Abstract
Bakgrunn
Den samlede prognosen for kolorektal kreft (CRC) pasienter er utilfredsstillende på grunn av kreft metastaser etter operasjon . Denne studien tar sikte på å undersøke den kliniske betydningen av plasma osteopontin (OPN) nivåer som minimalt invasive, prediktive, og surrogat biomarkører for prognose av CRC-pasienter.
Metoder
I denne randomiserte studien design består av pre -operative og postoperative plasmaprøver fra i alt 79 pasienter. Vi er fast bestemt plasmanivået av OPN ved ELISA og undersøkt deres korrelasjon med clinicopathological parametre for CRC pasienter. Effektene av endogen og eksogen OPN på CRC metastase ble undersøkt ved undersøkelse av effekten på regulatorer av epitelial til messenchymal overgang og migrasjon analysen.
Resultater
Våre funn viste for første gang den kliniske korrelasjon mellom plasma OPN med spredning av CRC pasienter. Høy postoperativ plasma OPN nivå ( 153,02 ng /ml) i forbindelse med utvikling av metastaser etter kurativ reseksjon (p 0,001). Dessuten, post-operativ plasma OPN nivå korreleres med sykdomsfri overlevelse av CRC-pasienter (p = 0,009) og var en faktor for å forutsi utvikling av metastaser i CRC pasienter etter kurativ reseksjon (p = 0,036). Vår
in vitro
modellen viste at OPN ektopisk uttrykk indusert DLD1 celle migrasjon gjennom sneglen og Twist1 overekspresjon og E-cadherin undertrykkelse, og sekretorisk OPN nivå forbedret celle migrasjon.
Konklusjoner
resultatene av denne studien tyder på at postoperativ plasma OPN korrelert med postoperative metastasering, noe som tyder på at det er en potensiell ikke-invasiv biomarkør for utvikling av fremtidig metastaser i CRC pasienter. I tillegg ble OPN vist seg å være involvert i metastatisk prosess og dermed hemming av OPN er en potensiell terapeutisk tilnærming for å behandle CRC pasienter
Citation. Ng L, Wan TM-H, Lam CS-C, Chow AK-M, Wong SK-M, Man JH-W, et al. (2015) Post-Operative Plasma osteopontin Spår fjernmetastaser i Human tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (5): e0126219. doi: 10,1371 /journal.pone.0126219
Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES
mottatt: 28 august 2014; Godkjent: 30 mars 2015; Publisert: 11 mai 2015
Copyright: © 2015 Ng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen i verden [1]. Årlig over 1,2 millioner mennesker utvikler CRC globalt, med mer enn 600.000 pasienter dør av sykdommen i 2008 [2]. Forekomst og dødelighet for CRC har gått ned som følge av bedre tester som gjør at tidlig påvisning av kreft, da det kan være lettere behandles med kirurgi og kjemoterapi sammen med strålebehandling [3]. Til tross for disse fremskritt innen klinisk behandling, er den samlede prognosen for pasienter CRC fremdeles utilfredsstillende på grunn av kreft metastasering. Derfor er det viktig å utvikle flere biomarkører for å øke den prognose av CRC pasienter ved prediksjon eller tidlig påvisning av okkult metastasering.
blod-basert, minimal invasiv markører vil være økende viktig i CRC-screening og overvåkning av CRC pasienter. Carcinoembryonic antigen (CEA) og CA19-9 har vært vanlig vurdert i CRC pasienter, men med varierende resultater avhengig av studiedesign og studiepopulasjonen [4], og deres kliniske tilknytning til kreft metastase har ikke vist så langt. Selv om mange biomarkører er under evaluering for påvisning av CRC fra serum, ingen av dem har tilstrekkelig sensitivitet og spesifisitet for å bli vurdert i gjeldende retningslinjer [4].
