Abstract
Prostatakreft (PCA) dødelighet er drevet av svært aggressive svulster preget av metastaser og motstand mot terapi, og dette aggressivitet er mediert av en rekke faktorer, blant annet aktivering av stresset overlevelses baner i pro-inflammatorisk svulstens mikromiljø. LEDGF /p75, også kjent som DFS70 autoantigen, er en stress transkripsjon co-aktivator innblandet i kreft, HIV-AIDS, og autoimmunitet. Dette proteinet er rettet av antistoffer i visse undergrupper av pasienter med PCa og inflammatoriske tilstander, så vel som i noen tilsynelatende friske individer. LEDGF /p75 er overuttrykt i PCa og andre kreftformer, og fremmer resistens mot kjemoterapi-indusert celledød via transaktivering av overlevelse proteiner. Vi rapporterer i denne studien at overekspresjon av LEDGF /p75 i PCA celler demper oksidativt stress-indusert nekrose men ikke staurosporin-indusert apoptose. Dette funn var i overensstemmelse med den observasjon at mens LEDGF /p75 ble robust spaltet i apoptotiske celler i en p65-fragment som mangler spenning overlevelsesaktivitet, forble forholdsvis intakt i nekrotiske celler. Overekspresjon av LEDGF /p75 i PCA celler førte til oppregulering av transkripsjon og protein nivåer av tiol-oksidoreduktase ERp57 (også kjent som GRP58 og PDIA3), mens dens uttømming førte til ERp57 transkripsjon downregulation. Kromatin immunoutfellingsstudier og transkripsjon reporter analysene viste LEDGF /p75 binding til og transaktive den ERp57 promoter, henholdsvis. Immunhistokjemisk analyse avdekket betydelig forhøyet co-uttrykk av disse to proteiner i kliniske prostata tumorvev. Våre resultater tyder på at LEDGF /p75 er ikke hemmer apoptose, men heller en motstander av oksidativt stress-indusert nekrose, og at overekspresjon ved PCA fører til ERp57 oppregulering. Disse funnene er av betydning i å avklare rollen som LEDGF /p75 stresset overlevelse sti ved PCA
Citation. Basu A, Cajigas-Du Ross CK, Rios-Colon L, Mediavilla-Varela M, Daniels-Wells TR, Leoh LS, et al. (2016) LEDGF /p75 Overuttrykte Demper Oksidativt stress-indusert nekrose og oppregulerer oksidoreduktasen ERP57 /PDIA3 /GRP58 i prostatakreft. PLoS ONE 11 (1): e0146549. doi: 10,1371 /journal.pone.0146549
Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA
mottatt: 08.09.2015; Godkjent: 19 desember 2015; Publisert: 15 januar 2016
Copyright: © 2016 Basu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd 5R25GM060507, 5P20MD001632 og 5P20MD006988, og ved Loma Linda University School of Medicine Center for helseforskjeller og molekylærmedisin. CKCD, MMV, LRC, og SRM ble støttet av høyere utdanning stipend henhold stipend R25GM060507. SAM ble støttet av en medisinsk forskning opplæring internship i henhold til tildelings 5P20MD006988. HB er ansatt av et kommersielt selskap-Novartis Pharmaceutical Oncology. De bevilgende myndighet (NIH, Novartis) gitt støtte i form av lønn for forfattere (CAC, CKCD, MMV, LRC, SRM, SAM, HB), men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i «forfatterens bidrag» -delen
Konkurrerende interesser. En av forfatterne, HB, er ansatt i et kommersielt selskap-Novartis Pharmaceutical Oncology. Novartis gitt støtte i form av lønn for HB, men har ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Denne kommersielle tilknytning endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i USA, påvirker uforholdsmessig African American menn i forhold til andre raser /etniske grupper [1]. PCa initiering og progresjon har vært knyttet til kronisk inflammasjon og økt oksidativ skade i denne kjertelen [2,3]. Som en mekanisme for å overleve i denne stressende miljø, PCA celler aktivere spenningsoverlevelses trasé som fremmer tumor aggressive egenskaper, inkludert motstand mot celledød og kjemoterapi [4-6]. Lens epitel-avledet vekstfaktor på 75 kD (LEDGF /p75) er en ny oncoprotein som fremmer pattedyrcelleoverlevelse i nærvær av miljømessige stressfaktorer som øker celle oksidativ skade [7-14]. Også kjent som transkripsjon co-aktivator p75, PC4 og SFRS1 samspill protein (PSIP1), og tett fin flekkete autoantigen på 70 kD (DFS70), har denne multifunksjonelle protein fått relevans i studiet av kreft, HIV-AIDS, autoimmunitet, og øye sykdom (anmeldt i refs. [9,10]). Som nøkkelen cellular co-faktor for HIV integrering i verts kromatin, har LEDGF /p75 vakt betydelig oppmerksomhet det siste tiåret, og energisk innsats er for tiden i gang for å målrette dette proteinet for behandling av HIV-AIDS [15].
