Abstract
ortotopiske blærekreft xenografter er avgjørende for å teste nye behandlingsformer og molekylære manipulasjoner av cellelinjer
i vivo
. Nåværende xenotransplantater stole på tumorcelle inokulering av intravesical instillation eller direkte injeksjon inn i blæreveggen. Instillasjon er begrenset av mangel på cellelinjer som er tumorigen når den leveres på denne måte. Den invasive modell påfører sykelighet på mus ved behovet for laparotomi og mobilisering av blæren. Videre er denne fremgangsmåten er komplisert og tidkrevende. Tre blære kreft cellelinjer (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC13) ble inokulert i 50 atymiske nakne mus ved perkutan injeksjon i henhold ultralyd veiledning. PBS ble først injisert i muskelen mellom veggen og mucosa for å skille disse lag, og tumorceller ble deretter injisert inn i dette rom. Bioluminesens og ultralyd ble anvendt for å overvåke tumorvekst. Kontrastforsterket ultralyd ble brukt til å studere endringer i tumor perfusjon etter systemisk gemcitabin /cisplatin behandling. For å demonstrere bevis for prinsippet som terapeutiske midler kan injiseres i etablerte xenotransplantater ledes med ultralyd, ble onkolytisk virus (VSV) injisert inn i UM-UC3 tumorer. Xenograft vev ble høstet for immunhistokjemi etter 23-37 dager. Perkutan injeksjon av tumorceller inn i blæreveggen ble utført effektivt (gjennomsnittlig tid: 5,7 min) og uten komplikasjoner i alle 50 dyr. Ultralyd og bioluminescens bekreftet tilstedeværelse av tumor i fremre blæreveggen hos alle dyr 3 dager senere. De gjennomsnittlige tumorvolumet økt jevnt over studieperioden. UM-UC13 svulster viste en markant nedgang i volum og perfusjon etter kjemoterapi. Immunhistokjemisk farging for VSV-G demonstrert virus opptak i alle UM-UC3 svulster etter intratumoral injeksjon. Vi har utviklet en ny metode for å lage orthotopic blærekreft xenograft i en minimal invasiv måte. I våre hender har dette erstattet den tradisjonelle modellen krever laparotomi, fordi denne modellen er mer tidseffektiv, mer presis og assosiert med mindre sykelighet for musene
Citation. Jäger W, Moskalev jeg, Janssen C, Hayashi T , Awrey S, Gust KM, et al. (2013) ultralydveiledet utført Inokulering av ortotopiske blærekreft xenografter: A Novel høy presisjon tilnærming. PLoS ONE 8 (3): e59536. doi: 10,1371 /journal.pone.0059536
Redaktør: Xiaolin Zi, University of California Irvine, USA
mottatt: 07.01.2013; Godkjent: 15 februar 2013; Publisert: 26 mars 2013
Copyright: © 2013 Jäger et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant finansiering ble gitt gjennom DFG (WJ, www.dfg.de/en, JA 2117 /1-1:1), den kanadiske Cancer Society Research Institute (PCB, www.cancer.ca/Research.aspx, 2010-700527) og en mentor Lege Scientist Award fra Vancouver Coastal Health Research Institute (PCB, https://www.vch.ca/about_us/awards_ _recognition, F08-04967). Den ultralydavbildning plattformen ble finansiert av det kanadiske Foundation for innovasjon (PCB, www.innovation.ca, 27255). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den fjerde vanligste kreftformen hos menn og den niende vanligste kreftformen hos kvinner i utviklede land [1]. I 2010 var det 70,530 hendelsen tilfeller og 14,680 dødsfall fra blærekreft i USA [2]. Omtrent tre fjerdedeler av tilfellene er ikke-muskel invasiv [3]. Disse har en høy tilbøyelighet for tilbakefall og en undergruppe er i fare for progresjon til invasiv sykdom [4]. De resterende en fjerdedel av tilfellene er tilstede som muskel invasiv blærekreft. Til tross for optimal multimodal behandling, vil om lag halvparten av pasienter med muskel invasiv blærekreft bukke under for sin sykdom [5]. Ingen vesentlige gjennombrudd har blitt gjort i de siste to tiårene for å forbedre den systemiske behandling av denne pasientgruppen [6].