osteopontin (OPN) er et utskilt glykoprotein med en multi -domain struktur og funksjon som er karakteristiske for et ekstracellulært protein [5]. Det er en liten integrin-bindende ligand
N
-koblet glykoprotein (SØSKENMODERASJON) som binder seg til celleoverflatereseptorer inkludert integriner og CD44 [6]. OPN er uttrykt i mange vev og skilles ut i kroppsvæsker, som blod, melk og urin [7-9], som har viktige fysiologiske roller i benremodelleringen, immunresponsen og inflammasjon [10]. Det er også et tumor-assosiert protein og forhøyede OPN nivåer er assosiert med cellulær proliferasjon, invasjon og angiogenese via endret aktivitet av matriks-metalloproteinaser, den epidermale vekstfaktor-reseptor og PI3K-AKT signale [11, 12]. Disse prekliniske studier tyder på at plasma OPN kan være en viktig ikke-invasiv biomarkør av okkulte systemiske metastaser. I samsvar, i en fersk meta-analyse av over 228 publikasjoner, høy tumor eller plasma OPN nivåer korrelerte med nedsatt sykdomsfri overlevelse og total overlevelse i flere krefttyper, inkludert lungekreft, brystkreft, prostatakreft, hode og nakke kreft og leverkreft [13].
Økte nivåer av OPN mRNA og protein har blitt vist i CRC sammenligne med ikke-svulstvev [14-17], og den høye uttrykk korrelert med metastatisk funksjoner som lymfeknutemetastase og fjernmetastaser [17]. Imidlertid Nitsche
et al
«s studie som undersøkte mer enn 200 pasienter med stadium II tykktarmskreft viste at svulstvevet nivået av osteopontin var nyttig for påvisning av nærvær av kreft i tykktarmen, men ikke for å forutsi prognose av pasienter [18]. Disse studiene antydet at OPN vev nivå var ennå ikke bekreftende å oppdage eller forutsi CRC metastaser. Blood OPN nivået har blitt foreslått som en potensiell detektiv biomarkør for CRC, men den kliniske sammenheng med CRC metastaser har ikke blitt vist så langt. I tillegg er de fleste av de kreft studier fokusert på kliniske betydningen av pre-operative plasma OPN nivå, mens den postoperative nivå hos kreftpasienter har sjelden blitt undersøkt. Derfor, i denne studien vil vi undersøke clinicopathogical betydning samt den prognostiske potensialet i pre-operative og postoperative plasma OPN nivåer av CRC-pasienter.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
den menneskelige prøvetaking protokollen er godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved University of Hong Kong, og all klinisk undersøkelse har blitt gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Informert skriftlig samtykke er innhentet fra deltakerne. Preoperative blodprøver ble tatt fra 96 pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon av primær CRC ved Kirurgisk avdeling, Queen Mary Hospital, The University of Hong Kong, mellom 1998 og 2007. Vevsprøver ble innhentet fra 32 av de 96 pasientene umiddelbart frosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -80 ° C inntil analyse. Den postoperativ blod ble innhentet fra pasienter under postoperativ oppfølging besøk til vår klinikk (vanligvis innen 6 måneder etter kirurgisk operasjon). Blod ble antikoagulert med EDTA og deretter sentrifugert ved 2500 rpm i 10 min. Plasmaet ble oppsamlet, delt i porsjoner, og hurtigfrosset ved -80 ° C inntil bruk. Clinicopathological data og blod CEA nivå ble oppnådd fra pasienten database med vår sykehus.
