Abstract
Småcellet lungekreft (SCLC) er en svært aggressiv lunge svulst med svært dårlige kliniske utfall og ingen godkjente målrettede behandlinger. For å belyse mekanismene som er ansvarlig for drift av SCLC fenotype i håp om å avsløre nye terapeutiske mål, studerte vi kopiantall og metylering profiler av SCLC. Vi fant forstyrrelse av E2F /Rb veien var et fremtredende trekk deregulert i 96% av SCLC prøver undersøkt og var sterkt assosiert med økt uttrykk av EZH2, et onkogen og kjernen medlem av polycomb undertrykkende komplekset 2 (PRC2). Gjennom sin katalytiske rolle i PRC2 komplekset, EZH2 fungerer normalt for å dempe epigenetiske gener under utviklingen, men det abnormt demper gener i humane kreftformer. Vi gir bevis for å støtte at EZH2 er funksjonelt aktiv i SCLC svulster, utøver pro-tumorer funksjoner
in vitro
, og er assosiert med avvikende metylering profiler av PRC2 målgener som tyder på en «stamme-celle som» hypermethylator profil i SCLC svulster. Videre lentiviral-mediert knockdown av EZH2 viser en signifikant reduksjon i veksten av SCLC cellelinjer, noe som tyder EZH2 har en nøkkelrolle i å drive SCLC biologi. I konklusjonen, våre data bekrefter rollen EZH2 som en kritisk onkogen i SCLC, og gir støtte til prioritering av EZH2 som en potensiell terapeutisk mål i klinisk sykdom
Citation. Coe BP, to KL, Aviel- Ronen S, Vucic EA, Gazdar AF, Lam S, et al. (2013) Genomisk Deregulering av E2F /Rb Pathway fører til aktivering av onkogen EZH2 i småcellet lungekreft. PLoS ONE åtte (8): e71670. doi: 10,1371 /journal.pone.0071670
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 14 januar 2013; Godkjent: 02.07.2013; Publisert: 15 august 2013
Copyright: © 2013 Coe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den kanadiske Institutes for Health Research (CIHR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) er en svært aggressiv lunge svulst med en ekstremt dårlig klinisk utfall, som har sett liten forbedring i løpet av de siste 25 årene [1]. På grunn av sin unike klinisk forløp, er SCLC ofte iscenesatt ved hjelp av en egen klinisk staging system fra standard TNM-systemet brukes til de fleste kreftformer, inkludert alle ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som enten begrenset (33%) eller omfattende (67% ) -trinnet sykdom basert på omfanget av tumorspredning. Pasienter med begrenset stadium sykdom har en median overlevelse på 18 måneder, mens det for pasienter med omfattende scenen er bare 9 måneder [2] – [4]. På grunn av sin svært aggressive natur, er kirurgi sjelden utført og kjemoterapi med eller uten samtidig strålebehandling er den vanlige behandlingen. Til tross for SCLC utgangspunktet presentere som en chemo-sensitive sykdom, nesten alle pasienter tilbakefall etter første behandling, og ingen målrettede behandlingsformer har blitt godkjent for SCLC oppdatert [5] – [9]. Derfor nye mål for terapeutisk intervensjon er sterkt behov for denne sykdommen.
Identifiseringen av onkogener som er selektivt aktivert og at funksjonelt driver tumor fenotyper, gjør ideelle terapeutiske mål for pasienter som hadde disse avvikene. I NSCLC, har oppdagelsen av slike hendelser har ført til utvikling og anvendelse av målrettede chemotherapies, oversette til bedre progresjon og total overlevelse for NSCLC for utvalgte pasienter [10]. Siste genomisk profilering mot dette målet i SCLC har avdekket tusenvis av mutasjoner og slettinger, som forekommer i flere tumor suppressor veier (f.eks.
TP53
,
RB1
,
PTEN
,
EPHA7
), og gener involvert i kromatin modifisering (f.eks.
CREBBP
,
MLL
), samt presiseringer i antatte SCLC kreft driver gener, for eksempel
SOX2 product: [5], [8]. Disse funnene er betydelig, og kan føre til utvikling og anvendelse av nye målrettet terapi for meget spesifikke undergrupper av SCLC pasienter, men klarlegging av en mer overalt aktivert mål i SCLC ville være enda mer fordelaktig.
