Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige kreftformer. Økende forekomst og dødelighet viser at det fortsatt er mye mangler i diagnostisering og behandling av sykdommen. Dette er delvis på grunn av mangel på spesifikke symptomer i tidlige stadier av sykdommen. Mange vekstfaktorreseptorer har blitt assosiert med kreft i bukspyttkjertelen. Her har vi undersøkt om en RNA interferens tilnærming rettet mot IGF-IR kan være effektiv mot kreft i bukspyttkjertelen vekst og metastasering. For at vi evaluert effekten av IGF-1R hemming ved hjelp av små interfererende RNA (siRNAs) på tumorvekst og metastasering i VVS og PANC-1 bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Vi fant ut at å kneble IGF-1R hemmer kreft i bukspyttkjertelen vekst og metastasering ved å blokkere viktige signalveier slik AKT /PI3K, MAPK, JAK /STAT og EMT. Dempe IGF-1R resulterte i en anti-proliferativ effekt i PANC-1 og HPAC bukspyttkjertelcancercellelinjer. Matrigel invasjonen, transwell migrasjon og sårtilheling analyser avslørte også en rolle for IGF-1R i metastatiske egenskaper kreft i bukspyttkjertelen. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av Western blotting analyse av viktige mellomprodukter som er involvert i spredning, epitelial mesenchymale overgang, migrasjon og invasjon. I tillegg soft agar-analyser viste at stanse IGF-1R også blokkerer kolonidannende egenskapene til kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro.
Western blot, så vel som, flowcytometrisk analyse viste induksjon av apoptose i IGF-1R dempede celler. Interessant, tie IGF-1R også undertrykkes uttrykk for insulin reseptor β. Alle disse effektene sammen betydelig kontrollere kreft i bukspyttkjertelen cellevekst og metastasering. For å konkludere, våre resultater viser betydningen av IGF-1R i bukspyttkjertelkreft
Citation. Subramani R, Lopez-Valdez R, Arumugam A, Nandy S, Boopalan T, Lakshmanaswamy R (2014) Targeting Insulin-Like Growth Factor 1 Receptor hemmer kreft i bukspyttkjertelen vekst og metastasering. PLoS ONE 9 (5): e97016. doi: 10,1371 /journal.pone.0097016
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 06.01.2014; Godkjent: 15 april 2014; Publisert: 8. mai 2014
Copyright: © 2014 Subramani et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av Texas Tech University Health Sciences Senter Paul L. Foster School of Medicine midler. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall, selv om det er bare den trettende vanligste kreftformen i verden [1]. Den 5 års overlevelse hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er den laveste rapportert for en hvilken som helst kreft, som er mindre enn 1% [2]. Dette er hovedsakelig fordi kreft i bukspyttkjertelen er vanskelig å oppdage på tidlige stadier grunn av mangel på tidlige varseltegn eller symptomer [1]. Bukspyttkjertelen duktale adenokarsinom (PDAC), som er den vanligste formen for denne ekstremt aggressiv kreft, er svært invasiv og metastatisk og er svært motstandsdyktig mot alle former for eksisterende terapier [3]. Pasienter som er diagnostisert med PDAC i avanserte stadier har lite håp om effektiv kirurgisk reseksjon [1] og andre behandlinger som stråling, kjemoterapi (gemcitabin, 5-flurouracil, cisplatin, paclitaxel, docetaxel, etc.) eller målrettet terapi (Erlotinib-Tarceva) [4] tilbyr foreløpig ikke mye nytte heller. Den asymptomatisk natur av sykdommen i en tidlig fase har sørget for at PDAC fremdeles en dødelig og nesten botemiddel kreft til tross for flere forsøk på å finne bedre behandlingsstrategier [5]. Ifølge den siste rapporten, er ca 280 000 nye bukspyttkjertelkreft tilfeller diagnostisert globalt og forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen fortsetter å øke [6], [7]. Økende forekomst og dødelighet viser at det fortsatt er mye mangler i diagnostisering og behandling av sykdommen. Derfor er det absolutt nødvendig å finne bedre diagnostiske og terapeutiske strategier for behandling av denne sykdommen.