Murine modeller av kreft hos mennesker ved hjelp av cellelinjer avledet fra pasient tumorer (xenoimplantater) er et viktig verktøy i kreftforskning. De tillater oss å avhøre tumorbiologi med molekylær manipulasjon, for å identifisere relevante diagnostiske og prediktive biomarkører, og for å teste antineoplastiske effekter av nye behandlingsformer. For blærekreft, inokulering av humane cellelinjer i musen blære (orthotopic xenograft) er referansestandard [7], [8]. Denne tilsetningen kan oppnås enten ved intravesikal instillasjon av tumorceller ( «intravesikal modell») [9] eller direkte injeksjon inn i blæreveggen ( «utført modell») [10]. Alternative modeller omfatter inokulering av murine blærekreftceller i immunkompetente mus (syngen modell) [11] samt transgene modeller [12]. Lignende modeller er også mulig i rotter [13], [14].
Hver ortoptist xenograft modell har sine mangler. Intravesikal instillasjon fører til dannelsen av tumorer på urothelial overflaten av blæren som er mottakelig for etterfølgende intravesical instillation av nye legemidler. Det har imidlertid vist seg å være usedvanlig vanskelig å bruke denne metoden for å oppnå pålitelig tumor ta med eventuelle andre enn KU7 [9], cellelinjer som vi nylig har vist seg å være HeLa [15]. Videre er intravesikal celle inokulering tidkrevende og kan føre til ukontrollert tumorvekst i nærliggende organer (urinrøret, ureter, renal pelvis) [16]. Til slutt, tumor plassering i blæren er uforutsigbar, slik at veksten rundt urinleder åpningene kan forårsake alvorlige øvre veisobstruksjon før mus nå terapeutiske endepunkt.
Direkte injeksjon av tumorceller inn i blæreveggen fører til dannelse av invasiv blæretumorer som er egnet for systemisk behandling [10]. Selv om flere cellelinjer vokse på en pålitelig måte som xenotransplantater i denne modellen, er anvendelsen begrenset av sykelighet påført på mus av behovet for laparotomi og mobilisering av blæren [17]. Det er også teknisk krevende å sikre adekvat injeksjon i blæreveggen, og denne fremgangsmåte er forbundet med en betydelig lærekurve.
Vi har utviklet en ny metode for å løse disse begrensninger av utført inokulering av blærekreft xenotransplantater, og derved potensielt å forbedre nøyaktigheten og reproduserbarheten av denne modellen. Vi har optimalisert perkutan, ultralydveiledet injeksjon av blære kreft celler i fremre blæreveggen. I tillegg er vi i stand til å overvåke xenograft vekst og perfusjon
in vivo
lengderetningen under behandling [18], [19], og vi er i stand til å injisere terapeutiske midler direkte inn i svulsten ledes med ultralyd. Her kan vi demonstrere gjennomførbarhet og reproduserbarhet av ultralydveiledet utført inokulering av ortotopiske blærekreft xenografter samt etterfølgende bildeveiledet manipulasjon og overvåking.
Materialer og metoder
Dyr
femti 10-ukers gamle kvinnelige atymiske nakne mus ble kjøpt fra Harlan (Indianapolis, Indiana, USA). Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene for den kanadiske Council on Animal Care (CCAC). Protokollen ble godkjent av Animal Care komité University of British Columbia (Protocol Antall: A10-0192).
tumorcellelinjer
Den menneskelige blærekreft cellelinjer UM-UC1, UM -UC3 og UM-UC13 ble vennlig levert av patologi kjernen i blærekreft SPORE ved MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas, USA) [20] – [22]. Cellelinje identiteter ble bekreftet ved DNA fingerprinting bruke AmpFlSTR® Identifiler® Amplification protokollen (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [23]. Alle cellelinjer ble dyrket i mindre enn 3 måneder i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære.