DNA nivå inaktive av TSG
RB1
er nesten universell i SCLC. RB1 hemmer normalt spredning gjennom hemming av E2F transkripsjonsfaktorer. E2F familiemedlemmer er vanligvis overexpressed i ulike tumorer, inkludert SCLC [11] – [15]. Arbeid med oss og andre har identifisert DNA nivå gevinster av
E2F
familiemedlemmer i SCLC cellelinjer, svulster og murine modeller [5], [16]. EZH2, et kjerne-element av den polycomb undertrykkende komplekset 2 (PRC2), er et mål nedstrøms av RB1 /E2F-komplekset. EZH2 er avgjørende for epigenetisk vedlikehold av embryonale celle «stilk-somhet» og etablering av avstamning spesifisitet under normal utvikling.
EZH2
har nylig blitt etablert som en driver onkogen, der det er involvert i avvikende hypermethylation av tumorsuppressorgener (TSG) i flere krefttyper. Overekspresjon av EZH2 ble nylig beskrevet i SCLC, hvor det har blitt foreslått som en roman SCLC terapeutisk mål [11].
mekanismene bak EZH2 hyperaktivitet er blitt identifisert i andre kreftformer og inkluderer mutasjon av
EZH2
i seg selv noe som fører til overaktivering av dens histon modifiserende kapasiteter og DNA hypermethylator fenotyper som er assosiert med dårlig prognose, kjemo- motstand og spesielt aggressive kreft fenotyper. For å utforske mekanismer som driver EZH2 aktivering og for å bekrefte den onkogene rolle EZH2 i SCLC, studerte vi kopitall profiler av 14 SCLC tumorer og 14 SCLC-cellelinjer og vurderes cellelevedyktigheten etter EZH2 knockdown. Vi fant at DNA-nivå forstyrrelse av E2F /Rb sti komponenter, enten ved tap av
RB1
eller forsterkning av
E2F
, hos 100% av SCLC prøvene undersøkt, som fant vi sterkt assosiert med økt uttrykk av EZH2. Vi bekrefter en funksjonell onkogen rolle for EZH2 i SCLC, og en tilhørende og DNA hypermethylator profil for SCLC svulster. Vi foreslår at genomisk avbrudd av E2F /Rb fører til aktivering av histone metyltransferase EZH2 som fungerer som et onkogen i SCLC, ytterligere støtte sitt løfte som et terapeutisk mål for SCLC pasienter.
Metoder
Prøve Innkjøp og Array komparativ genomisk hybridisering
Et stort flertall av SCLC pasienter er ikke kirurgiske kandidater, og dermed bare arkivbiopsiprøver er tilgjengelige. Et panel av 14 formalinfiksert og parafininnebygd SCLC tumorprøver ble hentet fra arkivet ved University Health Network (uhn) Avdeling for patologi, med en studieprotokoll godkjent av uhn etikk Board, som ikke krever spesielle informert samtykke for materialer fra før 2000 og pasienter som var døde (tabell S1). Tissue Kjerner ble utvalgt fra regioner i tumorvev som viste tilstrekkelig renhet for en 2 mm kjerne. Etter histologisk evaluering, ble prøvene ekstrahert ved standard xylen basert deparaffinization og standard proteinase K basert DNA-ekstraksjon protokoll med tillegg av basehydrolyse (10 minutter 70 ° C inkubasjon med ½ volum 1 M NaOH, etterfulgt av nøytralisering med ½ volum 1M HCl) for å fjerne eventuelle forurensende RNA. Array CGH ble utført på en plattform mottagelig for FFPE materiale, og kopiere antall samtaler generert som tidligere beskrevet [16], [17].