Mange vekstfaktorreseptorer så som insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-1R), epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) , etc., blir avvikende uttrykt i mange typer kreft, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [8]. Økte IGF-1 R-ekspresjonsnivåer er forbundet med økt risiko for utvikling av forskjellige neoplasmer [9]. IGF-1R signaleringsaksen er sterkt aktivert i løpet av den tidlige fasen av lunge carcinogenesis, hvor en rolle for IGF-1 R-signalering ble demonstrert ikke bare i primær tumordannelse, men også i progresjon til mer aggressiv lunge adenokarsinom [10]. Jie Tang et al., 2013 rapporterte høye uttrykk nivåer av IGF-1R i tumor vevsprøver fra 25 av 36 pasienter med epitelial eggstokkreft. De rapporterte også konsekvent høyere nivåer av IGF-1 i primærcancercellekulturer (230 ng /ml) sammenlignet med normale vev ovarie-cellekulturer (101,9 ng /ml) [11]. IGF-1 R-signalering aktiverer intracellulære signaleringskaskader som omfatter fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K), AKT, Rac og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) [12], [13]. Disse banene regulere nøkkelgener som er involvert i forskjellige cellulære funksjoner som proliferasjon, overlevelse, differensiering, apoptose transformasjon og [10]. Videre rettet IGF-1R 70-100% av de sentrale metabolske veier som ofte endres i PDAC patogenesen [14]. Målrette IGF-1R har allerede vist seg å forbedre den terapeutiske effekten av mTOR-hemmere i metastatisk nyrecellekarsinom, [15]. Likeledes, i human ovarialcancer, rettet mot IGF-1R med antisense-nukleotid redusert proliferering med 70% og clonogenicity med 10 gangers [11]. I både in vitro og in vivo systemer, ble en IGF-1 R-antagonisten (monoklonalt antistoff MK-0646) vist til en betydelig nedregulere X-bundet hemmer av apoptose (XIAP) protein, noe som er blitt vist å være involvert i celleoverlevelse og inhibering av celledød i kolorektal kreft [16]. Dessuten har IGF-1R målrettet terapi allerede flyttet fremover i fase I kliniske studier for prostata, bryst, colorectal, lever, synovial sarkom, etc., [12], [17] – [19] med lovende innledende resultater. Men den potensielle nytten av å bruke IGF-1R målrettet terapi i kreft i bukspyttkjertelen er ikke fullt utforsket. Videre er det fortsatt mangel på detaljert kunnskap om de nøyaktige molekylære mekanismer som IGF-1R regulerer bukspyttkjertelen kreftutvikling.
Derfor basert på montering bevis for effekten av målretting IGF-1R i et bredt spekter av kreft har vi bestemt virkningene av målretting IGF-1R i bukspyttkjertelkreft i denne studien. Det endelige målet med denne studien er å identifisere om IGF-1R signalering er en effektiv terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen med potensial til å oversette raskt inn i klinisk bruk. Her viser vi tydelig at blokkering IGF-1R uttrykk øker apoptose og undertrykker celle invasjon, migrasjon og metastasering via modulering av PI3K /AKT, MAPK og JAK /STAT signalveier i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle eksperimenter utført ble godkjent av og utført etter retningslinjene fra Institutional biosikkerhet Committee of Texas Tech University Health Sciences Center.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
Menneskelige bukspyttkjertel ductal adenocarcinoma cellelinjer, PANC-1 (epithelioid karsinom), MIA PACA-2 (karsinom) og VVS (adenokarsinom) ble kjøpt fra American Type Culture Collection, og ble opprettholdt i RPMI-1640 medium supplert med 10 % FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% karbondioksyd.
