).
Separate kulturer av H460 og OVCAR3 kreftceller var stabilt ko-transfektert med Tie2-EGFP plasmid og pFR400 koder for en mutant form av dihydrofolatreduktase [36,37] og valgt i G-418 og økende konsentrasjoner av metotreksat til tillate amplifisering av de to tandemmessig integrerte vektorer og en tilsvarende økning EGFP signalintensitet. Celler ble utsatt for betingelser som vist tidligere for å indusere den maksimale TDEC fenotype (dvs. betingelse 3 for H460 og tilstand 4 for OVCAR3) og sammenlignet med kontrollceller dyrket under standard betingelser. (
A
) Fluorescens-mikrografer av hver cellelinje etter fem dager med vekst under hvert sett av betingelser. (
B
) flowcytometrisk analyse av de samme cellene. Representative resultater fra minst tre uavhengige eksperimenter er vist. Scale bar = 25 um.
De foregående resultatene, sammen med de som er vist i figur 2, viser at et flertall av kreftceller vise tilstrekkelig plastisitet til å tillate at deres
in vitro
overgang til TDECs. For å teste dette direkte, undersøkte vi 80 enkeltcellekloner avledet fra H460 og OVCAR3 celler for å bestemme i hvilken grad de kan uttrykke EC-markører. Som vist i tabell 1, praktisk talt hver klon viste høy-nivå opptak av AcLDL, E-lectin-binding og Tie2-drevet EGFP ekspresjon i henhold til EC-fremmer betingelser mens bare svak ekspresjon av disse markørene kunne påvises i cellene opprettholdt under standardbetingelser. Således, som tidligere er foreslått for
i vivo-
avledet TDECs [25], oppkjøpet av EF fenotype er ikke begrenset til noen bestemt cellulær undergruppe.
H460
OVCAR -3
% + celler (Std tilstand /tilstand 3)
% + celler (Std tilstand /tilstand 4)
Clone Antall
E-lektin
AcLDL
Clone No.
Tie-2-GFP
Clone No.
E-lektin
AcLDL
Clone No.
Tie-2-GFP
1 3/90-95 3/ 9521 3/90-9541 3/80 3/9061 3/ 952 3/90-95 3/ 9522 5/90-9542 3/90 3/9062 3/ 9535/80 3/90-9523 5/ 9543 3/ 95 3/9563 3/ 345/ 95 3/ 9524 3/ 9544 3/ 95 3/9064 3/ 9555/ 95 3/80253-5/ 9545 3/ 95 3/9065 3/ 9565/ 95 3/90-9526 3/ 9546 3/90 3/9566 3/ 9575/90-95 3/ 9527 3/ 347 3/80 3/9567 3/ 9585/ 955/90-9528 3/ 9548 3/90 3/9068 3/ 395/ 955/ 9529 3/90-9549 3/90 3/9069 3/ 95105/80-855/ 9530 3/ 9550 3/50 3/9070 3/ 31110/ 955/90-9531 3/ 9551 3/ 95 3/9571 3/ 9512 3/ 95 3/ 9532 3/ 352 3/ 3 3/5072 3/ 95135/ 95 3/ 9533 3/ 9553 3/30-40 3/9573 3/ 951410/ 953/ 95345/ 9554 3/30-40 3/8074 3/ 31510/90-95 3/ 9535 3/ 95555/90-95 3/9575 3/ 316 3/90-953/ 9536 3/ 95565/ 95 3/9576 3/ 9517 3/90-95 3/ 9537 3/ 95575/ 95 3/9577 3/ 95185/ 953/ 9538 3/ 3585/90-95 3/9578 3/ 95195/ 95 3/ 9539 3/ 3595/ 95 3/9579 3/ 320 3/ 95 3/90-95405/ 9560 3/ 95 3/9580 3/ 95Table 1. Endothelial differensiering av humane tumorlinje enkelt cellekloner.