Den nye rollen LEDGF /p75 som en stress oncoprotein har blitt avdekket av flere studier fra vår gruppe og andre dokumenterer sin overekspresjon i ulike humane krefttyper, og dens evne til å indusere funksjoner knyttet til tumor aggressivitet i kreftceller [10 -14,16-19]. I tillegg er LEDGF /p75 avvikende uttrykt i humane leukemier, og samvirker med Menin-MLL (blandet leukemi avstamning) transkripsjon komplekset for å aktivere ekspresjon av cancer-assosierte gener og leukemogenesis [20,21]. Potensialet i LEDGF /p75 som et lovende mål for kreftbehandling har blitt fremhevet av studier som viser at dens hemming eller downregulation demper den aggressive egenskaper kreftceller [14,17,19,21,22].
gruppe og andre demonstrerte tidligere at LEDGF /p75 er målet for et autoantistoff reaksjon i en undergruppe av PCA pasienter, så vel som i tilsynelatende friske individer og pasienter med ulike kroniske betennelsestilstander ([23], også anmeldt i refs. [9, 10]). Vi rapporterte også at LEDGF /p75 er overuttrykt i prostatakreft, og at dette overekspresjon fremmer PCa celle motstand mot caspase uavhengig lysosomal celledød indusert av taxan stoffet docetaxel (DTX), gullstandarden for PCa kjemoterapi [11,13,23] . Interessant, oppstår LEDGF /p75 oppregulering naturligvis under valget av DTX-resistente PCA-celler [24]. I samsvar med disse observasjonene, flere studier viser at LEDGF /p75 overekspresjon i kreftceller fremmer motstand mot narkotika som induserer oksidativ DNA skade og lysosomal celledød [12-14,18,25], fører en gruppe for å referere til dette proteinet som en «vokter av lysosomal stabilitet i human cancer» [14]. Stress beskyttende funksjoner av LEDGF /p75 ser ut til å være formidlet av dets evne til å delta i DNA-reparasjon og transkripsjonelt aktivere spenningsoverlevelses proteiner som varmesjokkprotein 27 (Hsp27), peroxiredoxin 6 (PRDX6), og vaskulær endotelial vekstfaktor C (VEGF C) [18,26-30].
Vi har observert tidligere at LEDGF /p75 overekspresjon i PCA cellene ikke beskyttet mot caspase-avhengig apoptose utløst av TRAIL (tumor nekrose faktor relatert apoptose inducing ligand), en godt karakterisert induser av død reseptor apoptotiske sti [13]. TRAIL, staurosporin (STS), og andre som induserer apoptose fører til caspase-3-mediert spalting av LEDGF /p75 i en fremtredende p65 fragment som mangler pro-overlevelse aktivitet og forbedrer celledød under stress forhold [22,23,30]. Videre caspase-3-mediert spalting av LEDGF /P52, den korte alternative spleisevariant av LEDGF /p75, p35 genererer et fragment som opphever den transkripsjonelle aktivitet av LEDGF /p75 [30].
På grunn av sin spaltning og inaktivering i løpet av apoptose, kan LEDGF /p75 ikke opptre som en klassisk inhibitor av apoptose, men heller som et oppstrøms beskytter av DNA og lysosomal integritet under en utvidet tilstand av cellulær oksidativt stress. Derfor fokuserte vi denne studien på å undersøke muligheten for LEDGF /p75 for å beskytte PCA cellene mot oksidativt stress-indusert nekrose, og bidra til oppregulering av endoplasmatiske retikulum protein av 57 kD (ERp57) ved PCA. ERp57, også kjent som glukose regulert protein av 58 kD (GRP58) og protein disulfide isomerase familie Et medlem 3 (PDIA3), er en multi-funksjonell tiol-oksidoreduktase og anstand protein ansvarlig for å opprettholde riktig folding av nylig syntetiserte glykoproteiner [31 , 32]. Våre resultater tyder på at LEDGF /p75 overekspresjon demper oksidativt stress-indusert nekrotisk celledød og bidrar til ERp57 oppregulering i sammenheng med PCa.