For
in vivo
studier cellelinjene gikk transduksjon med en lentiviral konstruere bærer luciferase firefly genet for
in vivo
avbildning [9]. Den luciferase plasmid inneholdt en blasticidin motstand genet slik at positiv utvelgelse med 10 mikrogram /ml blasticidin (Invitrogen, Life Technologies Inc., Burlington, ON, Canada). Cellelinjer ble kontrollert for in vitro luciferase aktivitet og celle nummer ble korrelert med bioluminesens (R 0,99; data ikke vist), ved hjelp av Xenogen IVIS Spectrum (Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA, USA). For xenograft studier cellene ble høstet ved 70% samløpet og suspendert i Matrigel® (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada). Cellekonsentrasjonen ble endret basert på tidligere etablerte vekstkinetikk av de tre ulike cellelinjer (UM-UC1 LUC 9 × 10
6 /ml, UM-UC3 LUC 12 × 10
6 /ml, UM-UC13 luc 11 × 10
6 /ml).
perkutan tumorinokulasjon
Tumor inokulering ble utført med Vevo 770® små dyr bildebehandling plattform (Visual Sonics, Toronto, ON, Canada). En høy frekvens RMV 706 ultralyd skannehode (20-60 MHz), som tillot en lateral oppløsning på 30 mikron og bildefrekvens på opptil 240 fps, ble brukt.
Musene ble bedøvet med isofluran og montert på bildebehandling bord med kontinuerlig overvåking av vitale tegn [fig. 1A]. Buken ble desinfiseres med alkohol og steril ultralyd gel ble brukt. Blæren ble visualisert på skjermen [fig. 1B] og blæren lumen ble fylt med steril, varm fosfatbufret saltløsning (PBS) ved en 24 måler angiocatheter til et ønsket volum på 50-100 ul.
A. Musene ble bedøvet med isofluran og montert på den oppvarmede bilde bordet med kontinuerlig overvåking av vitale tegn. Etter visualisering av blæren med Vevo 700® små dyr avbildning plattformen huden ble perforert med en 30G nål. B. Ultralyd visualisering av normal mus blære i sagittal seksjon med typiske dimensjoner som er angitt (lumen dimensjoner 4,4 x 6,5 mm, veggtykkelse 0,25 mm).
A 1,0 ml sprøyte fylt med PBS og koblet til en 30 måler, ¾ tommers nål (Kendall, Mansfield, MA, USA) ble brakt til huden like over skambeinet i en vinkel på 30 ° med skråkant rettet anteriorly. Etter påvisning av nålen på ultralydskjermen [Fig. 2A], ble det vedtatt gjennom huden og mage veggen muskler [Fig. 2B]. Skråkant av nålen ble snudd 180 ° (rettede posteriort) før spissen ble innsatt i blæreveggen uten penetrering av slimhinnen [fig. 2C]. PBS (50 ul) ble injisert mellom muskellaget og mukosa for å skape et rom [fig. 2D] og nålen ble trukket tilbake. En andre 1,0 ml sprøyte (fylt med kreftceller suspendert i Matrigel®, (BD Biosciences)) med en 30 gauge, ¾ tommers nål ble guidet til den samme plassen [fig. 2E]. 40 ul (UM-UC1 LUC) eller 50 ul (UM-UC3 LUC, UM-UC13 luc) av cellesuspensjonen ble injisert inn i dette rom [fig. 2F].
A. Påvisning av nålen på ultralyd skjermen. B. Perforering av huden og bukveggen muskler. C. Nål innsetting i blæreveggen uten penetrering av slimhinnen. D. Injeksjon av PBS (50 pl) mellom muskellaget og slimhinnen. E. Veiledning av andre nål inn i kunstig skapte rom. F. Injeksjon av tumorceller suspendert i Matrigel®.
I to ytterligere mus agarose ble injisert på en lignende måte for å etablere den nøyaktige plasseringen av xenograft inokulering i blæreveggen. Musene ble umiddelbart avlivet og blæren ble fjernet for histologisk analyse.