Kvantifisering av E2F og EZH2 uttrykk nivåer
RT-PCR ble utført ved bruk av TaqMan genuttrykk analyser med standardprotokoller på en ABI 7500 Fast termo (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De TAQMAN analysene som ble brukt var E2F1 (Hs00153451_m1), E2F2 (Hs00231667_m1), E2F3 (Hs00605457_m1), Rb (Hs00153108_m1), EZH2 (Hs00172783_m1), og 18S RNA (HS99999901_s1). Absolutte uttrykk verdier ble beregnet for E2F1, E2F2, E2F3 og RB1 ved å skalere delta Ct-verdiene (gen-18s) til en verdi mellom 0 og 1000. Protein nivåer av EZH2 og E2Fs i cellelinjer ble vurdert ved anvendelse av standard Western blotting-metoder (Cell signale primære antistoffer: # 3147 (EZH2) og # 2118 (GAPDH), Santa Cruz primære antistoffer: sc-251 (E2F1), sc-632 (E2F2), og sc-878 (E2F3)) [18]. Band intensiteter ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare. Immunhistokjemi (IHC) ble utført ved bruk av standard teknikker med en primær anti-EZH2 antistoff (kanin polyklonale, 18-7395, Life Technologies, Grand Island, New York). Bilder ble scoret basert på intensiteten i farging observert på en skala fra 0 (lav) til 3 (høy).
DNA Metylering Analyse
Vi har fått DNA-metylering profiler for 12 SCLC svulster, og 21 kontroll bronkial liten luftveiene epitel (SAE) prøver ved hjelp av Illumina er infinium Menneskelig Metylering (HM27) assay. SAE ble oppnådd ved bronkial børste under rutine bronkoskopi fra små luftveiene (definert som mindre enn 2 mm i diameter) av individer uten tilstedeværelse eller tidligere historie med lungekreft eller kronisk obstruktiv lungesykdom [19]. DNA-prøvene var bisulfite omregnet til Zymo EZ DNA Metylering bisulfit konverteringssett (Zymo Research Corporation, Orange, CA) og HM27 profiler generert som tidligere beskrevet [20]. Infinium HM27 metylering sentrix array-filer (.sdf) and.idat bildefiler ble lastet inn i Illumina GenomeStudio. Rådata ble eksportert og lese inn R: A Språk og miljø for Statistisk Computing, og korrigert for rød grønn fargekanal partiskhet og batch effekt mellom flere metylering eksperimenter ved hjelp av Bioconductor pakken lumi, som gjelder en fargekorrigering og SSN normalisering algoritmen [21 ]. Prober med en Illumina arraydeteksjon p 0,05, presentere i 58% av tilfellene i hver gruppe ble beholdt. Prosent metylering for hver sonde er presentert som en p-verdier (max (yi, metyl, 0) /(max (yi, unmethy, 0) + max (yi, metyl, 0)) 100). En liste over EZH2 bundet mål i embryonale mus stamceller ble hentet fra en publikasjon av Ku
et
al [22]. Målene ble justert til ortologe menneskelige gener ved hjelp av musen Genome Database [23]. Å identifisere EZH2 målrettede gener som var ulikt denaturert mellom SCLC og normale grupper, ble en ikke para permutasjon tester ved hjelp av 10.000 permutasjoner utført som beskrevet av Chari
et al
. [24]. En M-verdi ble beregnet ved loggen
2 Forholdet mellom metylert sonde intensitet over unmethylated sonde intensitet, og brukes som innspill til permutasjon test [25]. Metylering permutasjon score ble korrigert for multippel testing med Benjamini og Hochberg (B-H) -metoden. Gjennomsnittlig betaverdier for SCLC svulster ble trukket fra gjennomsnittsbetaverdier fra normale luftveier kontroller for å innhente en delta β verdi. Hypermethylated og hypomethylated sonder i SCLC svulster ble definert som de med deltabetaverdier = 0,2 eller = – Henholdsvis 0,2,. Sonder som oppfylte følgende kriterier:
i
) permutasjon B-H korrigert p 0,05,
ii
) en deltabetaverdi = 0,2 eller = -0,2 Og
iii
) et standardavvik (SD) ≤2 innenfor hver gruppe, ble vurdert ulikt metylert (DM) mellom SCLC svulster og normal luftrom.
Sammenheng mellom EZH2 og E2F Expression nivåer
For å bestemme sammenhengen mellom
EZH2 Hotell og
E2F1
,
E2F2
,
E2F3
, og
RB1
mRNA uttrykk nivåer i SCLC prøver, spørres vi offentlig tilgjengelige uttrykk data fra Peifer et al. [5] og Broad Institute Sanger cellelinje prosjekt (broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi). GraphPad Prism 6 ble brukt til å beregne Spearman korrelasjonskoeffisienter mellom
EZH2 Hotell og E2F /Rb pathway gener.
