Abstract
Bakgrunn
mikroRNA uttrykket er sterkt forstyrret i kreftutvikling, men begrenset dokumentasjon er tilgjengelig validere resultatene fra celle linjer modeller i kliniske kreftprøver. MikroRNA-21 (mir-21) og mikroRNA-143 (mir-143) er tidligere blitt identifisert som betydelig deregulert i en rekke kreftformer, inkludert kreft i livmorhalsen. Vårt mål var å undersøke uttrykk mønstre av flere godt studert mikroRNA arter i livmorprøver og sammenligne resultatene til cellelinje prøver.
Metodikk /hovedfunnene
Vi målte uttrykk for speil 21 og mir-143 i 142 formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) cervical biopsi vevsblokker, samlet inn fra Dantec Oncology Clinic, Dakar, Senegal. MikroRNA uttrykk analyse ble utført ved bruk av TaqMan-basert real-time PCR-analyser. Protein immunhistokjemisk farging ble også utført for å undersøke mål protein uttrykk på 72 prøver. Vi fant ut at mir-21 uttrykk økt med forverring klinisk diagnose, men at mir-143 ble ikke korrelert med histologi. Disse observasjonene var i sterk kontrast til tidligere rapporter som involverer livmorhalskreft cellelinjer der mir-143 var konsekvent nedregulert men mir-21 i stor grad upåvirket. Vi identifiserte også, for første gang, at cytoplasma uttrykk for programmert celledød Protein 4 PDCD4; et kjent mål for mir-21) var signifikant lavere hos kvinner med invasiv livmorhalskreft (ICC) i forhold til de med cervikal intraepitelial neoplasi (2-3) eller carcinoma
i situ plakater (CIN2-3 /CIS) , selv om det var ingen signifikant sammenheng mellom mir-21 og PDCD4 uttrykk, til tross for tidligere studier som identifiserer PDCD4 transkripsjon som en kjent mir-21 mål.
Konklusjoner
Mens mikroRNA biomarkører har en rekke lovende funksjoner, er flere studier på uttrykk nivåer i histologisk definert kliniske prøver som kreves for å undersøke kliniske relevansen av funnbaserte studier. Mir-21 kan være av noen nytte i prediktiv screening, gitt at vi observert en signifikant korrelasjon mellom mir-21 uttrykksnivå og forverring histologisk diagnose av livmorhalskreft
Citation. Deftereos G, Corrie SR, Feng Q, Morihara J, Stern J, Hawes SE, et al. (2011) Uttrykk for Mir-21 og Mir-143 i Cervical Prøver alt fra Histologisk Normal gjennom til invasiv livmorhalskreft. PLoS ONE 6 (12): e28423. doi: 10,1371 /journal.pone.0028423
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 22 april 2011; Godkjent: 08.11.2011; Publisert: 14.12.2011
Copyright: © 2011 Deftereos et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenne finansiering bidrag fra National Institutes of Health /National Cancer Institute (NIH /NCI) (R01 CA75920 og R01 CA115713, Dr. Kiviat) og den amerikanske Australian Association (Merck selskapet Foundation postdoktorstipend, Dr. Corrie). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tidlig diagnose av kreft strategier er basert på identifisering og validering av biomarkører som er svært indikasjon på sykdomsprogresjon fra normal eller forstadier vev til tidlig invasiv kreft. MicroRNAs er en gruppe av nylig oppdagede korte RNA-arter (~21 nt) som er involvert i reguleringen av genuttrykk i en vev-spesifikk måte, påvirker mange cellulære trasé inkludert spredning, differensiering og apoptose [1]. Det har vist seg at microRNAs er avvikende regulert i invasiv kreft, og kan fungere som tumor-suppressorer eller forsterkere i forskjellige vev og miljøer [2]. Deres siste funn har ført til en rekke studier som tar sikte på å oppdage nye kreft biomarkører (anmeldt i [3] – [5])., Men få har blitt validert i kliniske prøver, særlig de som er representative for pre-cancerous sykdom
microRNAs er av økende interesse for kreftdiagnostikk på grunn av den observasjon at en overraskende liten familie av molekyler kan gi utsøkt spesifisitet i klassifisering vevstyper, reflekterer utviklings avstamning og differensiering tilstand. Lu
mfl.