Enzyme-linked immunosorbent assay
plasmanivået av OPN eller sekretoriske OPN nivå i CRC-cellelinjer ble målt ved anvendelse av en kommersielle enzymbundet immunosorbent assay kit (R E-cadherin-Forward Primer: 5’TGGAGGAATTCTTGCTTTGC-3 «; E-cadherin-Reverse Primer: 5’CGTACATGTCAGCCAGCTT-3 «; Snail-Forward Primer: 5»-CAGACCCACTCAGATGTCAA-3 «, Snail-Reverse Primer: 5′-CATAGTTAGTCACACCTCGT-3»; Twist1-Forward Primer: 5’GGGAGTCCGCAGTCTTAC-3 «, Twist1-Reverse Primer: 5’CCTGTCTCGCTTTCTC-TTT-3»; GAPDH- Forward Primer: 5’GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG -3 «, GAPDH- Reverse Primer: 5’ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA -3». Sanntids-PCR ble utført ved anvendelse av ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster, CA) ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sek og ved 56 ° C i 1 minutt. Hver analyse ble utført i triplikat, den gjennomsnittlige ble beregnet og ekspresjonsnivået av mål-mRNA ble uttrykt som ganger til ekspresjon av GAPDH. For celle linjer forsøkene ble fold-endring beregnet basert på endringen i overflod av transkripsjon av interesse (normalisert til GAPDH) fra forsøksgruppen sammenlignet med overflod av transkripsjon av interesse (normalisert til GAPDH) fra kontrollgruppen.
Plasmid bygging
OPN full lengde kodesekvensen ble forsterket av OPN-
Kpn
I-Forward Primer CGGGGTACCGTGCCAGCCAAACAACAAA og OPN-XbaI-Reverse Primer TGCTCTAGATGCAAAGTGAGAAATTGTATTT, bruker Platinum
Taq
DNA Polymerase High Fidelity (Livet Technoloies) i henhold til produsentens anvisninger. PCR-syklusen var 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 56 ° C i 30 sekunder og 68 ° C i 2 min. Den OPN PCR-produktet ble renset ved Qiagen PCR rensing system (Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Den pcDNA3.1 vektor (Invitrogen) og OPN renset PCR produktene ble fordøyd av
Kpn
jeg og
XBA
jeg restriksjonsenzymer (New England Biolabs), renset og bundet av DNA ligase (New England Biolabs). Den ligation Produktet ble forvandlet til DH5a kompetente celler (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Plasmidene ble hentet av Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) sekvens troskap ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensering.
Cell-linjer, vev kultur, transfections og reagenser
CRC cellelinjene ble opprettholdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5% CO
2 ved 37 ° C. DLD1 og SW480 celler ble transient transfektert med vektor kontroll eller OPN uttrykk plasmid hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. DLD1-OPN1 og vektorkontroll stabile kloner ble generert av utvalg for kultur medium som inneholder 1 mg /ml G418 (Roche) i 3 uker. HCT116 og SW620 celler ble transient transfektert med siRNA negativ kontroll eller OPN siRNA oligonukleotider (Invitrogen) ved hjelp Lipofectamine 3000 reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Protein utvinning og western blot analyse
Cell Modellsøk ble høstet, samlet og lyseres i RIPA buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) som inneholder 1 mmol /L phenoylmethylsulfonyl fluor for en time på is. Lysatet ble sentrifuger ved 12 000 x g i 15 minutter og supernatanten ble overført til et nytt sterilt rør. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Lysert protein ble suspendert i natriumdodecylsulfat-prøvebuffer, kokt, løst i natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og overført til PVDF-membraner (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Antistoffer mot E-cadherin og GAPDH (for normalisering) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Representative vestlige blotter av eksperimenter som ble gjentatt 3 ganger vises. Densitonmetry ble utført på den vestlige blotter ved hjelp ImageJ programvare.
In vitro
migrasjon og invasjon analysen
Cellene ble høstet, resuspendert i serumfritt medium og sådd ut transwell kammer (Corning eller BD Biosciences). To hundre og femti mikroliter av en 50 000 cellesuspensjon i serumfritt medium ble tilsatt til det øvre kammer, som ble plassert i en 24-brønns plate med bunnen fylt med 750 pl komplett medium som et kjemotiltrekkende. Etter 3 dager ble antall celler migrert ble bestemt i henhold til produsentens instruksjoner. Hvert forsøk ble gjort i to eksemplarer, og resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Statistisk analyse
Foreningen av plasma OPN nivåer med kontinuerlige variabler ble testet med Pearsons korrelasjon. Student t-test ble anvendt for å sammenligne forskjellen mellom to grupper. Forskjeller i tilbakefall i ulike grupper av pasienter med CRC ble evaluert av den eksakte fisher test. Sykdomsfri overlevelse ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier produkt grense metode og log-rank test. Univariate og multivariate analyser i en Cox proporsjonal farer modell for prognostiske prediktorer ble utført. Alle disse statistiske analysene ble utført med Sigmaplot 10.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) eller SPSS 10,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Statistisk signifikans ble satt til p ≤ 0,05.