transitt- siQUEST transfeksjon reagens ble kjøpt fra Mirus Bio (Madison, WI, USA). Den 6,5 mm Transwell med 8,0 um porestørrelse polykarbonat-membran-innskuddene ble oppnådd fra Corning Incorporated (Corning, NY, USA). BD Matrigel (Bedford, MA, USA) og BD Pharmingen Annexin V-FITC apoptose Detection Kit I (San Diego, California, USA) ble hentet fra BD Biosciences. BSA ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Corporation (St Louis, MO, USA). siRNA rettet mot IGF-1R ble kjøpt fra Origene (Rockville, MD, USA). MTS-reagens [3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium] ble oppnådd fra Promega (Madison, WI, USA). Pattedyr protein Ekstraksjonsreagens (mPER) ble kjøpt fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)
Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt i denne studien. Pakt (sc-101629), AKT (5298), Bcl- 2 (sc-783), perk, (sc-101760), ERK (sc-94) og STAT3 (H-190) (sc-7179) (Santa Cruz, CA, USA); IGF-1R (3027), Notch 2 (4530P), Snail (3879), E-cadherin (3195), N-cadherin (4061), Zeb (3396), vimentin (5741), Slug (9585), Bax (2772 ), Caspase3 (9661), PARP (9542), pPI3K P85 (4228), PI3K P85 (4292), IR-β (3024), Pirs-1 (2388), IRS-1 (2382), pSTAT3 (ser727) ( 4113), COX-2 (4842), pPTEN (9549), pmTOR (2974), mTOR (4517), p-p70s6kinase (9206) og p70s6kinase (9202) (Cell Signaling Technology, (Boston, MA), Caspase8 (ab 25901) (Abcam, Cambridge, MA, USA), β-aktin (Sigma Aldrich, (St.Louis, MO, USA).. Passende sekundære antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)
Pancreas adenocarcinoma tissue Array
Pancreas adenokarsinom vev microarray (TMA) ble hentet fra USA Biomaks, Inc, Rockville, MD The TMA inneholder formalinfiksert parafin innebygd prøver av bukspyttkjertelen adenokarsinom og normal pancreatic vev ble utsatt for immunhistokjemi (IHC) å bestemme IGF-1R uttrykket nivåer. Institutional Review Board godkjenning ble ikke nødvendig for å bruke TMA.
Immunohistochemistry (IHC)
IHC for IGF-1R antigen ble utført ved hjelp av bukspyttkjertelen adenocarcionma TMA. TMA ble først inkubert i en ovn ved 58 ° C i 2 timer for å forbedre vev adhesjon til de ladede glassplater. Deparaffinization ble deretter utført for å fjerne innebygde medium med xylen inkubasjon i 20 minutter. TMA ble gradvis rehydratisert i serie alkohol bad (100, 95, 70, 50 og 30%) etterfulgt av en vask destillert vann i 5 minutter. Heat indusert epitop henting med trilogien (Cell Marque, Rocklin, CA) ble deretter utført for å avdekke de antigene områder innenfor vev seksjoner. TMA ble blokkert i TBS inneholdende 1% føtalt kalveserum og 1% bovint serumalbumin i 15 min. Perox-fri blokkerende reagens (Cell Marque, Rocklin, CA) ble også tilsatt i 10 minutter for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding. TMA ble inkubert med IGF-1R antistoff (1:50 fortynning) over natten ved 4 ° C. Objektglassene ble deretter vasket tre ganger i PBS i 5 minutter og inkubert med Ultra Marque polyscan HRP Etikett (Cell Marque, Rocklin, CA) i 1 time ved romtemperatur. TMA ble deretter vasket tre ganger i PBS og farget med kromogen oppløsning (Cell Marque, Rocklin, CA) i 20 min. Kromogen farging Reaksjonen ble stoppet ved skylling med destillert vann. Cellekjerner kontra ble utført med hematoksylin inkubering i 40 sek. TMA ble skylt med destillert vann og dehydrert med serie etanol bad (30, 50, 70, 95 og 100%) etterfulgt av en xylen-bad. Endelig TMA ble coverslipped med monterings media (Surgipath Medical Industries, Richmond, IL) og digitale bilder ble tatt med et Nikon Microscope- ECLIPSE 50i.
stanse av IGF-1R i PANC-1 og VVS Cells
siRNA målretting IGF-1R ble transient transfektert inn i Panc-1 og VVS celler ved hjelp av Mirus bio Transit siQUEST transfeksjon reagens. Egge siRNA (ikke stanse sekvens) ble anvendt som en kontroll. I korthet ble cellene sådd ut i 6-brønns plater ved en densitet på 2,5 x 10
5-celler /brønn. -Celler ble transfektert med forskjellige konsentrasjoner og forskjellige undergrupper (A, B og C) av siRNA som strekker seg fra 10 til 50 nM i 48 timer eller 72 timer, ved hjelp av Mirus siQUEST Transfeksjon reagens. Forholdet mellom siRNA til Transfeksjon reagens ble opprettholdt som 1:0.5 for effektiv lyddemping uten toksisitet i henhold til produsentens protokoll. De endelige konsentrasjoner av siRNA ble valgt på grunnlag av dose-responsstudier. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble cellene anvendt for protein isolasjon eller clonogenicity, invasjon, migrering og studier. Apoptose ble undersøkt etter 48 og 72 timer etter lyddemping av IGF-1R.