Materialer og metoder
studier med humane antistoffer, kreftcelle linjer, og prostata vev ble utført under godkjenning av Loma Linda universitetet Institutional Review Board.
cellelinjer, Antistoffer og reagenser
metastatisk prostatakreft cellelinjer DU145 (Kat. nr HTB -81) og PC3 (Kat. # CRL-1435), K-ras-transformerte prostata epitelcellelinje RWPE-2 (Kat. # CRL-11610), avledet fra normal prostata cellelinje RWPE-1, og osteosarcom celle linjen U2OS (Kat. nr HTB-96) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler ble dyrket som anbefalt av leverandørene i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C. De følgende antistoffer ble anvendt: mus monoklonale anti-β-aktin (1: 5000, Sigma-Aldrich) og anti-ERp57 (1: 200, Enzo miljø- og biovitenskap); kanin polyklonalt anti-LEDGF /p75 (1: 1000, Bethyl laboratorier Inc); geitepolyklonalt anti-Lamin B antistoff C-20 (1: 1000 Santa Cruz Biotechnology.); menneskelige autoantistoff til topoisomerase I (1: 100, Topo I), en slags gave fra Dr. Eng M Tan (Scripps Research Institute, La Jolla, CA); anti-LEDGF /p75 kanin polyklonale antistoff Scripps-Ab5087 (1: 1000), også donert av Dr. Eng M. Tan; og pepperrot (HRP) -merket sekundære IgG antistoffer (1: 5000, ThermoFisher Scientific). Tert-butyl-hydrogenperoksyd (TBHP), et organisk peroksyd, ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich. STS og N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metylkumarin (Ac-DEVD-AMC, fluorogene caspase-3/7-substrat) ble anskaffet fra Axxora. Den brede kaspaseinhibitor benzylocarbonyl-Val-Ala-Asp-fluormetyl keton (z-VAD-FMK) ble kjøpt fra Biomol International.
celledød og levedyktighet Analyser
Celledød ble indusert ved behandling med de cytotoksiske midler TBHP (50, 75, 100 og 150 uM) eller STS (4 uM) i opptil 24 timer. I noen forsøk celler ble preinkubert med 100 uM av Z-VAD-FMK i 1 time før eksponering mot disse midler. Cell morfologi ble visualisert på en Olympus IX70 mikroskop utstyrt med Hoffmann Modulation Contrast (Olympus amerikansk) og en digital Spot Imaging System (Diagnostic Instruments). For å bestemme celle-levedyktighet, ble celler utsådd i 96-brønners plater (3 x 10
4 celler per brønn) ble behandlet med TBHP eller STS, vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), og fiksert i 4% paraformaldehyd i 1 time ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket tre ganger med destillert vann, og Accustain krystallfiolett-oppløsning (Sigma-Aldrich) (1: 4) ble tilsatt til hver brønn etterfulgt av inkubasjon i 20 minutter ved romtemperatur. Cellene ble vasket med destillert vann for å fjerne overskudd av fargestoff og deretter tørket ved romtemperatur. Eddiksyre (10% v /v) ble tilsatt til hver brønn i 10 minutter, og absorbansen ble målt ved 570 nanometer (nm) under anvendelse av en μQuant mikroplateleser (Bio-Tek Instruments).
DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol) farging ble anvendt for å visualisere kondensert eller fragmentert kromatin i celler behandlet med TBHP eller STS. Kort fortalt celler ble sådd (3 x 10
4) i 8-brønn Lab-Tek
® Permanox
® kammer lysbilder (ThermoFisher Scientific), som ble behandlet etter 24 timer med de ulike cytostatika, vasket med PBS , og deretter fiksert og permeabilisert med metanol /aceton-oppløsning (3: 1 v /v) i 10 minutter ved -20 ° C. Fikseringsløsningen ble fjernet, og objektglassene ble inkubert ved romtemperatur i 5-10 minutter for tørking. Dekk ble montert ved hjelp Vectashield montering medium som inneholder DAPI (Vector Laboratories). DAPI farging ble visualisert ved anvendelse og Olympus BX50 fluorescensmikroskop og bilder ble oppnådd med. En Spot Imaging System (Diagnostic Instruments)
caspase aktivitetsanalyser ble utført som beskrevet tidligere [30]. I korthet ble cellene sådd ut i svart, klarbunnet 96-brønners plater (3 x 10
4 celler per brønn). Ved avslutningen av behandlingen med TBHP eller STS, ble celler inkubert med 50 ul 3X kaspase-buffer [150 mM HEPES pH 7,4, 450 mM natriumklorid, 150 mM kaliumklorid, 30 mM magnesiumklorid, 1,2 mM etylenglykol-bis (2 -aminoethylether) –
N
,
N
,
N «
,
N»
-tetraeddiksyre (EGTA), 30% sukrose, 10% CHAPS, og 1,5% NP-40], i nærvær av 30 mM ditiotreitol (DTT), 3 mM phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF), og 75 uM av fluorogent peptidsubstrat Ac-DEVD-AMC (caspase-3/7) for to h ved 37 ° C. Dette ble fulgt av inkubering av cellene ved romtemperatur i 12 timer, og måling av absorbansen ved eksitasjon på 360 nm og emisjon på 460 nm i en mikroplate FLX800 Fluorescent Reader (Bio-Tek Instruments). Brett aktivitet ble bestemt ved å normal til en absorbans verdier for ubehandlede, kontrollceller.
Måling av reaktive oksygen arter
Den generasjonen av reaktive oksygenforbindelser (ROS) ble vurdert på grunnlag av den intracellulære oksidasjon av 2 «, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA, Invitrogen) for å danne fluorescerende forbindelse 2′, 7»-dicholorofluorescein (DCF). Celler ble sådd ut i en 6-brønn plate med en tetthet på 3 x 10
4 celler per brønn, dyrket i 24 timer, og deretter behandlet med TBHP eller STS i opptil 12 timer. DCFH-DA (0,5 uM) ble deretter tilsatt til cellene, etterfulgt av inkubasjon i 20 minutter ved 37 ° C. Cellene ble vasket med PBS og deretter resuspendert i 0,5 ml PBS. Fluorescensintensitet ble bestemt ved flowcytometri ved hjelp av en FACSCalibur cytometer (BD Biosciences).
Kvantitativ Real Time PCR
Kvantitativ Real Time PCR (qPCR) ble utført som beskrevet tidligere [24]. I korthet, ble total RNA ekstrahert fra cellene ved bruk av RNeasy pluss mini-sett (Qiagen). RNA (0,5 ug) var omvendt trancribed til cDNA ved hjelp iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad). qPCR ble utført på MyiQ real-time PCR deteksjon system med primere bruker iQ SYBR Grønn Supermix (BioRad) i henhold til produsentens anbefalinger. Primer sekvenser for LEDGF /p75 og ERp57 ble utformet med Primer3 programvare og kommersielt syntetisert av Integrerte DNA Technologies (IDT) (tab 1). Mål-mRNA-verdier ble normalisert ved hjelp av glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA og data ble uttrykt i forhold til normaliserte verdier av tilsvarende kontroller. Prøvene ble analysert i tre uavhengige forsøk, hver i tre paralleller.
Generering av PCA celler med stabil overekspresjon eller uttømming av LEDGF /p75
LEDGF /p75 cDNA ble tidligere klonet i vårt laboratorium inn i pattedyr uttrykk plasmid pcDNA3.1 (Invitrogen) [22]. Kort, både pcDNA3.1 tom vektor og pcDNA3.1-
ledgf /p75
plasmider ble transfektert inn RWPE-2 og PC3 cellene ved hjelp av Fugene 6 (Roche) -metoden. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene trypsinert og sådd ut i 6-brønns plater. Seleksjon av stabile transfektanter ble oppnådd ved tilsetning av G418 (330μg /ml) (ThermoFisher Scientific) til cellekulturene. Overlevende kolonier ble utvidet og uttrykk for LEDGF /p75 i celler stabilt transfektert med tom vektor eller pcDNA3.1-
ledgf /p75
ble bekreftet av qPCR og immunoblotting.