Resultater
Sammenligning av plasma OPN nivå mellom normale donorer og CRC pasienter
Vi først bestemt plasma OPN nivå fra 56 normale donorer og 83 CRC pasienter før kirurgisk fjerning av sine svulster. Den midlere plasma OPN nivå av CRC-pasienter var 160.31 ng /ml, som var signifikant høyere enn den til normale donorer (115.27 ng /ml; p 0,001). Vi har videre delt pasientene inn i tidlig fase (fase I til II, n = 45) og forkant (trinn III til IV, n = 38). Den midlere plasma OPN nivå av forhånds stadium pasienter (187,91 ng /ml) var betydelig høyere enn for normale donorer (p 0,001), mens nivået av tidlig stadium pasienter (137,00 ng /ml) var ubetydelig høyere (p = 0,052). Disse resultatene antydet at plasma OPN kan være en ikke-invasiv biomarkør for screening CRC pasienter med forhånds tumor stadium, men følsomheten redusert i screening scenen CRC pasienter tidlig.
Korrelasjonen av pre-operative plasma OPN nivå med OPN avskrift uttrykk og clinicopathological parametere
Vi neste undersøkt sammenhengen mellom preoperativ plasma OPN nivå og sammenkoblede svulst OPN karakternivå på 32 CRC pasienter. Som vist i figur 1 A, var det en positiv korrelasjon mellom OPN nivå i plasma og CRC tumor (R = 0,452, p = 0,0010), hvilket antyder at plasma OPN nivå i CRC-pasienter var en indikasjon på deres CRC OPN uttrykk. Vi deretter undersøkt sammenhengen av pre-operative plasma OPN nivå av 83 CRC pasienter med sine clinicopathological data (tabell 1). Plasma OPN nivå ikke korrelerer med alder, kjønn og lymfeknutemetastase. Betydelig høyere plasma OPN nivå ble påvist hos pasienter med tumorstørrelse over 5 cm (180.4 vs 140,7 ng /ml, p = 0,003, 1C), høyere stadium (187,9 vs 137,0 ng /ml, p 0,001; figur 1D) og metastatisk CRC (197,0 vs 148,7 ng /ml, p = 0,003; figur 1E). Den pre-operative plasma OPN nivå også positivt korrelert med tumorstørrelse (R = 0,390, p 0,001; figur 1B). Resultatene viste at preoperativ plasma OPN var en potensiell ikke-invasiv biomarkør for tumorprogresjon og metastasering. Vi undersøkte også om pre-operative plasma OPN nivå korrelert med fremtidig metastaser fra CRC pasienter som viste ingen fjernmetastaser ved operasjonen. Våre resultater viste at et slikt nivå viste ingen signifikant forskjell mellom pasienter med og uten fremtidig metastase (132,09 vs 130,63 ng /ml, p = 0,951, fig 1F)., Som indikerer at den pre-operative plasma OPN nivå var ikke prognostisk for fremtidig metastase
(
A
) korrelasjonen av pre-operative plasma OPN nivå med sammenkoblede svulst OPN karakternivå i 32 CRC pasienter (R = 0,452, p = 0,010; Pearson korrelasjon). (
B
) Korrelasjonen av pre-operative plasma OPN nivå med tumorstørrelse (R = 0,390, p 0,001; Pearson korrelasjon). (
C
) Sammenligning av preoperative plasma OPN nivåer hos pasienter med tumor ≥ 5 eller 5 (p = 0,003; t-test) (til venstre). (
D
) Sammenligning av preoperative plasma OPN nivået hos pasienter med lavere (I til II) eller høyere trinn (III-IV) (p 0,001; t-test). (
E
) Sammenligning av preoperative plasma OPN nivåer hos pasienter med eller uten fjernmetastaser (p = 0,003; t-test). (
F