cellenes levedyktighet Assay
PANC-1 og VVS-celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 0,3 x 10
4 celler /brønn og 0,5 x 10
4 celler /brønn, henholdsvis, og transfektert med IGF-1R ved en sluttkonsentrasjon på 30 nM av subtype «B» og 50 nM av subtype «A» i 48 timer sammen med egge kontroller. Etter 48 timer med transfeksjon, ble cellenes levedyktighet målt ved bruk av MTS-måling. Absorbansen ble avlest ved 490 nm for å beregne prosentlevedyktige celler.
Clonogenicity /kolonidannelse Assay i soft agar
kolonidannelse analyse ble utført for å måle in vitro overlevelse evne av en enkelt celle for å vokse til en koloni i en forankrings-uavhengig vekst miljø. I korthet, etter å transfektere PANC-1 og VVS-celler med IGF-1R siRNA eller kryptert kontroll i 48 timer, ble disse transfekterte celler sådd ut i komplett medium ved en tetthet på 2 x 10
4-celler i 60-mm skåler inneholdende en topp lag av 0,7% agar og et bunnlag på 1% agar. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 3 til 4 uker, og deretter beiset med 0,2% krystallfiolett. Kolonier av mer enn 20 celler ble talt manuelt.
Wound Healing analysen
Cell migrere evne IGF-1R forstummet kreft i bukspyttkjertelen celler ble målt ved bruk av scratch-analysen. I korthet ble cellene sådd ut i 6-brønns plater ved en densitet på 3,5 x 10
5-celler /brønn for IGF-1R transfeksjon. På dette tetthet, PANC-en og VVS cellene nådde mono konfluens etter 48 × h. En rett sår eller riper ble deretter forsiktig opprettet i cellemonolagene med en steril pipette tips. Cellene løsnet ved bunnen ble vasket to ganger med PBS og kulturene ble deretter supplert med friskt medium og overvåket i 96 timer ved 37 ° C ved hjelp av BioStation CT (Nikon Instruments Inc. Melville, NY, USA) for kontinuerlig observasjon. Den BioStation ble automatisk programmert til å ta bilder på 2 timers intervaller opp til 96 timer. Migrasjon bildene ble tatt og dokumentert ved ulike tidspunkt ved hjelp av NIS-Element AR programvare.
Migrasjon og invasjon analysen
Effekten av IGF-1R siRNA på invasive egenskaper av kreft i bukspyttkjertelen celler ble evaluert med Transwell migrasjon og invasjon analyser. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble PANC-1-celler og VVS-celler trypsinisert og resuspendert i FBS-fritt RPMI-1640 medium. For overføringen analysen, totalt 5 x 10
3-celler ble sådd ut i den øverste kammer i transwell med en noncoated polykarbonatmembran (innsats diameter 6,5 mm, 8,0 im porestørrelse; Corning Incorporated). For invasjonen analyse ble 2 x 10
4 celler sådd ut i den øverste kammer i transwell med en matrigel-belagt (1 mg /ml) polykarbonatmembran. RPMI-1640 medium med 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter inkubering i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO
2, ble celler på den nedre overflaten av membranen fiksert med 5% formalin og farget med 0,2% krystallfiolett. De ikke-migrerte celler på den øvre side av innlegget var tørket av med en bomullsdott. Bilder fra cellene som migrerte til undersiden av membranen ble tatt på en blindet måte på 5 forskjellige mikroskopiske felt med 20 x forstørrelse. Antallet migrerte eller invaderte celler ble regnet fra fem eller seks tilfeldig utvalgte felt i en blindet måte. Forsøkene ble gjort i tre paralleller for statistisk signifikans.
Analyse av celledød
Effekten av IGF-1R stanse på apoptose ble målt ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose Detection Kit I. Cellene ble høstet 48 timer og 72 timer etter transfeksjon og deretter farget med Annexin V-FITC og propidiumjodid i henhold til produsentens instruksjoner. Prosentandelen av celledød eller apoptose ble kvantifisert ved hjelp av et flowcytometer (FACS Accuri C6) [20].