PC3 celler med stabil overekspresjon eller uttømming av LEDGFp75 bruker virale vektorer var generøse gaver fra professorene Zeger Debyser og Rik Gijsbers (Katholieke Universiteit Leuven, Belgia). Overekspresjon PC3 celler ble generert av transducing dem med retrovirale vektorer som koder helaftens LEDGF /p75 cDNA som beskrevet tidligere [24,33] PC3 celler med stabil uttømming av LEDGFp75 ble generert ved hjelp av intensivert lentiviral vektor-basert RNA-interferens som beskrevet tidligere [34] . I korthet ble kort hårnål (sh) RNA anvendt til å stabilt knockdown LEDGFp75 mens shSCR tjente som ikke-interfererende shRNA kontroll. Transduserte celler ble utvalgt med zeocin (200 ug /ml) og LEDGF /p75 overekspresjon eller uttømming i utvalgte kloner ble bestemt ved qPCR og immunblotting.
RNA interferens-mediert knockdown av LEDGF /p75 i PCA-celler
Transient knockdown av LEDGF /p75 i PCA-celler ble oppnådd ved å levere konkrete korte hemmende RNA (siRNAs) inn i cellene ved hjelp av Oligofectamine metoden (Invitrogen, Life Technologies), i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble LEDGF /p75 siRNA (siLEDGF /p75) og en kodet siRNA dupleks (siSD, negativ kontroll) utført som beskrevet tidligere [24] og syntetisert ved IDT. Den siLEDGF /p75-sekvensen tilsvarte nukleotidene 1340-1360 (5′- AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 «) i forhold til det første nukleotidet til startkodonet av den LEDGF /p75 åpen leseramme. Denne sekvensen tilsvarer en region i C-terminalen av LEDGF /p75 som ikke deles av sin korte alternativ spleisevariant LEDGF /P52. Sekvensen for siSD var 5’GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 «. Cellene ble transfektert med 40 Nm sirnas og dyrket i 72 timer før analyse.
Docetaxel-Resistant PCA celler
Docetaxel (DTX) motstandsdyktig PC3 (PC3-DR) og DU145 (DU145-DR ) cellelinjer ble utviklet ved å dyrke PC3 og DU145-celler i nærvær av DTX i en doseeskalerings måte [35]. Celler som overlevde den innledende kulturen i 1 nM DTX ble passert 4 ganger før økning av konsentrasjonen av DTX til 5,5 nM og deretter til 11 nM. Resistente celler ble holdt konstant i 11 nM DTX.
Immunoblotting Analyse
Immunoblotting ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [24]. Kort sagt ble proteiner i hel-cellelysater fra PCA-celler separert ved SDS-PAGE (4-12% NuPAGE, ThermoFisher Scientific), etterfulgt av overføring til polyvinyldifluorid (PVDF) membraner (Millipore). Membranene ble blokkert med 5% tørrmelk oppløsning fremstilt i TBS-T-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,1% Tween 20) og probet med primære antistoffer. Etter flere vaskinger med TBS-T, ble membranene inkubert med passende pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer, og vaskes igjen flere ganger med TBS-T. Proteinbånd ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (ThermoFisher Scientific Pierce).
Kinetworks ™ Stress /Heat Shock Protein Screen
Kinetworks ™ Stress /Heat Shock Protein Screen (Kinexus Bioinformatikk Corporation) ble brukt til å kvantifisere og sammenligne uttrykket nivåer av 25 forskjellige stress og varmesjokkproteiner i immunoblotter av helcellelysater fra RWPE-2-celler som stabilt overuttrykker LEDGF /p75 og kontrollceller stabilt transfektert med tom pcDNA vektor. Denne plattformen var et antistoff-baserte matrise tjeneste for samtidig screening av flere stressproteiner i cellelysatene som var kommersielt tilgjengelig på det tidspunktet vi startet denne studien. Cellelysater ble analysert ved immunoblotting mot et spennings /varmesjokkprotein-antistoff panel [36]. Immunoblotting prosedyrer og kvantifisering av enkelte stresset protein immunoreaktivitets ble utført av Kinexus.