) Sammenligning av preoperative plasma OPN nivåer hos pasienter med eller uten postoperativ metastasering (p = 0,951; t-test). Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Klinisk betydning av postoperative plasma OPN nivåer
Vi neste undersøkt den prognostiske verdien av postoperativ plasma OPN nivå for utviklingen av postoperative metastaser i en annen kohort av 89 CRC pasienter. 40 av dem utviklet postoperativ metastase i løpet av 30 måneder, og disse pasientene viste signifikant høyere postoperativ plasma OPN nivå enn de 49 ikke-metastaserende pasienter (187,0 vs 145,7 ng /ml, p = 0,004; figur 2A). Bruk av den samlede median postoperativ plasma OPN nivå (153,02 ng /ml) av CRC pasienter i denne studien som terskelverdi, CRC pasienter med høy postoperativ plasma OPN nivå var mer sannsynlig å utvikle fjernmetastaser (29 ut av 45 pasienter) enn de med lav postoperativ plasma OPN nivå (11 av 44, p 0,01; fig 2b). For å illustrere resultatene av den postoperative plasma OPN som prediksjon biomarkør, ble ROC kurve konstruert. Arealet under kurven (AUC) av ROC kurven var 0,711 (Fig 2C, 95% KI: 0,601 til 0,821), og sensitivitet og spesifisitet var 0,700 og 0,694, henholdsvis
(
A
) Sammenligning av postoperative plasma OPN nivåer hos pasienter med eller uten postoperativ metastasering (p = 0,004; t-test). (
B
) forekomst av postoperativ metastaser i CRC pasienter med høy (≥153.02 ng /ml) eller lav ( 153,02 ng /ml) postoperativ plasma OPN nivå. (C) ROC kurve ved hjelp av postoperativ plasma OPN nivå for å skille pasienter med postoperative metastaser fra de uten postoperativ metastasering. (D) Korrelasjonen av postoperativ plasma OPN med sykdomsfri overlevelse av CRC pasienter (p = 0,009; Log-rank test). Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Sammenligning av prognostisk betydning mellom plasma OPN og blod CEA
For å bekrefte at postoperativ plasma OPN nivå var en viktig prognostisk faktor for fremtidig metastase, undersøkte vi de prognostiske verdier av postoperativ plasma OPN nivå og preoperativ plasma OPN nivå for sykdomsfri overlevelse (DFS) av 44 stadium i til III CRC pasienter med grundig drift og oppfølging informasjon. Stage IV CRC pasienter hvor distal metastase kan være til stede før operasjonen ble ekskludert fra denne analysen. Som vist i figur 2D, CRC pasienter med lavere postoperativ plasma OPN nivå viste en signifikant lengre DFS enn de som er over terskelnivået (p = 0,009), mens pre-operative plasma OPN nivå ikke korrelerer med DFS av CRC pasienter (S1 fig). Vi undersøkte også den prognostiske verdien av CEA nivåer (S1 Fig). Verken pre-operative eller postoperativ CEA korrelert med DFS (p = 0,235 og 0,410, henholdsvis).
Risikofaktorer for sykdomsfri overlevelse av CRC pasienter
Vi søkte univariate og multivariate analyser for å bestemme risikofaktorer for DFS av de ovennevnte 44 CRC-pasienter (tabell 2). Blant de kliniske faktorer undersøkt i univariate analysen, ble bare postoperativ plasma OPN nivå signifikant korrelert med DFS. I tillegg er våre multivariat analyse viste at postoperativ OPN nivå og lymfeknutemetastase var risikofaktorer for DFS.