Cellesortering ble anvendt for å pode individuell H460 og OVCAR3 celler i 96-brønners plater. 20 kloner avledet fra hver celletype ble utvidet og evaluert under standard eller EF-fremme betingelser for E-lektin bindende og AcLDL opptak. Ytterligere 20 kloner hver avledet fra H460-Tie2-GFP og OVCAR3-Tie2-GFP-celler ble også evaluert for ekspresjon av GFP. Prosenten av positive celler for hver av disse EC-spesifikke markører følgende 5 dager etter forplantning ble målt under standard betingelser eller tilstander 3 eller 4, og de to oppnådde verdier er atskilt av «/». Disse studiene tar ikke hensyn til store forskjeller i markør intensitet som oppstod etter hypoksisk forplantning, som er illustrert i figur S2. CSV Last ned CSV
TDECs innlemme i svulsten neovaskulaturen, forbedre tumorvekst og øke fartøy tetthet
Våre tidligere funn om at
i vivo-
avledet TDECs kan innlemme i svulsten neo-blodkar og øke blodåren tetthet [24,25] antydet at
in vitro
avledede TDECs kan oppføre tilsvarende. For å løse dette, EGFP-merket H460 tumorceller [25] ble dyrket under forutsetning 3 for 5 d, blandet med en 20-ganger overskudd av
Discosoma
sp.
Rød fluorescerende protein (DsRed ) -tagged H460 tumorceller og spredd som subkutane transplantater i immunsupprimerte mus. Kontroll injeksjoner ble utført identisk, men med den EGFP + populasjonen dyrket under standard betingelser. Tumorer som oppstår fra den førstnevnte celleblandingen vokste vesentlig raskere enn de fra sistnevnte (figur 4A). Fluorescens mikroskopi av frosne seksjoner viste også blodkarene i de tidligere svulster å bli beriket for EGFP + egenkapitalbevis (figur 4B), noe som indikerer en forkjærlighet for
in vitro
avledede TDECs å innlemme i svulsten blodkar. Til slutt, blodkarene i de tidligere tumorene var både tyngre og større enn for de sistnevnte tumorer (figur 4C-4F). Lignende eksperimenter utført med OVCAR3 celler viste at de resulterende tumorxenotransplantater, samtidig som det ikke vokser betydelig raskere enn sine kontroll kolleger, gjorde inneholde større andel av EGFP + luminal TDECs og et tettere blodkar (Figur S3). Dermed blir ko-injeksjon av
in vitro-
avledet TDECs forenkler tumor neovaskularisering, som i noen tilfeller gjør det mulig for akselerert tumorvekst.
EGFP-merket H460-celler ble opprettholdt i 5 d under forutsetning 3. de resulterende TDECs ble så blandet med et 20-gangers overskudd av DsRed-merkede H460-tumorceller dyrket under standardbetingelser, og en total på 10
6-celler ble inokulert subkutant i flankene av nakne mus og propagert som tumor xenografter. Kontroll svulster besto av den samme blanding av DsRed-merkede tumorceller og EGFP-taggede tumorceller formert under standardbetingelser. (
A
) Grafisk fremstilling av tumorvekst. Tumorvolumene ble bestemt ved de angitte tider og gjennomsnittene ble plottet (± SEM).
p
verdi vist for dag 17 svulstvolum ble utledet ved hjelp av en one-tailed t-test. (
B
) Confocal fluorescens bilder av frosne snitt svulster fra hver av de to gruppene. Scale bar = 25 um. (
C
) Representative lavt strømforbruk hematoxylin-eosin-farget parafininnstøpte vevssnitt hentet fra typiske svulster i hver av de to gruppene. (
D
) grafisk fremstilling av den midlere antall av tumorblodkarene i hvert felt (± SEM) i typiske felt av hver tumortype. Det totale antall felt undersøkt var 32 for tilstand 3 svulster og 24 for standard tilstand svulster. Kun fartøy stiller tydelige lumen og inneholder røde blodceller, som markeres med
svart
piler
, ble talt. (
E
) grafisk fremstilling av den midlere blodkaret tverrsnittsareal (± SEM) i de to tumortyper. Det totale antall fartøyer målt var 85 fra standard tilstand svulster og 248 fra tilstand 3 svulster. (
F
) Gjennomsnittlig antall tumorblodkarene med tverrsnittsarealer (± SEM) som var små (30-499 um
2), middels (500-1999 um
2) , store (2000-4999 um
2), og veldig stor (≥ 5000 um
2), målt ved hjelp ImageJ programvare. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en one-tailed Student
t
test (*,
p
0,01; **,
p
0,001; ***,
p
0,0001). Lignende resultater ble oppnådd i to uavhengige forsøk.