Xenotransplantat Vekst Overvåking
Tumorvekst ble overvåket av bioluminesens imaging (BLI) og ultralyd hver tredje dag fra 4 dager etter tumorinokulasjon . Den Xenogen IVIS systemet ble brukt for BLI og mus ble fotografert 10 og 15 minutter etter intraperitoneal injeksjon av D-Luciferin (150 mg /kg kroppsvekt, Firefly, Sylinder Life Science). 3D ultralyd ble utført på bedøvede mus med skanning av blæren som en helhet i trinn på 0,1 mm. Tumorvolumet ble bestemt ved hjelp av Visual Sonics bildebehandling programvarepakke ved analyse av hver femte bildet i henhold til bruksanvisningen [24].
av mikrokontrastforsterket ultralyd undersøkelse av svulster
For å visualisere perfusjon status for xenografttumorer, ble en cine sløyfe registrert som referanse. En andre sløyfe cine (1000 rammer ved 30 Hz) ble registrert 10 sekunder etter injeksjon av 120 ul ikke-målrettede mikrobobler (Visual Sonics) i halevenen til anesteserte mus. Punktet der mikrobobler kom inn i flyet ble bestemt og bakgrunnen referansen ble trukket. Tumoren ble valgt som kontrast region og referanse subtraheres Mean Data ble anvendt. Endringer i kontrast Prosent området over tid ble dokumentert og 2D-bilder ble registrert som et bildepunkt ble markert grønt når en mikroboble gått [24].
Behandling
intratumoral virus-injeksjon.
for å demonstrere potensialet for ultralydveiledet perkutan intratumoral injeksjon av behandlingsmidler i etablerte xenografter, injisert vi onkolytiske virus (VSV) i UM-UC3 LUC xenografter på dag 22 etter vaksinasjon. Tumorbyrde som bestemmes av BLI og ultralyd ble anvendt for å dele dyrene i to forholdsvis like grupper. Tumorene ble visualisert i lengderetningen ved hjelp av ultralyd og en 30G nål ble innsatt i sentrum av tumoren [fig. 3A]. VSV (1,05 x 10
7 pfu) suspendert i 25 ul PBS ble injisert i 7 mus, og PBS alene ble injisert i kontrollgruppen (n = 7).
A. De xenotransplantater ble visualisert ved hjelp av ultralyd og enten VSV (1,05 x 10
7 pfu) ble oppløst i 25 ul PBS eller PBS alene ble injisert gjennom en 30G nål inn til sentrum av tumoren. B. 48 timer etter injeksjon av VSV, alle xenografttumorer viste positiv farging for VSV-G rundt injeksjonsstedet som korrelert til TUNEL flekker. C. VSV-G og TUNEL flekker var negativ etter PBS injeksjon alene.
Systemisk kjemoterapi.
For å demonstrere potensialet for
in vivo
sanntids overvåking av xenograft perfusjon, behandlet vi UM-UC13 LUC tumorbærende mus med cytotoksisk kjemoterapi. På dag 28 etter inokulering, ble musene delt i to like grupper basert på tumorbyrden bestemmes ved hjelp av ultralyd og BLI. Åtte dyr fikk intraperitoneal gemcitabin (120 mg /kg kroppsvekt, SANDOZ, Boucher, QC, Canada) på dag 30 og 35 samt cisplatin (2,5 mg /kg kroppsvekt, Hospira, Saint-Laurent, QC, Canada) på dag 31 og 36. En tilsvarende volum av PBS ble injisert på samme tidspunkter i kontrolldyrene (n = 7).
Histologi
UM-UC3 luc, UM-UC1 luc og UM-UC13 LUC xenotransplantater ble høstet etter 24, 28 og 37 dager, henholdsvis. Ved obduksjon ble bekkenet, retroperitoneum, lever og lunger nøye inspisert for mulige metastaser, og mistenkelig vev ble fjernet. Dette vevet og hele blærer ble fiksert i formalin, innstøpt i parafin og kuttet i 4-mikrometer seksjoner som ble farget med hematoksylin og eosin (H E). Dybde av tumorinvasjon ble bestemt av en patolog (LF). For UM-UC3 svulster en T scenen ble brukt i henhold til 7
th utgaven av det amerikanske Joint Committee on Cancer /International Union Against Cancer (AJCC /UICC) TNM klassifikasjon [25].