Utnytte dette ved å bruke en mikroRNA panel av 217 arter å klassifisere dårlig differensierte svulster med høy samstemmighet mens en tilsvarende mRNA panel inneholder ~16,000 arter mislyktes [6]. Videre studier har vist at potensialet for microRNAs å skille mellom kreft undergrupper hvor histologisk diagnose er komplisert eller umulig, å diagnostisere svulster med ukjent opprinnelse og diagnostisere kreft predisposisjon [4].
Undersøkelser bruk av microRNAs som biomarkører for påvisning tidlig kreft har identifisert overraskende blod og vev stabilitet i motsetning til mRNA [7], [8], og utvikling av svært sensitive og spesifikke qPCR prosedyrer er oppmuntrende. Men i alle tilfeller hittil, ble prøver trukket ut fra pasienter som allerede hadde utviklet kreft [4], slik at anvendeligheten av mikroRNA som en markør for progresjon av kreft fra forstadier frem til begynnelsen av invasive til kreft er ukjent. Undersøkelse av mikroRNA uttrykk i prøver som spenner over hele spekteret av histologisk definert prøvetyper, fra normal til invasiv kreft, er klart nødvendig å riktig bestemme nytten av mikroRNA uttrykk nivåer som kreft biomarkører.
Livmorhalskreft er en sykdom for som lagdeling av histologiske typer fra normal gjennom til invasivt karsinom er godt preget og støttet av molekylære teknikker basert på HPV genotyping. Men gitt den enorme suksessen til livmorhalsscreeningprogrammer, bare 35-65% CIN-3 /CIS, 12-20% CIN-2 og mindre enn 5% CIN-1 sakene ventes å utvikle seg til mer alvorlige former for dysplasi eller invasiv kreft – tyder på at markører med en høyere prediktiv verdi for progresjon ville være meget ønskelig [9], [10]. Vi identifiserte derfor livmorhalskreft som en ideell test for å følge endringer i spesifikke mikroRNA uttrykk fra normalnivå gjennom forstadier og kreft vev. Tidligere studier har identifisert en rekke av abnorme regulerte microRNAs i livmorhalskreft cellelinjer, med Mirs-127, 9, 203, 199A, 218, 21, 143, 205, 214 126, 15b, 16, 146a og 155 blant de vanligste [3 ], [11] – [17]. Men bare én av disse studiene inkluderte forstadier til livmorhalsprøver (CIN1-3), hvor høy biologisk variasjon ble sett i en mikroRNA uttrykk nivåer, spesielt i normale prøver (riktignok med lave utvalgsstørrelser) [16].
i denne studien undersøkte vi uttrykket profiler av to microRNAs (mir-21 og mir-143) og deres tidligere validerte mål proteiner i kliniske prøver fra kvinner med HPV-infeksjon uten skader, med histologisk diagnostisert forstadier til kreft, eller med invasiv kreft ( ICC), så vel som normale kontroller uten HPV-infeksjon. Sekvensene ble valgt basert på tidligere funn fra andre grupper som identifiserer betydelig deregulering over en rekke livmorhalskreft cellelinjer og noen begrensede Dypfryst prøver [12]. Vårt primære mål var å finne ut om det var signifikante sammenhenger mellom mikroRNA uttrykk og histologisk type som kan vise til en potensiell rolle for mikroRNA som en tidlig markør for onkogene potensialet i pre-angrepne HPV infeksjon og /eller progresjon av forstadier til kreft til kreft. For det andre, sammenlignet vi mikroRNA ekspresjon i kliniske prøver og kreft-cellelinjer for å bestemme om cellelinjer bør fortsette å bli brukt som en basis for kliniske undersøkelser. Vi identifiserte en signifikant sammenheng mellom mir-21 uttrykk og histologisk diagnose, men ingen sammenheng med mir-143. Vi har også undersøkt uttrykk for kjente mir-21 target proteiner (PDCD4, PTEN (fosfatase og tensin homolog), TPM1 (tropomyosin 1)) ved immunhistokjemi analyse og identifisert en signifikant sammenheng mellom cytoplasma PDCD4 uttrykk og histologisk diagnose. Vi identifiserte avvik mellom kliniske prøver og livmorhalskreft cellelinjer, noe som tyder på at kliniske prøver må undersøkes for valideringsformål etter oppdagelsen av kandidat biomarkører i cellelinje discovery-fokuserte studier.