knockdown av
EZH2 og E2F
i SCLC linjer og
E2F
Expression i HBEC Cells
293T, HTB-175 og H524 SCLC cellelinjer ble innhentet fra ATCC og dyrket i henhold til ATCC instruksjoner. Udødeliggjort menneskelige bronkial epitelceller (HBEC) ble dyrket i KSFM media supplert med storfe hypofysen ekstrakt og EGF. Lentiviral PLKO-puromycin resistente plasmider som koder shRNAs målretting
E2F1
,
E2F2
,
E2F3
, og
EZH2
ble kjøpt fra Open Biosystems (RHS3979-201768515 , RHS3979-201745380, RHS3979-201745384, og RHS4533-NM_004456). Lentiviruses ble samlet som tidligere beskrevet [26]. Mangfold av infeksjon (MOI) ble bestemt for både PLKO (tom vektor kontroll) og E1 (EZH2 målretting shRNA) virus ved hjelp av tilpassede TAQMAN primere (forover 5 «- GCGGTGTTCGCCGAGAT – 3» og reversere 5 «- GAGGCCTTCCATCTGTTGCT – 3»). Transfeksjon ble utført som beskrevet i Lockwood et al [26]. I korthet, for hver linje og virus 150.000 celler ble infisert (ved hjelp av en MOI på 15 for EZH2 virus) i media supplert med 2 ug /ml polybrene. Dyrkningsmediet ble supplert med 1 ug /ml puromycin for å selektere for infiserte celler. For å vurdere levedyktigheten til
EZH2
knockdown i forhold til kontrollene celler MTT-analyser ble utført som tidligere beskrevet [26].
E2F1 plakater (EX-Z8212-M46),
E2F2 plakater (EX-F0378-M46),
E2F3 plakater (EX-T0731-M46), og luciferase kontroll (EX -hLUC-M46) ORF uttrykk kloner ble kjøpt fra GeneCopoeia. Forbigående uttrykk eksperimenter ble utført ved hjelp av Lipofectamine LTX følge produsentens instruksjoner. Effektivitet av E2F knockdown og overekspresjon, og deres virkninger på EZH2 uttrykk nivåer ble bestemt ved Western blotting.
Resultater og Diskusjon
Genomisk Profilering av SCLC Svulster og sammenligning med SCLC cellelinjer
Detaljer om DNA kopiantall profiler av disse svulstene sammen med 14 ubeslektede SCLC cellelinjer er vist i figur S1, og data er tilgjengelige i Gene Expression Omnibus. Påfallende, observerte vi gjentakelse av DNA kopiantall endringer i SCLC svulster, inkludert områder som omfatter topp pathway kandidater fra vår forrige cellelinje studie som
TCF4 plakater (18q21),
STMN1 plakater (18q21) og
E2F2 plakater (1p36) [16].
Den E2F /Rb Pathway er spesielt deregulert i SCLC
Basert på tidligere observasjoner av oss og andre, vi en hypotese om at cellesyklus aktivering i SCLC kan forekomme så langt nedstrøms som transkripsjonsfaktorer som regulerer cellesyklusprogresjon. Retinoblastom veien har lenge vært etablert som et sentralt mål for deregulering i SCLC.
RB1
ofte tapt eller mutert (60-90%) i SCLC og viser redusert ekspresjon i de fleste av tilfellene [5], [8], [11] – [13], [27]. En primær funksjon av Rb er dens normale hemming av E2F-transkripsjonsfaktorer. Når RB1 blir inaktivert ved fosforylering, E2F-proteiner er fri til å virke som transkripsjonsfaktorer aktive en samling av cellesyklusprogresjon faktorer. Den E2F familie av gener er delt inn i aktivering (E2F1, E2F2, E2F3) og hemmende (E2F4, E2F5) medlemmer som fysisk samhandle med RB1 [15], [27] -. [31]
Nyere bevis har demonstrert E2F gener kan også være primære mål for deregulering. Andre studier har påvist høye ekspresjonsnivåer av E2F1 og E2F3 i forskjellige tumorer, inkludert SCLC [11] – [15]. I tillegg Peifer et al bemerket høyt nivå DNA forsterkning av
E2F2
i musemodeller av SCLC [5]. Tatt sammen med våre egne observasjoner av
E2F2
kopiere nummer gevinst og over uttrykk spesielt i SCLC cellelinjer og validering av
E2F2
kopiere tall endringer i SCLC svulster, bestemte vi oss for å analysere denne veien i sammenheng med kopiantallet og transkripsjons-deregulering.