Luciferase-basert transkripsjons Reporter Analyser
ERp57 promoter (
ERp57pr
) luciferase-basert transkripsjon reporter analyser var utført som tidligere beskrevet [30]. I korthet RWPE-2, PC3, DU145 og celler ble ko-transfektert med ekspresjonsvektoren som koder LEDGF /p75 (pcDNA3.1-
ledgf /p75
) eller tom vektor (pcDNA3.1), og reporteren vektor (pLightSwitch tom vektor, eller pLightSwitch-
ERp57pr
) (Bryter Genomics /Aktiv Motif). Ved 48 timer etter transfeksjon, ble cellene lysert og luciferase-analyser ble utført ved hjelp av lysbryter Luciferase Assay Reagent (Bryter Genomics /Aktiv Motiv). U2OS-celler ble transfektert med en annen LEDGF /p75-ekspresjonsvektor, pCruzHA-
ledgf /p75
, eller tom pCruzHA, og luciferase-analysen i disse cellene ble utført ved anvendelse av Luciferase Assay System fra Promega. Relative lysenheter ble oppnådd i et MicroLumatPlus Lb 96V luminometer (Berthold Tech), og luciferase-verdier ble normalisert til proteinkonsentrasjon på lysater fra celler ko-transfektert med tom vektorer og pLightSwitch-
ERp57pr
. Elevens
t
-test analyser ble utført ved hjelp av Microsoft Excel. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger i triplikater.
Chromatin Immunoutfellingsunder Analyser
Disse analyser ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [37]. Kort sagt ble PC3 og U2OS cellene fiksert i 1% formaldehyd i 10 minutter og underkastet immunutfelling kromatin (chip) assay ved bruk av chip-IT Express Enzymatisk kit (Active Motiv). Anti-LEDGF /p75-antistoffer (A300-848A, Bethyl) ble anvendt for å immunoutfelle protein-komplekser kromatin. Immunopresipitert kromatin ble deretter enzymatisk fordøyd. PCR ble utført ved anvendelse av spesifikke primere for å amplifisere ERp57 promoter (tabell 1). Både ikke-spesifikk immunglobulin G (IgG) antistoff og innspill kromatin ble brukt som kontroller.
Immunhistokjemisk (IHC) Analyse av prostatakreft microarray
Menneskelig PCA microarray (TMA), kommersielt tilgjengelig fra Novus Biologicals og amerikanske Biomaks Inc. ble brukt for IHC analyse av LEDGF /p75 og ERp57. Tre forskjellige PCa TMA (to fra US Biomaks Inc. og en fra Novus Biologicals) ble anvendt for å øke størrelsen på utvalget. Kort fortalt, vi kjøpte fra USA Biomaks den PR807 og PR807a TMA, som hver inneholder enkle kjerner av 3 sykdomsfrie normalt vev tilfeller, 7 normale tilfeller tilstøtende vev, og 50 vev tilfeller PCA. Vi har også brukt IMH-303 TMA (Novus Biologicals), som inneholder 40 PCA vev kjerner og ni matchet normale tilstøtende vev. Produsentene av disse TMA gitt bare begrenset basis clinicopathological informasjon (alder, kjønn, tumorstadium i noen tilfeller) som korresponderer med vevet kjerner, uten pasient identifikatorer. Ingen informasjon var tilgjengelig på pasienten rase eller etnisk opprinnelse, behandling type institusjoner som har samlet inn vev, oppfølging rutiner, og vev håndtering teknikker. De begrenset pasientoppfølgingsdata knyttet til TMA hindret oss fra å utføre en Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og annen klinisk korrelasjon analyser.