Resultater
mikroRNA uttrykk i livmorhalskreftcellelinjer
Vi undersøkte uttrykk for mir-21 og mir-143 i livmorhalskreft cellelinjer med hensyn til (Normal (HRHPV-) for å bekrefte tidligere observasjoner. Figur 1 viser at for alle tre kreftcellelinjer testet (Siha, CaSki, HeLa), var det ingen entydig forskjell mellom mir-21 ekspresjon og den til normale prøver. imidlertid mir-143 ekspresjon av alle tre cancercellelinjer ble vesentlig redusert med hensyn til kliniske prøver vi har imidlertid ikke festet statistisk analyse av disse sammenligningene på grunn av de forskjellige feilfordelte kliniske prøver og cellelinjer, og fordi vi ville bare ha
n
= 3 i tilfelle av cellelinjene for sammenligning.
Mir-143 var signifikant nedregulert i alle tre livmorhalskreft cellelinjer, i samsvar med tidligere studier. Men mir-21 var ikke signifikant forskjellig fra de normale prøver, selv om det i tidligere studier mir-21 har blitt observert å være signifikant oppregulert i samme cellelinjer.
mikroRNA uttrykk i klinisk prøvene
i motsetning til celle linje, observerte vi en signifikant sammenheng mellom mir-21 uttrykk og histologisk type i kliniske prøver, men ingen forening for mir-143 (figur 2 og tabell 1). Kvinner med ICC viste signifikant økt mir-21 uttrykk nivåer sammenlignet med kvinner med CIS /CIN2-3, CIN1, normal (HRHPV +) og normal (HRHPV-) (ANOVA,
p
0,0001). Videre kvinner med CIS /CIN2-3 hadde marginalt økt mir-21 uttrykk nivåer sammenlignet med kvinner med CIN1 (
p
u
= 0,14 og
p
a
= 0,24 ) og normal (HRHPV +) (
p
u
= 0,07 og
p
a
= 0,14). Vi fant ingen sammenheng mellom alder eller HRHPV status og histologisk type (data ikke vist). En cutoff av 5,06 beste fornem ICC /Normal (HPV) populasjoner (bestemt fra ROC kurve) og var 91% sensitiv og 87% bestemt. Figur 2 viser hvordan det cutoff faired for de to andre histologiske grupper. Kun 5% av prøvene fra kvinner som er Normal (HPV +), 7% av CIN 1, og 24% av CIN 2-3 /SUS prøver hadde MIR-21-verdier større enn 5,06. Interessant, 13% av prøver fra kvinner med Normal (HPV) histologi viste mir-21 uttrykk nivå høyere enn 5,06.
I motsetning til celle linjer data presentert i figur 1, observerte vi en signifikant sammenheng mellom økt mir-21 uttrykk en forverring histologisk diagnose, men ingen signifikante sammenhenger for mir-143. Det var en signifikant forskjell mellom alle histologiske grupper (ANOVA,
p
-verdi 0,0001) og videre, kvinner med CIS /CIN2-3 hadde marginalt høyere mir-21 uttrykk nivåer sammenlignet med de klassifisert som Normal /HRHPV + (
p
u
= 0,0375
p
a
= 0,0563).