E2F /Rb fokusert analyse av kopiantall i SCLC-cellelinjer (n = 14) og tumorer (n = 14) viste økning på minst en av de aktiverende
E2F
s eller tap av
RB1
i tumorprøver 14/14 og 13/14 cellelinjer (96% av alle prøver; 95% CI 80% til 100%) (figur 1A). Dette er konkordant med genomisk profiler nylig publisert av Peifer et al [5], som vi fant til å stille det samme mønster av endring i 56/63 tumorprøver (gjelder eksemplar nummer terskler av 1,7 for genomisk tap og 2.3 for genomisk gevinst til de segmenterte data identifisert hendelser i 84% av prøvene, 95% KI 72% til 92%). Selv om tilliten bundet inkluderer ikke 100% i Peifer et al studie, er det verdt å merke seg at i de 29 tilfellene med sekvensdata, 100% av tilfellene hadde enten
RB1
sletting eller en avkorting mutasjon aktivitet [5 ]. Dette i kombinasjon med tidligere estimater av
RB1
mutasjon priser i SCLC (60% til 90%) [32], [33] antyder at E2F /RB1 avbrudd er nær universell i SCLC tilfeller.
(A) Kopier nummer endringer av spesifikke E2F /Rb pathway medlemmer i SCLC cellelinjer (øverst) og svulster (nederst). Grønn skyggelegging representerer tap, mens rød representerer gevinst og svart representerer ingen endring. (B) Uttrykk for E2F /Rb pathway medlemmer av RT-PCR. Data er presentert som box-plott av absolutte uttrykk nivåer avledet fra målestokk normalisert PCR data. Midtlinjen i hver boks representerer medianverdien mens boksen representerer interkvartilt område, med whiskers som strekker seg til den siste ikke-avvikende datapunkt (definert som 1,5 x den interkvartilt område). Slengere er representert som kors. (C) Betydelig overekspresjon av EZH2 ble observert i SCLC forhold til NSCLC-prøver, som faller sammen med overskytende aktivering av E2F /Rb pathway. (D) IHC ble utført ved anvendelse av standardteknikker med et primært anti-EZH2-antistoff og bilder ble tatt ved 200 x forstørrelse. Vist er typiske eksempler på EZH2 protein uttrykk i bronkialepitelet, karsinoider og SCLC svulster.
Real-time PCR-analyse av transkripsjonsnivåer viste en påfallende mønster av E2F aktivering, som minst to aktive E2F medlemmene var spissen uttrykt ved 10 x deres normale nivåer i alle SCLC-cellelinje, mens RB1 mRNA var sterkt redusert i de fleste SCLC-cellelinjer (figur 1B og tabell S2). Disse nivåene av deregulering er betydelig større enn de som ble observert for et panel av NSCLC cellelinjer basert på en en tailed Mann-Whitney U test, støtter SCLC egenart disse hendelsene (SCLC vs NSCLC:
E2F1
p = 0,0034,
E2F2
p = 2,310 × 10
-5,
E2F3
p = 1,744 × 10
-5,
Rb1
p = 0,0078, figur S2). Deregulering av E2F og RB1 transkripsjoner er gratis til de siste resultatene fra Byers et al som oppdaget SCLC bestemt protein nivå deregulering av Rb og E2F1 i en proteomikk profilering studie av SCLC, NSCLC og normal lungecellelinjer [11].
Kollektivt, viser det seg at Rb-reaksjonsveien er deregulert ikke bare gjennom tap av Rb kopier /funksjon, men også gjennom genomiske gevinster av E2F-transkripsjonsfaktorer i SCLC. Samlet tyder dette på at E2F /Rb pathway er aktivert i alle SCLC prøvene i denne studien, enten ved tap av
RB1
eller kopiere gevinst på en
E2F
medlem genet. Basert på vår analyse av eksterne data, dette gjelder i ytterligere kliniske SCLC tumor kohorter [5].