TMA ble farget ved hjelp av en Biogenic i6000 auto-Stainer (Biogenex Corporation) som beskrevet tidligere [11]. Kort sagt ble parafin vevssnitt i TMA glir deparaffinized og objektglassene ble utsatt for antigen gjenfinning. Endogen peroksidaseaktivitet ble stanset ved behandling med 3% hydrogenperoksid i 10% metanol, og kraftblokk
© universell sperre reagens (Biogenex Corp.) ble anvendt for å blokkere ikke-spesifikk proteinbinding. IHC-farging av LEDGF /p75 ble utført ved anvendelse av Scripps-Ab5087 kanin-polyklonalt antistoff, som er spesifikt for LEDGF /p75 og ikke reagerer med den korte LEDGF /P52 spleisevariant [11]. IHC farging av ERp57 ble gjort ved hjelp av musen monoklonale anti-ERp57 (Enzo Life Sciences). TMA glass ble inkubert over natten med primære antistoffer, vasket og deretter inkubert med Flerledds
© biotinylert sekundært antistoff (Biogenex Corp.), etterfulgt av inkubering med streptavidin-peroksydase koblet super Etikett
© (Biogenex Corp.). Immunfarging ble påvist ved peroksydase aktivering av 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) chromagen (Biocare Medical). TMA ble kontra lett med hematoxylin (Sigma) og montert med Permount (ThermoFisher Scientific). For den negative kontrollprøven ble det primære antistoff utelatt og erstattet med kanin eller mus pre-immunserum. Vevssnitt ble undersøkt under et Olympus BX50 mikroskop, og bildene ble anskaffet ved hjelp av en digital Spot RT3
TM kamera (Diagnostic Instruments).
immunostained TMA ble scoret blindt for LEDGF /p75 immunoreaktivitets av et styre sertifisert patolog (HR). En fire-lags poengsystem (0 = negativ 1 = svak 2 = moderat 3 = sterk) ble anvendt for å vurdere fargeintensitet. Vev med score til 0-1 ble vurdert til å ha lav intensitet flekker, mens vev med score til 2-3 ble ansett å ha høy intensitet farging. Vevsprøver som viste dårlig kvalitet ble ekskludert fra analysene. Disse studiene ble utført under godkjenning av Institutional Review Board
Statistisk analyse av IHC data og deres forhold til pasientenes kliniske resultater ble gjort ved hjelp av SAS programvarepakken. (Versjon 9.2, SAS Institute). For enkel statistisk analyse, ble vevsprøver gruppert i to kategorier basert på deres score. «Low» farging ble bestemt som sammenslåtte fargeintensitet score til 0 og 1, mens «høy» flekker hadde samlet score på 2 og 3. Sammenheng mellom uttrykk nivåer av LEDGF /p75 og ERp57 i svulsten og kontroll (sykdomsfri normal + normal tilstøtende ) vev ble bestemt ved hjelp av Chi-kvadrat test. Sannsynlighets verdier under 0,05 ble ansett som signifikant.
Resultater
LEDGF /p75 overekspresjon demper oksidativt stress-indusert nekrose men ikke staurosporin-indusert apoptose i PCA celler
TBHP, en mer stabil homolog av hydrogenperoksyd som er mye brukt i modeller for oksidativt stress-indusert nekrose [38-40], og de apoptose-induse STS ble eksponert for PCA-celler for å aktivere nekrotisk og apoptotisk celledød, respektivt. Begge midler redusert cellelevedyktighet i RWPE-2 prostata cellelinje (figur 1A). Men mens STS-behandlede celler presenteres de klassiske apoptotiske kjennetegnene preget av blebbing og kromatin kondens og fragmentering, TBHP-behandlede celler viste den typiske nekrotiske morfologi preget av cytoplasma hevelse og kondensert kjerner uten kromatin fragmentering (fig 1B og 1C). Behandling med STS førte til en tidsavhengig økning i kaspase-3-aktivitet, i overensstemmelse med apoptoseinduksjon, mens behandling med TBHP ikke førte til kaspase-3 aktivering (Fig 1 D). Lamin B, et klassisk caspase-3-substrat, ble spaltet i dens signatur apoptotisk fragment på 45 kD under STS-indusert apoptose, men ikke i løpet av TBHP-indusert celledød (figur 1E), i samsvar med våre tidligere observasjoner om at dette protein ikke er spaltet i løpet nekrotisk celledød [41]. Samlet utgjør disse resultatene var konsistente med tilgjengelig dokumentasjon på at TBHP er en sterk trigger for oksidativt stress-indusert nekrotisk celledød [38-40].