PDCD4, PTEN og TPM1 uttrykk
for å undersøke effekten av mir-21 deregulering på vev-spesifikk mål-protein ekspresjon i kliniske prøver, vi målte protein ekspresjonsnivåer av PDCD4 og PTEN ved immunhistokjemi (IHC) i 72 av prøvene som ble testet for mir-21 ekspresjon . TPM1 ekspresjon ble evaluert på en undergruppe av prøvene, men nivået av TPM1 ekspresjon i cervikal epitel ble funnet å være under grensen for deteksjon ved immunhistokjemi. Vi har observert en signifikant sammenheng mellom cytoplasmiske PDCD4 (cPDCD4) ekspresjon og prøve histologi (tabell 2, figur 3 og figur 4). Prøver fra kvinner med ICC hadde signifikant lavere cPDCD4 uttrykk i forhold til de med CIN2-3 /CIS (pu = 0,0005 eller pa = 0,003) og marginalt lavere uttrykk i forhold til (HRHPV +) (
p
u
= 0,03 eller
p
a
= 0,11). Kvinner i normal (HRHPV-) gruppen hadde signifikant lavere cPDCD4 uttrykk i forhold til SUS /CIN2-3 (
p
u
= 0,005 eller
p
a
= 0,02) . Det syntes også å være en marginal nedgang i kjerne PDCD4 (nPDCD4) hos kvinner med ICC i forhold til de med CIN2-3 /CIS. Det var ingen signifikant korrelasjon mellom PDCD4 uttrykket (nukleær eller cytoplasma) og mir-21-ekspresjon i disse eksemplene, men vi har observert en generell gruppering av ICC med høy mir-21, men ikke PDCD4, og CIN-2,3 /CIS med høyere PDCD4 men ikke-forhøyede mir-21 (figur 4). Det var heller ingen sammenheng mellom PTEN protein uttrykk og prøve histologi eller mikroRNA uttrykk. Vi vurderte å analysere IHC av både frekvensen av den maksimale intensitet stillingen og frekvensen av den fremherskende intensitet. Men observerte vi tilsvarende resultater i forhold til kompositt poengsum analyse og funnet ut at det er ingen fordel for å bruke frekvensen av intensitetspoeng i løpet av de sammensatte score.
Her observerte vi en signifikant sammenheng mellom cytoplasma PDCD4 uttrykk og prøven histologi.
Diskusjoner
Mens mikroRNA uttrykk profilering har vist seg å være svært spesifikke for kreft skrive, svulst diagnostisering og identifisering av svulster med ukjent opprinnelse, er det ikke ennå klart om microRNAs kan utføre som markører for sykdomsprogresjon – en avgjørende forutsetning for å identifisere de forhold som krever behandling. Ideelt sett ville slike markører for progresjon viser systematiske endringer i uttrykk i forstadier vev, som korrelerer med sykdomsprogresjon til invasiv kreft. Åpenbart krever adgang til et stort antall kliniske prøver som dekker området fra histologisk definert vevstyper som er involvert i sykdomsprogresjon. I denne studien undersøkte vi uttrykket nivåer av to viktige microRNAs identifisert i litteraturen (og deres validerte protein mål) i livmorvevet stratifisert etter histologisk diagnose for å fastslå deres nytte som biomarkører for tidlig kreftdiagnose. Vi fant ut at mir-21 uttrykk ble betydelig økt bare i ICC med hensyn til andre kliniske prøver, og at mir-143 uttrykk korrelerte ikke med histologi i det hele tatt. Livmorhalskreft cellelinje resultater, mens i samsvar med tidligere studier på samme cellelinjer, syntes å gi uharmoniske mikroRNA uttrykk resultater i forhold til kliniske prøver. Interessant, PDCD4 protein uttrykk økt i forstadier til kreft deretter sank betydelig i ICC, muligens som en effekt av mir-21-indusert stanse. Disse resultatene understreker behovet for ytterligere studier som fokuserer på vev profilering i innstillingen til cellelinjer, der uttrykk nivåer av kandidat mikroRNA biomarkører kan vurderes i pre-cancerous sykdom, hvor deres nytte i kreftdiagnostikk vil være mest gunstig. Vi identifiserte viktige stemmer i mikroRNA uttrykk profiler i våre kliniske prøver i forhold til livmorhalskreft cellelinjer. Men nyere undersøkelser viser betydelige forskjeller i mikroRNA uttrykk basert på celledyrkningsforholdene tyder på at cellelinje eksperimenter ikke kan være særlig informativ når du søker etter klinisk relevante microRNAs [12]. Cheng
et al.