Western blotting analyse
Panc-1 og VVS celler ble transfektert med IGF-1R siRNA i 48 timer. Etter inkuberingen, ble proteinet ekstrahert fra transfekterte celler ved å lysere cellemembran ved hjelp av pattedyrprotein Ekstraksjonsreagens (mPER) i henhold til produsentens protokoll. Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved bruk av BSA-standard metodikk. Like mengder protein ble lastet og separert ved SDS-polyakrylamidgeler, og overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert med 5% BSA i 1 X TBST i 1 time og probet med et panel av primære antistoffer mot pakt, AKT, Bcl-2, Perk, ERK, STAT3, IGF-1R, Notch 2, sneglen, E-cadherin , N-cadherin, Zeb, vimentin, Slug, Bax, Caspase3, PARP, pPI3K P85, PI3K P85, IR-β, Pirs-1, IRS-1, pSTAT3, COX-2, pPTEN, pmTOR, mTOR, pp70s6kinase, p70s6kinase , Caspase8 eller β-aktin. Etter vasking med TBS-T, ble membranen inkubert med sekundær pepperrotperoksidase-coupled antistoffer og deretter positive bånd ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence.
Statistical Analysis
Forskjellene mellom gruppene ble analysert ved uparet t-test. Den GraphPad Prism 5 programvarepakke versjon 5.03 ble brukt til å gjøre alle de statistiske beregninger. Sannsynlighets verdier og 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
IGF-1R er høyt uttrykt i bukspyttkjertel kreft
Vi undersøkte uttrykket nivåer av IGF-1R i. pancreatic ductal adenokarsinom cellelinjer (VVS, MIA PACA-2 og PANC-1) ved hjelp av western blot. Alle tre cellelinjer hadde et høyt nivå av ekspresjon av IGF-1R sammenlignet med normale bukspyttkjertelen. VVS hadde det høyeste uttrykk for IGF-1R blant de tre bukspyttkjertelen cellelinjene vi analysert mens PANC1 hadde minst uttrykk. Så vi valgte å bruke VVS og PANC1 celler for alle våre eksperimenter basert på deres IGF-1R uttrykk (figur 1A). Immunhistokjemisk analyse av IGF-1R i bukspyttkjertelen adenokarsinom vev microarray (TMA) ble gjort for å ytterligere bekrefte patofysiologisk rolle IGF-1R i PDAC patogenesen. PDAC tumorvev på ulike stadier viste økt uttrykk av IGF-1R sammenlignet med vanlig bukspyttkjertelen vev (Figur 1b).
(A) Expression nivåer av IGF-1R i PANC-en, VVS og MIA Paca-2 var sammenlignet med normale bukspyttkjertelen celler fra rotte ved hjelp av western blot. (B) Representant immunhistokjemisk analyse av IGF-1R av tumorstadium i bukspyttkjertelen adenokarsinom vev og normal bukspyttkjertelen vev. (C) PANC-1 og VVS-celler ble transfektert med tre forhåndsutformet IGF-1R sirnas (A, B og C) ved tre forskjellige konsentrasjoner (10, 30 og 50 nM) sammen med egge kontroll siRNA. Dempe effekt av IGF-1R siRNA ble bestemt ved anvendelse av western blot i PANC-1 og VVS-celler. (D) Virkning av IGF-1R siRNA på cellelevedyktighet PANC-1 og VVS. -Celler ble transfektert med 30 nM og 50 nM av IGF-1R siRNA i PANC-1 og VVS-celler respektivt. Celleviabilitet ble analysert ved 48 timer etter transfeksjon ved hjelp av MTS analysen kit. Resultatene representert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). (E) Hemming av IGF1R uttrykk blokker kolonidannende egenskapene til kreft i bukspyttkjertelen celler, PANC-1 og VVS. En myk agar assay ble brukt for å studere den kolonidannelse evnen til Panc-1 og VVS-celler. Førtiåtte timer etter siRNA transfeksjon ble PANC-1 og HPAC cellene tillatt å vokse i 0,7% agarose i RPMI-1640 supplert med 10% FBS i 16 og 22 dager, henholdsvis. Vist her er representative bilder av kolonidannelse fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (F) Prosent kolonier i begge PANC-1 og VVS-celler ble beregnet med egge kontroll (SCR) som tjener som grunnlinjen.