Diskusjoner
Nye observasjoner i en rekke forskjellige kreftformer har indikert at egenkapitalbevis omfatter svulsten neo-karsystemet kan stamme direkte fra svulsten cellene selv og co-eksisterer med egenkapitalbevis avledet fra ekstra-tumor kilder [24-28]. Mye som sine tumorcelle forgjengere, disse TDECs er genomisk ustabil [24]. Dette kan gi en overlevelsesfordel i ansiktet av anti-angiogenese behandling, og dermed kanskje sto for den kortvarige effektene av disse agentene [19-22]. Faktisk har vi observert at
i vitro-
avledet TDECs slik som de som er beskrevet her kan utledes i EGM2 medium mangler VEGF og dermed ser ut til å være uavhengig av denne vekstfaktor selv i fravær av tidligere valg. Videre er ekstremt lave nivåer av VEGF transkripsjoner som ble oppdaget i H460 og OVCAR3 celler ved sanntid QRT-PCR, ble ikke signifikant endret etter induksjon av TDEC fenotype (ikke vist).
Våre funn tyder på at svulsten celler kan bli manipulert
in vitro
under definerte forhold til å generere TDECs som er både biokjemisk og funksjonelt lik de som kommer
in vivo product: [24,25]. At nesten alle kreftceller kan kjøpe EC-lignende egenskaper (Tabell 1) mens miste sine epiteliale egenskaper er i tråd med vår tidligere funn at encellede kloner avledet fra kreftceller kan generere TDECs
in vivo product: [25]. Dermed blir kapasiteten for TDEC hovedsakelig å være en vanlig, om ikke universell, egenskap som deles av et flertall av tumorcellepopulasjon, og er celle autonomt. Den variable Andelen TDECs funnet i forskjellige tumorer [25] kan således være mindre indikerer eventuell iboende generasjons kapasitet enn konkurrerende prosesser som spirende angiogenese og vaskulogenese, sub-optimale forhold for TDEC induksjon og mangel på andre selektive trykk slik som tidligere terapeutisk intervensjoner. Egenskapen synes å være begrenset til tumorcellepopulasjoner som vi ikke har observert ECS å skrive seg fra ikke-transformerte celler så som humane embryonale nyre eller primær eller udødeliggjort bronkiale og melkekjertlene epitelceller, når dyrket under betingelser som er identiske med dem som er beskrevet heri (ikke vist).
evnen til å generere TDECs under definerte
in vitro
vilkår svar på flere spørsmål som ikke lett kan løses ved hjelp av
in vivo
modeller hvor svulsten mikromiljøet er ofte heterogen forbehold om rask endring [1,33] og hvor TDEC formasjonen er sannsynlig å konkurrere med andre vaskulære ombygging prosesser. Disse spørsmålene omfatter naturen og forholdet til de induktive signaler for TDECs og deres timing. Åpenbare kandidater for slike signalmolekyler omfatter EC-spesifikke vekstfaktorer så som VEGF, bFGF og TGF-beta, så vel som hypoksi, som alle er sterke induserer tumor neovaskularisering [3-5,11-14]. Våre resultater tyder på at i det minste
in vitro
, hverken vekstfaktorene som leveres av EC-spesifikk vekstmedium eller hypoksi alene er spesielt potente hemmere av tumorcellen for å TDEC overgangen, men at det i kombinasjon, er de svært synergistisk. Dette er ikke helt uventet da disse faktorer har vært lenge kjent for å være nødvendig for dannelse og vedlikehold av tumoren neovaskulatur som oppstår fra mer tradisjonelle kilder [34,35]. I noen tilfeller, som eksemplifisert ved våre resultater med OVCAR3-celler, kan andre faktorer, slik som selektiv næringsmangel eller acidose kan spille flere roller støttende og gjenstår å bli utforsket mer grundig. Den nøyaktige natur av disse effektorer og deres relative betydning for TDEC generasjon er sannsynlig å være helt avhengig av de iboende egenskaper til bestemte tumortyper, anskaffet sekundære endringer og diverse andre konkurrerende og samarbeidende miljøfaktorer. Det er også sannsynlig at lengden av eksponeringen mot ulike induktive faktorer så vel som når i løpet av tumorcellen for å TDEC overgangsperioden de er operative ville spille en viktig rolle. Alle disse spørsmålene må være adresserbar ved hjelp av de typer av analysene beskrevet her, som gir mulighet for nøyaktig kontroll og timingen av potensielle miljø signaler.