2005 [18] viste signifikant økning i HeLa cellevekst og proliferasjon i respons til hemming av mir-21, mens Yao
et al
2009 [14] viste signifikant reduksjon i cellevekst og proliferasjon for den samme behandling. Wang
et al
2008 [12] videre viste at endring dyrkningsforhold fra en monokultur til en suspensjon flåte kultur førte til et helt annet sett med betydelig deregulerte microRNAs. Lignende uharmoniske resultater har blitt sett i andre studier å undersøke relevansen av cellekultur modeller i forhold til
in vivo
vev av kuleformede kulturer [19], [20]. Dessuten har andre gene /proteinekspresjon forskjeller nylig blitt identifisert, inkludert tilstedeværelse av WNT5A ekspresjon i mage kreft (ikke uttrykt på cellelinjer) [21] og forskjeller i DNA-metylering [22] og gen-ekspresjon [23] signaturer mellom kolorektal karsinom og tykktarmskreft cellelinjer. Åpenbart et sentralt problem med cellelinjen tilnærmingen er at potensielle biomarkører er identifisert i celler udødelig fra invasiv kreft – det er ofte helt ukjent om disse biomarkører kan påvises i premalign sykdom, som krever analyse av kliniske prøver. En ytterligere komplikasjon i denne studien kan være rasebakgrunn (vestafrikanske) i forhold til kreftcellelinjer som er kaukasisk – men lite informasjon er kjent om slik variasjon
Økt mir-21 uttrykk har blitt identifisert i. et stort antall tumortyper [24] – [29], og i denne studie har vist signifikant sammenheng med utviklingen av histologisk definerte ICC. Videre viser våre resultater at mir-21 kan være av noen nytte i å forutsi utviklingen av forstadier til kreft i ICC, som kvinner med høye mir-21 verdier kan forventes å utvikle seg. Imidlertid er flere studier som involverer større utvalgsstørrelser og oppfølging av pasientene nødvendig å undersøke dette aspektet, så er det helt klart ikke tilstrekkelige data for riktig testing av denne hypotesen ved å splitte opp trening og testing sett. Videre, mens de mir-21 ekspresjonsnivåene av kvinner med normal patologi med og uten HRHPV infeksjon er ikke signifikant forskjellig, den HRHPV- gruppen viste tilnærmet dobbelt så mange sampler over den optimale cut-off i forhold til HRHPV + gruppen. Betydningen av dette resultatet er igjen vanskelig å kvantifisere på grunn av den forholdsvis lave prøvestørrelser som er involvert, men det kan tyde på at et panel av biomarkører kan være nødvendig for å bidra til å redusere falske positiver.