Overuttrykte av E2F /Rb Target EZH2
Den slående mønster av E2F /Rb deregulering i SCLC cellelinjer og svulster bedt oss om å undersøke gener nedstrøms av E2F transkripsjonsfaktorer. Ett mål av E2F /Rb sti som nylig har blitt beskrevet som et onkogen i flere krefttyper er
EZH2
. EZH2 er en polycomb gruppe (PCG) genet med en rolle i fosterutviklingen og differensiering gjennom epigenetisk transcriptional regulering av gener som er kritiske for å opprettholde stilk-lignende egenskaper av embryonale celler og etablere avstamning spesifisitet [34] – [36]. Den styrer direkte DNA metylering av flere målgener inkludert
WNT1
, bekreftende tidligere studier hvor flere genetiske treff ble observert å stenge WNT sti i SCLC cellelinjer [16], [36]. EZH2 overekspresjon har blitt observert i mange kreftundertyper inkludert: prostata, bryst, blære, squamous celle lungekreft og hepatocellulært karsinom [37] – [44]. I tilfelle av squamous celle lungekreft, har EZH2 ekspresjon observert i dysplastiske squamous celler og tumorer, men ikke i normale bronkiale epitelceller, noe som tyder på
EZH2
aktiveres, kan det også være en tidlig begivenhet i NSCLC [39]. I tillegg har studier av flere krefttyper knyttet uttrykk for EZH2 til aggressivitet, invasjon og cisplatin motstand impliserer en rolle for EZH2 i aggressiv svulst oppførsel [43], [45] – [47]
I vår studie. ekspresjon analyse av EZH2 i NSCLC og SCLC-cellelinjer avdekket en slående tilstand av hyperactivation i SCLC forhold til NSCLC-celler (Mann-Whitney U-test, p = 4,52 x 10
-6, figur 1C). Våre resultater tyder på at EZH2 er i gjennomsnitt 42 ganger overexpressed i SCLC linjer i forhold til 13-fold overexpressed hos NSCLC cellelinjer. For å bekrefte om overekspresjon av EZH2 er også til stede i tumorer, analyserte vi data fra en uavhengig cDNA uttrykk matrise studie [13], som profilert et separat sett av 11 cellelinjer og et panel av 15 primær SCLC tumorer, i tillegg til å 12 adenokarsinomer (NSCLC subtype). Selv om den eksakte ganger endring nivåene var ikke direkte tilsvarende (potensielt grunn av forskjeller mellom RT-PCR og cDNA microarray dynamisk område), er trenden i uttrykk nivåer slående lik vår studie, med signifikant høyere uttrykk av EZH2 i SCLC cellelinjer og svulster sammenlignet med NSCLC prøver (Figur S2). Dette er i tråd med resultatene av Byers et al, som nylig observert økt EZH2 protein uttrykk i SCLC cellelinjer [11].
For å bekrefte at mRNA nivåer sette til økt proteinnivå i kliniske svulster, utførte vi IHC på et vev matrise av SCLC tumorer, karsinoid og normalt lungevev, og observert økt farging av EZH2 i SCLC tumorprøver (n = 13), sammenlignet med karsinoider, og bronkiale epitel (figur 1D, Tabell S3). Bracken et al [38] foreslått at både direkte
E2F
DNA forsterkning og
RB1
avbrudd kan føre til deregulering av EZH2 uttrykk. Den betydelige EZH2 over-uttrykk vi har beskrevet i SCLC er sannsynligvis ikke på grunn av det lave nivået kopi nummer gevinster vi observerer i SCLC cellelinjer og svulster, som tidligere studier har antydet at i gjennomsnitt to ganger kopiantall gain er assosiert med en gjennomsnittlig 1,5 ganger endring i forbundet mRNA nivåer [38], [48], noe som tyder på at over-uttrykk for EZH2 i SCLC, er først og fremst styrt av E2F /Rb avbrudd, snarere enn direkte kopi nummer endringer.