Våre tidligere undersøkelser hadde indikert at både ekspresjonen av EC-spesifikke markører og funksjon av
in vivo
avledede TDECs var cellelinje-avhengig, og dette ble båret ut av de nåværende studier. Kanskje den mest åpenbare eksempel på dette ble illustrert av forskjellene mellom H460 og OVCAR3 TDECs med hensyn til deres evne til å påvirke svulst xenograft vekst og fartøystørrelse (figur 4 og S3). Hvorvidt dette skyldes iboende funksjonelle forskjeller av TDECs, vekstmønstre selve tumorcellene, stromal interaksjoner eller en kombinasjon av disse faktorene er foreløpig ukjent. Definitive bevis for slike årsak-virkningsforhold venter fremtid bekreftelse.
Evnen til å rekapitulere tumorcellen til TDEC overgang effektivt, raskt og under veldefinerte og lett alterable forhold skal nå tillate mer grundige vurderinger av de nøyaktige roller spilt av private induktive faktorer tilrettelegge for denne prosessen, samt deres relative betydning. Den enkle som TDECs kan genereres også tyder på at de kan tjene som verdifulle reagenser som skal brukes i identifisering av nye midler som hindrer denne prosessen.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle mus studier ble gjennomført i henhold til dyrevernloven og Public Health service politikk og godkjent av University of Pittsburgh Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) (Permit Number: 0812276). Dyrene ble plassert i patogen-frie enheter ved Children Hospital of Pittsburgh i samsvar med IACUC forskrifter.
Dyr
Alder og kjønn-matchet nu /nu mus ble kjøpt fra Harlan Sprague-Dawley Laboratories ( Indianapolis, IN). Tumor xenograft studier ble utført som tidligere beskrevet [24,25].
In vitro
induksjon av TDECs og tumor xenograft vekst
NCI-H460 human lungekarsinom (H460) , Calu-1 human lungekarsinom, PC3 prostatakreft, og OVCAR3 eggstokkkreftcellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), og ble opprettholdt under normoksisk «standard» betingelser som tidligere beskrevet [24,25]. Kulturmedier inkluderte alfa Minimal Essential Medium ( «MEM»), for H460 og PC3 og McCoys 5a-medium for Calu-1 og OVCAR3, begge supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 110 ug /ml pyruvat, minimum ikke-essensielle aminosyrer, 100 ug /ml streptomycin og 100 enheter /ml penicillin G). Menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVECs) og EC-spesifikke EGM-2 vekstmedium ble kjøpt fra Cambrex Bio Science (Walkerville, MD). Alle cellelinjer ble holdt i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. For de fleste tumorlinjer, ble induksjon av en EC fenotype oppnådd ved dyrking av celler under en rekke forskjellige forhold. Disse inkluderte EGM-2 medium under normoksisk forhold (tilstand 1); standard medium under hypoksisk tilstand [1% O
2 i en hypoksisk Glove Box inkubator (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, MI)] (tilstand 2); eller EGM2 medium + hypoksi (tilstand 3). For noen eksperimenter optimal induksjon i tillegg nødvendig nærings-manglende medium [Glutamax D-MEM medium som mangler den ikke-essensielle aminosyrer asparagin, asparaginsyre, glutamin, og prolin (Invitrogen, Inc.)] under hypoksiske betingelser, men ellers inneholdende det samme vekst faktorer og kosttilskudd som EGM-2 medium (tilstand 4). En endelig condition inkludert de ovennevnte næringsfattig medium pluss normoxia (Standard 5). Lentiviral emballasje og infeksjoner å produsere EGFP- eller DsRed-merkede celler ble utført som tidligere beskrevet [25].
underhudssykdommer tumorxenotransplantater ble oppnådd ved inokulering 10
6 tumorceller, som ble omfattet av EGFP-merket TDECs og DsRed-merkede tumorceller (1:20), subkutant i flankene av nu /nu mus som tidligere beskrevet [25]. Tumor volum-målinger ble gjort hver 2-3 dag til den maksimale tillatte diameter av ca. 2 cm ble nådd (vanligvis 4-6 wks for både H460 og OVCAR3 celler) og da svulstene ble skåret ut. Separate fragmenter av tumorer ble anvendt for fremstilling av frosne og parafininnstøpte seksjoner.