In vitro effekt av forhøyet OPN transkripsjon og sekretoriske OPN nivåer
Til slutt vi undersøkte
in vitro
effekter av OPN overekspresjon på sekretorisk OPN nivå og metastatisk funksjon i CRC celler. Vi først sammenlignet transkripsjons og sekretoriske OPN nivåer av to relativt ikke-metastaserende cellelinjer DLD1 og SW480, og to metastatisk cellelinjer SW620 og HCT116 [19, 20]. Etter 3 dager, begge nivåene var signifikant lavere for DLD1 og SW480-celler sammenlignet med SW620 og HCT116-celler (figur 3A og 3B), noe som tyder på at OPN transkripsjon nivå korreleres med sin sekretorisk nivå og høyt OPN nivå korreleres med det metastatiske potensiale av CRC celler. Vi neste stabilt overexpressed OPN i DLD1 celler og genererte to stabile OPN transfektanter (DLD1-OPN # 1 og DLD1-OPN # 3), uttrykte både høyere nivå av OPN avskrift, protein og sekretorisk protein enn DLD1-vektor kontroll (figur 3C, 3E og 4A). Vi bestemt effekt på spredning, celle invasjon og cellemigrasjon. Våre resultater viste at OPN overekspresjon betydelig indusert cellemigrasjon i DLD1 celler (figur 4B), men endret ikke vekst og celle invasjon evne (S2 fig). For å bekrefte effekten av OPN på celle migrasjon, vi forbigående knock-down OPN uttrykk i DLD1-OPN stabil klone av siRNA teknikk. Sammenlignet med siRNA kontroll transfekterte celler, DLD1-OPN celler transfektert med siOPN vises betydelig lavere nivå av OPN transkripsjon og protein samt sekretorisk OPN protein (figur 3D, 3E og 4D). Enda viktigere, migrasjonsrate var også signifikant trykt følgende siOPN transfeksjon (figur 4E), styrke regulerende rolle OPN på celle migrasjon. Videre undersøkte vi effekten av sekretoriske OPN nivå på cellemigrasjon ved å bruke dyrkningsmedium fra DLD1-OPN stabile kloner eller vektorstyring (1: 1 blandet med ferskt kulturmedium) som kjemoattraktant for cellemigrasjon analyse ved bruk av DLD1 celle som modell. Vi fant ut at dyrkingsmedium med høyere OPN nivå betydelig indusert DLD1 celle migrasjon (fig 4C). I tillegg ble DLD1 cellemigrasjon betydelig svekket ved hjelp av dyrkingsmedium av siOPN transfektert DLD1-OPN # 1 celler når sammenlignet med den for siCTL transfekterte celler (figur 4F).
(
A og B
) Sammenligning av (
A
) transkripsjonelle og (B) sekretoriske OPN nivåer av to svakt metastatiske CRC-cellelinjer (DLD1 og SW480) og to metastatiske CRC-cellelinjer (SW620 og HCT116) (En måte ANOVA) .
(C)
OPN mRNA uttrykk av to DLD1-OPN stabile kloner (DLD1-OPN # 1 og # 3) og vektor kontroll (DLD1-Vector) og effekten av stabil OPN overekspresjon på mRNA uttrykk for EMT regulatorer E -cadherin, Twist og Snail (En måte ANOVA).
(D)
OPN mRNA uttrykk for siCTL eller siOPN transfektert DLD1-OPN # 1 celler og effekten av OPN siRNA på mRNA uttrykk for EMT regulatorer E-cadherin, Twist og Snail (t-test).