En rekke studier har identifisert mir -143 som betydelig underexpressed i kreft, inkludert bryst og livmorhalskreft [12], [17], [30]. Mens vi også observert betydelig underexpression i livmorhalskreft cellelinjer med hensyn til normale (HRHPV-) prøver, fant vi ikke noen statistisk signifikante assosiasjoner med hensyn til kliniske prøver fra kvinner over et bredt spekter av neoplastisk sykdom. Tidligere studier som undersøker mikroRNA uttrykk i livmorhalsprøver igjen viser motstridende resultater. Lee
et al
2008 [11] inkluderte ikke enten mir-21 eller mir-143 i sine innledende screening eksperimenter og som sådan ikke identifisere disse artene som er involvert i kreftutvikling; Dette fremhever en klar utfordring i å identifisere potensielle biomarkører, i tilfeller hvor ledende kandidatene blir ignorert. Men Wang
et al
2008 [12] antydet at reduksjon av mir-143 var nødvendig for tumorutvikling mens Lui
et al
2007 [17] viste blandede resultater for mir-143, hovedsakelig på grunn av det lave nivået av ekspresjon detektert i enten normale eller cancerprøver. Uoverensstemmelser kan skyldes den relativt lavt nivå mir-143 uttrykk i cervical vev, som kan kreve en mer presis utvinning metoden (
f.eks
laser mikrodisseksjon) for svulst utvinning – ingen av de som er oppført her brukt slike metoder studier.
Tidligere studier viser at PDCD4, PTEN og TPM1 er alle utskrifter målrettet av mir-21 i ulike vev [14], [17], [24], [26], [31], [32] og som PTEN progressivt underexpressed fra normalt vev gjennom til livmorhalskreft [33] – [35]. En fersk studie har også rapportert redusert PDCD4 uttrykk i livmorhalskreft cellelinjer [14] som er i overensstemmelse med våre funn i kliniske prøver undersøkt i denne studien. Faktisk nyere studier har vist ikke bare en direkte sammenheng mellom PDCD4 uttrykk og tumorprogresjon (Wei
et al
2009 [36]), men også en sentral rolle i PDCD4 og mir-21 i apoptotisk inflammatorisk respons (Sheedy
et al
2009 [37]). Videre har nylige studier støtter celle modell antyder en rolle for tap av PDCD4 ekspresjon i økt sensitivitet av celler til stoffer som forårsaker DNA-skade (Singh
et al
, 2009 [38]), som alle ville forventes å gi gunstige forhold for tumorvekst. Mus som uttrykker høye nivåer av PDCD4 er også mer motstandsdyktig mot tumorvekst i forhold til normale kontroller. Vi hypoteser at cPDCD4 uttrykket (og, i mindre grad, nPDCD4 ekspresjon) er økt i premalign prøver på grunn av økt apoptose, etterfulgt av en kraftig nedgang i ekspresjon for ICC prøver, hvor apoptotiske mekanismer er subverted. Lignende trender har blitt observert for andre tumorsuppressorgener i forhold til onkogenese og apoptose [39], [40]. Interessant, vi har ikke identifisert noen sammenheng mellom PTEN uttrykk og histologisk diagnose; tap av uttrykket har blitt nevnt tidligere, og vi har observert lavere uttrykk i en brystkreft studie ved hjelp av de samme metodene (data ikke vist).
I denne studien har vi funnet at uttrykket nivået av mir-21 er signifikant korrelert med histologisk diagnose av ICC. En kjent mål for mir-21, PDCD4 ble også downregulated men var ikke signifikant korrelert med mir-21 uttrykk. Uttrykk for mir-143 ble ikke korrelert med histologisk diagnose av kliniske prøver, men det var signifikant nedregulert i livmorhalskreft cellelinjer. Disse funnene er viktige i forsøk på å måle nytten av mikroRNA biomarkører for diagnostiske applikasjoner, en viktig del av disse er å måle uttrykk nivåer i forstadier vev samt normale og invasiv kreft. Åpenbart må det videre arbeidet fokusere på klinisk relevante prøver, hvor prediktive markører uttrykt i pre-kreftvev kan identifiseres for videre validering.