Påvisning av apoptotiske celler ved tunel (Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking) teknikken ble utført ved hjelp av Terminal transferase (# 03333566001, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA), dATP (D4788, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og DIG-11-dUTP (# 1558706, Roche Applied Science). Ved hjelp av polyklonale kanin antistoff mot G-protein av VSV (VSV-G; 1:300, ab1874, Abcam, Cambridge, MA, USA) immunhistokjemisk farging ble utført av Ventana Autostainer modell Discover XT (Ventana Medical System, Tuscon i Arizona, USA ) med et enzym-merket streptavidin biotin system og løsemiddelbestandig 3,30-diaminobenyidine Map kit. Alle prøvene ble deretter analysert av en patolog (LF) og andelen av immunoexpression for VSV-G og farging for TUNEL ble oppdaget på 200 × forstørrelser.
Statistical Analysis
For statistiske analyser, den mener Bioluminescens og tumorvolumer med sine standardavvik ble bestemt. Betydningen av forskjellene ble målt ved Students t-test (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) og P 0,05 ble betraktet som signifikant. Regresjon tomter ble brukt for å beskrive sammenhengen mellom bioluminesens og volum.
Resultater
Tumor Cell Inoculation
ultralydveiledet tumorcelle vaksinasjonen ble vellykket utført i 50 dyr (UM- UC1 LUC 20 dyr, UM-UC3 LUC 15 dyr og UM-UC13 luc 15 dyr) [Tabell 1]. Den typiske forsøksoppsett og representative ultralydbilder og dimensjoner av det murine blæren er avbildet i fig. 1. Trinnene med inokulering er vist i fig. 2. Den midlere tid per prosedyre (montering av mus på bordet inntil ferdig injeksjon) kunne bli redusert fra 7,7 ± 3,7 min for den første gruppen (UM-UC3 luc) til 3,4 ± 1,6 minutter for den tredje gruppen (UM-UC1 luc ). Ingen av dyrene led noen komplikasjoner under prosedyren. Injeksjon av agarosegel viste at vaksinen var strengt lokalisert mellom lamina propria og tunica muscularis [fig. 4]
sagittal H . E-delen av en hel muse blære demonstrerer et lag med gel strengt i lamina propria mellom slimhinner og muskularis propria
Xenotransplantat. vekst Overvåking
Alle de 50 dyrene viste påvisbar tumor i fremre blæreveggen på ultralyd på 4
th dagen etter vaksinasjonen. Start- og slutttumorvolum er oppsummert i tabell 1. Etter inokulering av UM-UC3 Luc, en mus viste intraperitoneal tumor spredning og en svulst involusjon etter dag 7. Lignende mønster ble sett med BLI. Alle musene hadde påvisbare luminescens på 4
th dag, og dette økte jevnt i alle unntatt en mus. Den samlede tumor opptakshastigheten var 98%. Disse funnene ble bekreftet ved obduksjon.
I løpet av tumorvekst [Fig. 5A, 5B] forholdet mellom hele tumorvolum og BLI var ikke stabil, men variabelt avhengig av tiden etter tumorcelle inokulering og hele tumorvolumet i seg selv. Selv om det hadde vært en trend mot bedre korrelasjon over tid kurset (R
2 = 0,75, 0,82 og 0,92 for UM-UC1 luc på dag 16, UM-UC3 luc på dag 19 og UM-UC13 luc på dag 34 henholdsvis [fig. 5C]), en drastisk reduksjon av den luminescens per mL tumorvolumet ble lagt merke til ved høye tumorvolumer (data ikke vist) .Vi har tidligere demonstrert en rolle for hypoksi og nekrose i denne sammenheng [17].
Tumorvekst vekst~~POS=HEADCOMP ble målt med jevne mellomrom ved: A. bioluminesens imaging, og B. ultralyd. C. Korrelasjon av biolumine og xenograft volum for alle tre cellelinjer. D. H E-delen av en representant UM-UC1 luc xenograft demonstrere invasiv vekst inn i muskelen (*) uten invasjonen i tilstøtende organer. Alle svulster stammer fra fremre blæreveggen og ofte okkupert det meste av blære lumen uten å infiltrere den bakre veggen (**).