Dempe IGF-1R hjelp sirnas i bukspyttkjertelkreft cellelinjer
For å dempe IGF-1R uttrykk, vi brukte 3 forskjellige sirnas i konsentrasjoner som varierer fra 10 til 50 nM. Egge siRNA som er ikke rettet mot hvilket som helst gen ble anvendt som en kontroll. siRNA transfeksjonseffektivitet varieres basert på den undertype og konsentrasjon av siRNA for begge cellelinjer. Følgelig, IGF-1 R-ekspresjonsnivåer ble signifikant redusert ved en konsentrasjon av 30 «B» nM og 50 nM «A» for PANC-1 og HPAC kreftceller, respektivt (figur 1C). Derfor er disse to siRNA doser ble valgt for alle senere studier.
Dempe IGF-1R induserer Anti-proliferativ effekt på kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer
Siden IGF-1R er kjent for å stimulere cellevekst, vi undersøkt effekten av stanse IGF-1R på spredning av pankreas adenokarcinomceller. Dempe IGF-1R redusert levedyktighet kreft i bukspyttkjertelen celler i 48 timer etter transfeksjon sammenlignet med egge siRNA transfekterte kontrollceller. Kun 45,24% 47,28% levedyktige celler ble på IGF-1R inhibering i PANC1 og VVS-celler, respektivt (figur 1D). Den anti-proliferative effekt av målretting IGF-1R er meget signifikant i begge de svært aggressive bukspyttkjertelcancercellelinjer. Disse resultatene tyder på en avgjørende rolle for IGF-1R i spredning av aggressive kreft i bukspyttkjertelen celler.
Dempe IGF-1R hemmer Anchorage uavhengig Vekst av kreft i bukspyttkjertelen celler
Anchorage uavhengig vekstpotensial kreftceller er en av de viktige og kjente karakteristiske trekk ved transformerte celler. Soft agar forsøk i PANC-1 og VVS-celler ble utført for å vurdere hvorvidt IGF-1R knockdown påvirket kolonidannende potensial av disse cellene. Dempe IGF-1R dramatisk redusert kolonidannende kapasitet i begge bukspyttkjertelkreft cellelinjer (figur 1E). Resultater fra tre uavhengige eksperimenter ble kvantifisert, som avslører 85% hemming av kolonidannende evne i IGF-1R forstummet kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 1F)
IGF-1R lyddemping Trykt bukspyttkjertelkreft cellemigrasjon /motilitet
(i) sårheling assay.
Redusert kolonidannende evne er vanligvis forbundet med et tilsvarende tap av invaderende egenskapene til kreftceller [20]. Den klassiske sårheling Analysen ble utført for å teste rollen av IGF-1R ved regulering av den vandrende evnen til kreft i bukspyttkjertelen celler. Cellemonolagene ble skrapet for å skape et sår for å overvåke den migrerende evne til både kontroll og IGF-1R trykkes kreft i bukspyttkjertelen celler. IGF-1R trykt Panc-1 og VVS celler utstilt redusert trekkende evner sammenlignet med egge kontroller. HPAC kryptert kontrollceller reformert et fullstendig monolag i løpet av 48 timer og PANC-1 eggekontrollceller reformert et fullstendig monolag i løpet av 96 timer. I IGF-1R trykkes PANC-1 og VVS-celler, en fullstendig monolag ble ikke reformerte selv etter 96 timer (figur 2A, B B). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at stanse IGF-1R ikke bare reduserer migrasjon evne, men også de invasive egenskapene til bukspyttkjertelen duktale adenokarcinomceller.
(A) PANC-en og VVS celle invasjon ble vurdert i Transwell kamre belagte med matrigel. Celler som invaderte matrigel belagt innsats ble fiksert, farget og fanget ved 20 × forstørrelse. (B) Antall invaderte celler ble talt og uttrykt som prosent invasjon. Forsøkene ble gjort i triplikat (C) IGF-1R stanse inhiberer ekspresjon av flere epitelial-mesenchymale overgangs markører. Totalt proteinlysatene fra egge kontroll og IGF-1R forstummet PANC-en og VVS celler ble analysert for ekspresjon av Notch-2, sneglen, E-cadherin, N-cadherin, Zeb, vimentin, og Slug sammen med intern kontroll β-aktin. (D) Densitometic verdier av EMT markører er vist som% uttrykk. PS-PANC-en eggerøre, PI-PANC-en IGF-1R forstummet, HS-HPAC Egge, HI-HPAC IGF-1R forstummet.