til videre vurdere vår hypotese om at E2F /Rb avbrudd fører til EZH2 aktivering, evaluert vi assosiasjoner mellom EZH2 og E2F /RB1 mRNA uttrykk nivåer i to offentlige SCLC datasett. I en microarray datasett av 56 SCLC linjer, har vi funnet positive sammenhenger mellom EZH2 og E2F1 (r
2 = 0,3957, p = 0,0013) og E2F2 (r
2 = 0,3124, p = 0,0095), og ingen signifikante korrelasjoner mellom EZH2 og E2F3 (r
2 = 0,1689, p = 0,1067) eller RB1 (r
2 = 0,0712, p = 0,6989) (tabell S4). I 15 SCLC svulster med RNA-sekvensering av data, observerte vi sterke positive korrelasjoner mellom EZH2 og E2F1 (r
2 = 0,5179, p = 0,0253) og E2F2 (r
2 = 0,6357, p = 0,0064), og ingen signifikante sammenhenger mellom EZH2 og E2F3 (r
2 = -0,1571, p = 0,7166) og RB1 (r
2 = -0,1929, p = 0,2450) (tabell S4). Det faktum at RB1 ikke ble signifikant korrelert med E2F-ekspresjon i disse datasettene skyldes sannsynligvis den lave totale ekspresjon av RB1 på tvers av disse prøvene, og rollen til fosforylering i RB1 funksjon, som ikke er redegjort for i disse dataene. Disse resultatene gir ytterligere bevis på at aktivering av E2F1 og E2F2 er forbundet med aktivering av EZH2.
Effekt av E2F Manipulation på EZH2 Expression
neste utført E2F knockdown eksperimenter for å direkte vurdere konsekvensene av E2F modulasjon på EZH2 uttrykk nivåer i SCLC. ShRNA-mediert knockdowns av E2F1, E2F2, og E2F3 viste reduksjoner i EZH2 protein nivåer, som passer med vår hypotese om at E2Fs modulere EZH2 uttrykk i SCLC (figur S3A). I tillegg har vi utført overekspresjon eksperimenter i immortaliserte humane bronkiale epitelceller (HBEC) [49], som er en ikke-ondartet modell for å studere molekylære patogenesen av ikke-småcellet lungekreft, siden til nå, er det ingen non-malign nevroendokrine modell for tiden tilgjengelig for å vurdere trans potensialet av gener i en SCLC bestemt forløper celletype. Vi observerte økt uttrykk for EZH2 ved induksjon av E2F2 (figur S3b). Virkningene av E2F knockdown og overekspresjon på EZH2 nivåer tatt sammen med de positive korrelasjoner vi observert mellom E2F og EZH2 mRNA-ekspresjonsnivåene antyder at aktivering av E2Fs fører til en tilsvarende økning i EZH2 nivåer. Disse observasjonene støtter vår hypotese om at økt uttrykk av E2F medlemmer fører til EZH2 aktivering i SCLC.
PRC2 Målene er Hypermethylated i SCLC
GF har vært av stor interesse for mange krefttyper de siste årene på grunn av sin rolle i transkripsjonelt tie ekspresjon av tumorsuppressorgener via kromatin remodellering og dirigere DNA-metylering. PCG proteiner danner multi-proteinkomplekser som undertrykke transkripsjon via post-translasjonell modifikasjon av histoner, spesielt tri-metylering av den 27. lysin på histon 3 (H3K27Me3). En høy andel (50-80%) av gener som er avvikende epigenetiske brakt til taushet av DNA promoter hypermethylation i de fleste humane kreftformer er de preget av Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) under embryogenese, hvor undertrykkende histone merkene fungere for å «slå av» celle skjebnen bestemme gener, skjenke udifferensierte selvfornyelse kapasitet til embryonale stamceller [50] – [53]. Gitt at EZH2 er den kritiske katalytiske medlem av PRC2 komplekse, og evnen til dette komplekset å rekruttere de
de novo
DNA metylering enzymer (DNMT3a /b), var vi interessert i å vurdere om CpG promoter metylering i SCLC svulster skjedde gjenom gener preget av PRC2 i embryonale stamceller. Derfor har vi analysert metylering status for EZH2-PRC2 målgener i våre primærtumorprøver [22]. Data er tilgjengelig i Gene Expression Omnibus.