Tre mus (to UM-UC1 Luc og en UM-UC3 luc) ble avlivet av humane grunner knyttet til overdreven tumorbyrde før slutten av planlagt oppfølging
Histologi
Undersøkelse av xenotransplantater på H . E seksjoner demonstrert at alle svulster var invasiv i muskel og noen i perivesical fett, men det var ingen tegn til invasjonen i tilstøtende organer [fig. 5D]. Ingen av de tumorene vokste inn i lamina propria i blæren lumen. Retroperitoneal lymfadenopati ble registrert i 60% av UM-UC13 Luc og 20% av UM-UC3 LUC xenografter. Dette ble bekreftet ved H 0,01). B. Xenotransplantat perfusjon ble målt ved injeksjon og ultralydavbildning av ikke-målrettede mikrobobler i UM-UC13 LUC xenograft før og 5 dager etter administrasjon av kontrollmiddel (PBS, venstre panel) eller systemisk kjemoterapi (gemcitabin /cisplatin, panel til høyre). Perfusjon ble kvantifisert som kontrast prosent området. Representative enkelt resultater ut av 4 målte dyr per gruppe vises.
perfusjon av xenograft tumor ble målt før og etter administrering av systemisk kjemoterapi med uspesifikke mikrobobler. Kjemoterapi førte til en reduksjon i den perfusjonshastighet (Kontrast prosent-området) fra 84% til 66%, mens den samme parameteren holdt seg konstant etter behandling med PBS alene (79% vs. 77%) [fig. 6B].
Diskusjoner
Eksistensen av pålitelige dyremodeller er en grunnleggende forutsetning i onkologisk forskning for in vivo undersøkelser av tumorbiologi og testing av nye antineoplastiske behandlingsstrategier. Til tross for eksistensen av reproduserbar syngenisk [11] og transgene [12] ortotopiske tumormodeller på blærekreft, er de ikke utbredt både på grunn av iboende begrensninger (f.eks tvilsom anvendelighet av syngene modeller av murine blærekreft til human sykdom) og kompleksitet -modeller, så vel som intensiteten av tilhørende ressursutnyttelsen. Ortotopiske xenograft modeller har vist seg å gi størst fleksibilitet (i form av valg av cellelinjer) og har den mest praktisk nytte, og derfor fortsatt gullstandarden for in vivo modellering av blærekreft [7], [8].
i dette arbeidet har vi generert en roman in vivo modell av ortotopiske blærekreft xenografter via inokulering av menneskelige blæren kreftceller inn i murine blæren og har vist at den skal være reproduserbar. Tumorer ble etablert i 98% av musene inokulert ved hjelp av tre forskjellige humane cellelinjer. På grunn av utmerket optisk oppløsning, kan tumorceller inokuleres med høy presisjon strengt tatt inn i den fremre blæreveggen, og dermed redusere frekvensen av obstruktive komplikasjoner og tillate lengre vekst og behandlingsperioder. Dessuten er den tid per inokulasjon kort i forhold til eksisterende modeller, og avtar hurtig med ytterligere erfaring. Den eneste observerte komplikasjon var en intraperitoneal tumor cellespredning som fant sted i en av de første dyrene injisert og kan tilbakeføres til injeksjon av et for stort volum i forhold til størrelsen på dyret. Dette ble støttet av det faktum at å redusere volumet av injeksjons 50-40 ul gav ingen ytterligere komplikasjoner.
Vår modell er en modifikasjon av ortotopisk modell som tidligere beskrevet av Dinney et al. [10]. Vi mener at ultralydveiledet tumorinokulasjon forbedrer denne modellen på grunn av sin letthet, hurtighet, nøyaktighet og redusert grad av invasivitet. Den sistnevnte faktor er ikke bare en av dyrevelferd, men kan også bidra til at reproduserbarheten av eksperimenter ved å redusere ledsagende kirurgiske komplikasjoner. Nøyaktigheten av den standard utført injeksjon gjennom en laparotomi er begrenset av muligheten til å bestemme nøyaktig nål plassering ved injeksjonstidspunktet. Formen og fordelingen av bleb i blæreveggen etter injeksjon vil ofte bekrefte riktig sted, men det er ingen a priori bekreftelse før cellene blir injisert. Dette betyr at en viss andel av musene vil ha celler injisert inn i hulrommet av blæren eller sølt på den serosale overflate av blæren. Med ultralyd teknikk blir et mellomrom opprettes submucosally i blæreveggen med saltløsning, noe som medfører ingen risiko for søl, og den påfølgende tumorcelle inokulering følger lett inn i samme plass under direkte visualisering.