(E)
Effekt av OPN overekspresjon eller siRNA på E-cadherin protein uttrykk. GAPDH tjente som lasting kontroll. Densitometry ble utført på den vestlige blotter ved hjelp av ImageJ programvare og en stjerne angir forskjellen var statistisk signifikant (p 0,05) sammenlignet med kontrollgruppen (DLD1-V1 eller DLD1-OPN1 siCTL; En måte ANOVA eller t-test). Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
(
A
) Sammenligning av relative sekretoriske OPN nivåer av to DLD1-OPN stabile kloner (DLD1-OPN # 1 og # 3) med at av DLD1-vektor kontroll (En måte ANOVA). (
B
) Sammenligning av antall DLD1-OPN stabile kloner (DLD1-OPN # 1 og # 3) celler migrert med at av DLD1-vektorkontrollceller (En måte ANOVA). (
C
) Sammenligning av antall DLD1 celler migrert bruker kulturmedium fra DLD1-OPN stabile kloner (DLD1-OPN # 1 og # 3) eller DLD1-vektorstyring som kjemotiltrekkende (En måte ANOVA). (
D
) Sammenligning av relative sekretoriske OPN nivåer av DLD1-OPN # 1 stabil klone transfektert med siRNA kontroll (siCTL) eller OPN siRNA (siOPN) (t-test). (
E
) Effekt av siCTL eller OPN siRNA transfeksjon på migrasjon av DLD1-OPN # 1 stabile celler (t-test). (
F
) Sammenligning av antall DLD1 celler migrert bruker kulturmedium fra DLD1-OPN stabile kloner transfektert med siCTL eller siOPN som kjemotiltrekkende (t-test). Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
I tillegg er våre resultater viste at overekspresjon av OPN i DLD1 celler betydelig indusert transkripsjon av sneglen og Twist, som er indusere av epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) prosessen ved å nedregulere E-cadherin og fremme celle migrasjon, invasjon og metastase [21-23]. Som forventet ble transkripsjon og proteinnivåer E-cadherin betydelig redusert i DLD1-OPN stabile kloner (figur 3C-3E). På den annen side, etter siOPN transfeksjon, ble transkripsjonen av sneglen og Twist undertrykt, og resulterte i økning av E-cadherin transkripsjon og translasjon (figur 3D og 3E). Disse resultatene antydet at induksjon av EMT prosessen er ansvarlig for den forbedrede celle migrasjon av OPN-overekspresjon DLD1 celler.
Diskusjoner
Den samlede prognosen for CRC pasienter er fortsatt ikke tilfredsstillende på grunn av kreft metastaser, derfor er det viktig å utvikle flere biomarkører for å øke den prognose av CRC pasienter ved prediksjon eller tidlig påvisning av okkult metastasering. Blodbaserte, minimalt invasive markører vil bli stadig viktigere på grunn av den enkle og praktiske prøvetakingen. Blood CEA og CA19-9 har vært vanlig vurdert i CRC pasienter, men med varierende resultater avhengig av studiedesign og studiepopulasjonen [4], og deres kliniske tilknytning kreft metastase mangler. Derfor tror vi at utvikling av ytterligere blodbaserte biomarkører vil være avgjørende for å bedre prognosen for metastatisk CRC pasienter.
Økte nivåer av OPN mRNA og protein har blitt vist i CRC sammenligne med ikke-svulstvev [ ,,,0],14-17]. OPN uttrykk er regulert av en rekke stimuli som er forbundet med CRC progresjon og metastase [24-27], som involverer komplekse regulatoriske veier. Forskjellige vekst og differensieringsfaktorer også øke OPN uttrykket, inkludert blodplateavledet vekstfaktor, epidermal vekstfaktor, transformerende vekstfaktor-β, benmorfogene proteiner og inflammatoriske cytokiner [28]. I tillegg er transkribering av OPN også direkte aktivert av et antall av transkripsjonelle regulatorer inkludert Wnt signalisering og TCF-4 [28], som er et velkjent deregulert veien fremme CRC. I nærvær av β-catenin, Tcf-4 samvirker for å stimulere OPN promoter aktivering og proteinproduksjon [29]. Vi har antatt at aktiveringen av disse faktorene og signalveien i løpet av CRC tumorprogresjon induserer OPN ekspresjon og den påfølgende kreftcellemetastase.
Plasma OPN er en potensiell ikke-invasiv prognostisk markør for tumorprogresjon, invasjon og metastase i gastrointestinal -kreft [30]. Mens høy plasma OPN nivå er blitt assosiert med metastatiske egenskaper i en rekke kreftformer slik som magekreft, [31], leverkreft, øsofageal karsinomer [32], nyrecellekarsinom [33], prostatakreft [34] og brystkreft pasienter [35], dens korrelasjon med CRC metastaser har ikke blitt vist så langt.