A. RWPE-2-celler ble behandlet med 100 mikrometer TBHP eller 4 mikrometer STS å indusere nekrose eller apoptose, henholdsvis. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved krystallfiolett analyse. B. Endringer i cellulær morfologi forbundet med nekrose eller apoptose i RWPE-2-celler som ble behandlet med TBHP eller STS, henholdsvis i 24 timer. C. Nuclear morfologi RWPE-2 celler (behandlet som i panel B) visualisert ved DAPI farging. D. Caspase 3 aktivitet ble målt etter behandling med TBHP eller STS. E. Spalting av Lamin B inn i sin signatur apoptotisk 45 kD-fragmentet ble påvist ved immunblotting i RWPE-2-celler som ble behandlet med STS men ikke i TBHP-behandlede celler. Linjene indikerer bånd tilsvarende intakte proteiner og pilen peker mot spalting fragment. F. Immunoblot viser stabil overekspresjon av LEDGF /p75 i RWPE-2-
ledgf /p75
kloner i forhold til RWPE-2
Vec
(tom pcDNA3.1 vektor) kloner og utransfekterte RWPE- 2 celler. G. Krystallfiolett levedyktighet analysen viser at overekspresjon av LEDGF /p75 i RWPE-2 celler fremmer motstand mot celledød indusert av TBHP men ikke STS. Hver graf representerer gjennomsnittet av minst 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller (*
P . 0
05)
.
P
verdier ble fastsatt i forhold til å styre ved hjelp av Student
t
-test. Data representerer gjennomsnittet av minst uavhengige eksperimenter.
For å finne ut om LEDGF /p75 fiendskap TBHP-indusert nekrose, vi genererte RWPE-2-celler som stabilt overuttrykker dette proteinet (fig 1F). Disse cellene viste en betydelig dempning av TBHP-indusert nekrotisk celledød i forhold til celler som er stabilt transfektert med den tomme vektoren pcDNA3.1 (figur 1G). Som ventet fikk LEDGF /p75 overekspresjon ikke dempe STS-indusert apoptose (figur 1G), mest sannsynlig på grunn av sin spalting av caspases [22,23,30].
Vi reproduseres og utvidet disse funnene i beinet metastatiske PCA celler, PC3. I likhet med våre observasjoner i RWPE-2-celler, behandling av PC3-celler med enten STS eller TBHP redusert cellelevedyktighet i en tidsavhengig måte (figur 2A). Som forventet, zVAD-FMK, en bred hemmer av caspases dempes STS-indusert apoptose, men hadde ingen hemmende effekt på TBHP-indusert nekrose (Fig 2A). Selv zVAD-FMK betydelig svekket STS-mediert apoptose, gjorde det ikke helt hemme celledød som tiden kommet (2A), i samsvar med tidligere observasjoner om at STS induserer caspase-uavhengig celledød eller necroptosis henhold caspase-kompromittert forhold i enkelte cellelinjer [ ,,,0],42,43]. I samsvar med våre observasjoner i RWPE-2 celler, STS-behandlede PC3 celler utstilt den karakteristiske blebbing og omfattende kromatin kondens og fragmentering assosiert med apoptose, mens TBHP-behandlede celler utstilt cytoplasma hevelse uten kjernekraft fragmentering (Fig 2B og 2C). Som forventet, behandling med STS, men ikke med TBHP, førte til caspase-3-aktivering (fig 2D).
A. PC3-celler ble behandlet med 100 uM TBHP eller 4 uM STS å indusere nekrotisk eller apoptotisk celledød, henholdsvis i nærvær og fravær av det brede kaspaseinhibitor zVAD-FMK. Cellelevedyktigheten ble vurdert på 6, 12, 24 timer etter behandling, og ved 6 h behandling pluss 18 timer utvinning. B. Endringer i cellulær morfologi forbundet med nekrose eller apoptose i PC3-celler behandlet med henholdsvis TBHP og STS, i 24 timer. C. Nuclear morfologi PC3 celler visualisert ved DAPI farging. D. Caspase 3 aktivitet ble målt etter behandling med TBHP eller STS. E. Spalting av Topo I til dens signatur apoptotisk (70 kD) og nekrotisk (70 kD og 45 kD) fragmenter ble påvist ved immunblotting i PC3-celler behandlet med STS eller TBHP, henholdsvis (øvre panel). Spalting av LEDGF /p75 inn i sin signatur apoptotisk-fragmentet (65 kD) ble påvist i celler behandlet med STS, men ikke i celler behandlet med TBHP (nedre panel). p-aktin ble brukt som lasting kontroll.