Overvåke tumorvolum etter ultralyd forsterker informasjonen han fikk av BLI i orthotopic xenograft modell. Mens BLI har blitt en integrert del av svulst deteksjon og vekstanalyse, betyr det ikke alltid korrelerer godt med tumorvolumet. Vi har tidligere vist i ortotopisk xenograft modell som tumor perfusjon og hypoksi forvirre forholdet mellom volum og luminescens [17], og det samme er antagelig ansvarlig for de forskjeller som er vist her. Dette gjelder særlig i større svulster [26], mens tidlig etter inokulering ultralyd størrelse kan være unøyaktig på grunn av volumet av injisert fluid, ødem omkringliggende vev, og det faktum at bare en del av injiserte celler overleve og vokse.
en ytterligere fordel med ultralyd er evnen til å injisere nye behandlingsmidler direkte inn i tumoren. Her har vi demonstrert muligheten for intratumoral levering av onkolytiske VSV. Den samme teknikk ville være mottagelig for andre behandlingsstrategier for blærekreft som genterapi eller anvendelse av nanopartikler [27], [28]. Som et eksempel på relevansen av intratumoral injeksjon i behandlingen av kreft hos mennesker, har intratumoral injeksjon av plasmid DNA nylig blitt testet i behandlingen av ikke-opererbar pankreas-kreft [29].
Vi har også vist evnen til å overvåke tumor vaskularisering i løpet av behandling, i dette tilfelle tradisjonelle cytotoksisk kjemoterapi. Denne muligheten vil være spesielt nyttig når man skal vurdere responsen av svulster til nye behandlingsformer, inkludert utvikling av resistens som kan bli reflektert av en unnlatelse av å redusere vascularity.
Den viktigste begrensning av ultralydveiledet tumorinokulasjon er avhengigheten av den ultralydavbildning plattformen, som kanskje ikke er lett tilgjengelig for mange forskere. Videre krever denne modellen kjennskap til ultralydavbildning. På den annen side, komplekse dyr modellering av kreft hos mennesker, akkurat som komplisert kirurgi på menneskelige pasienter, kan best utføres av sentre for fremragende forskning gjennom vitenskapelig samarbeid.
Vår modell ikke nødvendigvis erstatter intravesikal instillasjon av blære cancer-cellelinjer [9], [30]. Den utført modellen er overlegen i forhold til den intravesikal modell for de fleste anvendelser på grunn av muligheten til å bruke flere forskjellige cellelinjer. Den utført modellen, har imidlertid ingen nytte for testing av nye behandlingsformer levert intravesikalt fordi tumorene ikke forstyrre den urothelial flaten (lamina propria) i blæren lumen, og narkotika derfor ikke lett trenge inn i tumoren. Disse svulstene vokse ekspansivt bort fra hulrommet av blæren, slik at legemidler som administreres inn i lumen av urinblæren ikke kan trenge inn i hele dybden av tumoren. Dessuten representerer den utført modell muskel invasiv sykdom, som aldri blir behandlet med intravesikal terapi i klinisk praksis. I intravesikal tumormodell, på den annen side er tumoroverflaten eksponert i blæren lumen og svulsten generelt ikke vokse utover lamina propria i flere uker [9], slik at medikamenter administrert inn i blæren lumen kan tilstrekkelig penetrere svulst. Den mest betydelig begrensning til intravescial modell, er imidlertid sin begrensning til svært få cellelinjer som, selv i de mest erfarne hender, vokse i bare en upålitelig måte.
Konklusjoner
Vi har fått utviklet en teknikk for ultralydveiledet inokulering av ortotopiske blærekreft xenografter som signifikant forbedrer eksisterende modeller av blærekreft. De store fordelene ved denne modellen ligge i hurtighet og letthet av tumor-inokulering, så vel som i den nøyaktighet og reproduserbarhet av modellen. Videre er vi i stand til å overvåke tumorvolumet på langs med ultralyd, for å måle in vivo tumor perfusjon med mikrobobleutskillere kontrastmidler, og å injisere terapeutiske midler inn i svulsten ledes med ultralyd.
Takk
ønsker å takke Ben Deeley for hans hjelp i ultralydavbildning og Eliana Beraldi for hennes assistanse med viral transduksjon av cellelinjer.