Vi fant en overveldende andel av gener målrettet av EZH2 og PRC2 komplisert til å kunne hypermethylated i SCLC svulster i forhold til normal luftveiene epitel fra friske individer (figur 2). Etter bruk strenge kriterier filtrering, identifiserte vi 2756 hypermethylated sonder (p-verdi 0,05, delta β = 0,2), og 1372 hypomethylated sonder (p-verdi 0,05, delta β = -0,2) i SCLC forhold til sunn airway epithelial celler. Av de 3497 prober assosiert med gener som er kjent for å være embryoniske stamcelle EZH2 målene [22], fant vi 18% (640 prober) av disse genene som skal hypermethylated, sammenlignet med bare 3% (93 prober) hypomethylated i SCLC. Påfallende, EZH2-PRC2 målgener stod for 23% av alle hypermethylated sonder i disse svulstene ordnede. Sammenlignet med ikke-PRC2 mål, berikelse av PRC2 målgener i vår hypermethylated probe sett var statistisk signifikant (Fishers eksakte test, p = 2,2 × 10
-16). Disse data antyder at, analogt til å arbeide fra flere andre grupper i en rekke kreftformer [50] – [55], SCLCs viser en promoter hypermethylation profil sterkt overensstemmende med det mønster av gener dempede i embryonale stamceller ved PRC2 komplekset. Vi foreslår at det i SCLC, EZH2 overekspresjon forårsaket av DNA-nivå E2F /Rb sti avbrudd resultater i rekrutteringen av
de novo
DNA metylering enzymer og etablering av en «stamme-celle som» hypermethylator profil.
metylering p-verdier for 1683-gener målrettet for PRC2 H3KMe3 i mus embryonale stamceller er plottet for hver gruppe. Disse 1683 genene er kartlagt til 3497 Illumina HM27 sonder, hvorav 18% (640 prober) er hypermethylated og 3% (93 prober) er hypomethylated i SCLC svulster i forhold til normale luftveiene. Gener målrettet for H3KMe3 i mus embryonale stamceller ved EZH2 og PRC2 komplekset er fortrinnsvis hypermethylated SCLC svulster som gir bevis for at EZH2 er funksjonelt aktiv i SCLCs.
EZH2 er nødvendig for rask vekst i SCLC cellelinjer
Vi har evaluert ved siden av onkogene potensialet EZH2 i SCLC, ved hjelp lentiviral mediert knockdowns i to SCLC cellelinjer (H524, HTB175). Begge knockdown linjer vist en slående reduksjon i veksten sammenlignet med tomme vektor kontroller (t-test, p 0,05) (figur 3). Bekreftende våre funn, en fersk studie som involverer proteomikk profilering av SCLC cellelinjer viste overekspresjon av EZH2 i SCLC og demonstrert redusert vekst i H69 celler ved forbigående siRNA knockdown [11]. Den pro-proliferativ og anti-differensierings funksjoner av EZH2 er i overensstemmelse med den svært aggressive og udifferensiert klinisk og patologisk presentasjon av SCLC. Den sterke pro-proliferativ karakter av EZH2, kan også delvis forklare den toleranse av SCLC celler til slike høye nivåer av E2F mRNA, som noen E2F-proteiner er i stand til anti-proliferative og pro-apoptotiske funksjoner når den overuttrykkes [15], [28] -. [30], [38]
(A, E) for å bekrefte knockdown av EZH2, RNA ble ekstrahert fra transfekterte linjer og qPCR ble utført. Ekspresjon i knockdown linjer (E1) er vist i forhold til PLKO kontroller. (B, F) Bekreftelse på proteinnivå EZH2 i knockdown linjene ble utført ved bruk av standard Western blotting metoder. Både qPCR og Western blotting bekreftet EZH2 ble redusert med over 50% i HTB-175 og H524 celler på shRNA-mediert knockdown. (C, D, G, H) For å vurdere levedyktigheten til
EZH2
knockdown i forhold til kontroller celler vi utført MTT analyser. Knockdown av EZH2 forårsaket en signifikant og reproduserbar reduksjon i celle levedyktighet i begge SCLC cellelinjer (t-test, p 0,05).
Konklusjoner
Fra dette arbeidet, foreslår at E2F /Rb veien blir forstyrret, ikke bare gjennom tap eller mutasjon av Rb men også gjennom DNA-kopi nummer gevinster av E2F transkripsjonsfaktorer. Vi foreslår at denne mekanismen driver den spesifikke overekspresjon av flere målgener inkludert EZH2, noe som resulterer i aktivering av PRC2 komplekse og fremming av avvikende metylering i SCLC. Våre funn underbygge tidligere studier og har sterke implikasjoner for behandling av SCLC.
Flere mitogen veier, for eksempel MAPK deregulering er også i stand til å kjøre E2F funksjon i fravær av spesifikke oppstrøms treff i SCLC, som hyppig