Dempe IGF-1R Blocks Epitelial-mesenchymale Transition (EMT ) i kreft i bukspyttkjertelen celler
prosessen med kreft celle invasjon er aktivert som EMT som er initiativtaker til metastatisk cascade [21]. Celler som gjennomgår EMT vil oppnå stamcellelignende egenskaper som øker celledeling, metastase, etc. [22]. EMT-relaterte faktorer som Notch-2, sneglen, N-cadherin, Zeb, vimentin og Slug ble betydelig redusert på å kneble IGF-1R i Panc-1 og VVS-celler (Figur 3C D). Interessant, western blot analyse i IGF-1R trykt celler viste økt ekspresjon av E-cadherin; tap av celle-celle adhesjonsmolekyl er antatt å fremme invasjon og metastase [23]. Disse data viser tydelig at stanse IGF-1R i kreft i bukspyttkjertelen celler resulterer i hemming av proteiner som favoriserer bukspyttkjertelkreft EMT.
Dempe IGF-1R induserer apoptose
Regulering av apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler ble analysert på IGF-1R stanse ved hjelp Annexin V-FITC apoptose Detection Kit I. flowcytometrisk analyse viste en markert induksjon av apoptose /celledød av IGF-1R stanse i kreft i bukspyttkjertelen celler (45,4%, 55,4% i PANC-1 og 47,7%, 59,5% i VVS ble observert etter 48 timer og 72 timer av post transfeksjon, henholdsvis) (Figur 4A . B)
(A) IGF1R hemming induserer apoptose i PANC1 VVS celler. Etter transfeksjon ble cellene farget med Annexin V-FITC-og propidium jodid, etterfulgt av strømningscytometri. Prosentandelen av tidlig apoptotisk (nederst til høyre kvadrant), apoptotisk (øverst til høyre kvadrant), slutten av apoptotiske og nekrotiske celler (øverst til venstre kvadrant), og lever friske celler (nederst til venstre kvadrant) er vist. (B) Prosent apoptose og celledød er oppsummert i tre uavhengige eksperimenter i Panc-1 og VVS celler. (C) IGF-1R inhibering induserer død reseptor og mitokondriell mediert apoptose i PANC1 VVS celler. Bax, Bcl-2, kaspase 8, caspase 3 og spaltet PARP og β-aktin-ekspresjon ble analysert ved hjelp av Western blot i IGF-1R siRNA-transfektert PANC-1 og VVS-celler. (D) Representant densitometry analyse viser betydelig forsterkning av apoptose via indre og ytre trasé. PS-PANC-en eggerøre, PI-PANC-en IGF-1R forstummet, HS-HPAC Egge, HI-HPAC IGF-1R forstummet.
For å identifisere molekylære mekanismen involvert i denne induksjon av apoptose undersøkte vi uttrykket mønster av flere apoptotiske signalmolekyler i kreft i bukspyttkjertelen celler. Celler transfektert med IGF-1R siRNA hadde signifikant økt ekspresjon av Bax, caspase 8, Caspase3 og spaltet PARP sammenlignet med celler behandlet med egge siRNA (figur 4C E). virkningen av IGF-1R undertrykkelse på AKT /PI3K signalering ble undersøkt i kreft i bukspyttkjertelen celler. PANC-1 og VVS-celler ble behandlet med IGF-1R siRNA i 48 timer. Cellene ble høstet og uttrykk for fosfo-AKT, AKT, fosfor-PI3K, PI3K, fosfor-PTEN, fosfor-mTOR, mTOR, fosfor-p70s6kinase, p70s6kinase og intern kontroll β-aktin ble målt ved Western blotting. (B, D & F): Densitometrisk analyse er også vist til høyre for hver representativt bilde
AKT er en av de mest konstitutivt uttrykt molekyler i mange kreftformer, og har vist seg å forbedre ondartet. celle proliferasjon [24].