Materialer og metoder
Valg av microRNAs
Mirs undersøkt i denne studien ble valgt basert på tidligere observasjoner i litteraturen (Tabell 3). Vi spesifisert at hver mikroRNA bør også ha en eksperimentelt verifisert mRNA-mål eller sett av målgener og minst ett av de forut mål måtte bli rapportert som involvert i onkogenese og progresjon i livmorhalsen eller andre svulster (basert på sekvensene i miRBase databasen [ ,,,0],41] – [43]). MiR-21 er rapportert å være overuttrykt i en rekke kreftformer [29], [44] og mål transkripsjoner av
PTEN product: [24],
TPM1 product: [26] og
PDCD4 product: [14], [31], [32] gener, mens MIR-143 er underexpressed i mange kreftformer og mål
ERK5
transkripsjoner [17], [29], [30]. Både mir-21 overekspresjon og mir-143 underexpression har blitt observert i livmorhalskreft cellelinjer og kliniske prøver [12], [17].
Prøver
Kliniske prøver ble samlet inn fra den Dantec Oncology Clinic, Dakar, Senegal fra studier av livmorhalskreft [45]; alle studie prosedyrene ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i University of Washington (Seattle, Washington) og Universitetet i Dakar (Dakar, Senegal) og informert skriftlig samtykke ble gitt av deltagerne. Histologiske diagnoser ble produsert ved University of Washington, Avdeling for patologi, Harborview Medical Center, Seattle, WA av en patolog (NBK). Prøver tatt inkluderte 142 cervical biopsi bevart som FFPE- vevsblokker. HPV genotyping ble utført som tidligere beskrevet [46], med høyrisiko HPV (HRHPV) subtyper HPV16 /18/26/31/33/35/39/45/51/52/53/56/58/59/66 /67/68/73/82 som definert av Munoz
et. al.
2006 [47]. Kliniske prøver ble gruppert etter histologisk diagnose, med grupper som er definert av behandlingsregimer per gjeldende retningslinjer [48]. Normal (HRHPV-) identifisert disse kvinnene med en normal histologi og et negativt testresultat for HRHPV (
n
= 23). Normal (HRHPV +) indikerte disse kvinnene med en normal histologi og en positiv test for HRHPV (
n
= 21). Mildt dysplastiske CIN1 lesjoner (
n
= 15) vanligvis spontant regress og kvinner med disse lesjonene er vanligvis fulgt med gjenta celleprøve. Kvinner med forstadier CIN2-3 /CIS lesjoner (
n
= 51) vil alle bli henvist til behandling for å hindre utvikling av invasiv sykdom ICC (
n
= 23). Disse grupperinger tillatt oss å avgjøre om mikroRNA biomarkører under etterforskning kunne identifisere ulike stadier av neoplastisk sykdom som krever forskjellig klinisk ledelse. Gjennomsnittsalderen for de 133 fag fra som kliniske prøver ble brukt var 44 som strekker seg fra 29 til 72 år. Alle fire histologiske gruppene var frekvensen matchet på alder for å oppnå tilsvarende aldersfordeling og midler, som varierte mellom 43 og 45 år. Cellelinjer og kultur media ble kjøpt fra ATCC og Gibco (Invitrogen, Carlsbad, California).
mikroRNA qPCR uttrykk analyse
Utvinning av mikroRNA fra blokker ble utført ved hjelp av RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, California), i henhold til produsentens instruksjoner. Den eneste endringen var at for cellelinje utvinning, de deparaffination trinnene ble utelatt på råd fra Applied Biosystems ansatte. Revers transkripsjon (RT) reaksjoner og kvantitative polymerase kjedereaksjoner (qPCR) ble utført ved hjelp av mikroRNA TaqMan Reverse Transcription Kit og TaqMan mikroRNA Analyser (Applied BioSystems) for mir-21, mir-143 og RNU6B kontroll shRNA. RT og qPCR for RNU6B kontroll shRNA-analyse ble utført side-ved-side med de mir-21 og mir-143 reaksjoner for hver prøve. En standardkurve ble generert ved å trekke total RNA fra VK2 celler og utføre RT reaksjoner på 10-fold fortynninger, senere inkludert hver serie fortynning i hver qPCR løp, gjennom hele studiet.
Immunohistochemistry
PDCD4 kanin polyklonale antistoff og TPM1 monoklonalt antistoff ble kjøpt fra Abcam (Abcam Inc., Cambridge, MA, ab51495, ab17784 henholdsvis), ble PTEN monoklonalt antistoff kjøpt fra Dako (Dako Corporation, Carpinteria, CA, klone 6H2.1) Fire- micron deler av formalinfiksert parafin-embedded vev ble kuttet og plassert på Superfrost Plus objektglass. Vevssnittene ble deparaffinized og rehydrert gjennom en rekke graderte alkoholer. Antigen henting ble gjennomført med Tris /EDTA pH 9,0 buffer i en tabletop autoklav. Endogen peroxydaseaktivitet ble blokkert med 3% H
2o
2. Primære antistoffer ble variert for å bestemme den optimale antistoffkonsentrasjonen som resulterer i den mest intense farging med ingen bakgrunn. Antistoffer for PDCD4 ble fortynnet 1:2000 og PTEN antistoff ble fortynnet til 1:500 og brukes på hvert lysbilde. TPM1 antistoff ble fortynnet til 1:100.The ble objektglassene vasket i ImmPRESS (Vector Laboratories, Burlingame, CA), ble deretter en anti-mus (for PTEN og TPM1) og en anti-kanin (for PDCD4) IgG polymerisert reporter-enzym påført til hver vev. Fargeutvikling ble oppnådd ved inkubasjon i diaminobenzidin (Dako). Skinnene ble kontra i hematoxylin (Dako), dehydrert gjennom graderte alkoholer, ryddet i xylen, og coverslipped med permanente monterings media. En negativ kontroll vev ble kjørt på hvert vev, hvor antistoff-fortynningsmiddel-buffer ble byttet ut med det primære antistoff. I tillegg ble det positive kontroll vev som er kjent for å uttrykke antigenet i spørsmålet kjøres i forbindelse med hvert parti av lysbilder. PDCD4 og PTEN farging ble evaluert semi-kvantitativt ved hjelp av H-poengsum scoring metode [49]. Denne fremgangsmåten for mengdebestemmelse tar hensyn til fargeintensitet og prosentandelen av celler flekker ved en bestemt intensitet. Fargeintensitet ble scoret som 0 (ingen farging), en (svak farging), 2 (moderat farging), 3 (intens farging). Hver intensitet resultatet ble multiplisert med prosentandelen av celler flekker på det nivået. De resulterende verdier ble summert for å gi et sammensatt score i området fra 0 til 300. PDCD4 og PTEN ekspresjon ble evaluert i både de nukleære og cytoplasmiske kamrene.
statistiske metoder
Taqman qPCR reaksjoner ble utført i triplikat redundans og Ct-verdiene konverteres til en-forhold med hensyn til den RNU6B kontroll. Non-kreft kontrollene var frekvens age-matchet til tilfeller med invasiv kreft. Verdier for begge microRNAs var log
10-forvandlet for å normalisere fordelingen av disse målingene for alle statistiske analyser. ANOVA ble brukt til å sammenligne alle histologiske gruppene med hensyn til de kontinuerlige faktorer av interesse. P-verdier er rapportert som ujusterte (
p
u
) og justert for multiple sammenligninger ved hjelp av falske funnrate (
p
a
). Receiver Operating karakteristiske (ROC) kurver ble brukt til å vurdere forutsigbarhet av livmorhalssykdomsprogresjon. Optimale cutoffs var fast bestemt på å best skille Normal (HPV) kvinner fra kvinner med ICC. En tosidig 0,05 testnivået bestemmes statistisk signifikans for alle analyser. Alle analyser ble utført ved bruk av SAS versjon 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC).
Takk
Forfatterne ønsker å takke Pap Toure, Papa Salif Sow, og Amadou Dembele for deres klinisk arbeid, rekruttering og ledelse av studiepasienter, og innsamling av prøver i Senegal. I tillegg ønsker vi å takke Donna Kenney og Limin Hu for sin teknisk assistanse i lagring, forberede og seksjonering prøve blokker.
