Abstract
Bakgrunn
Overuttrykte ERG transkripsjonsfaktor på grunn av genomisk
ERG
-rearrangements definerer en egen molekylær subtype av prostatakreft. En av konsekvensene av ERG opphopning er modulering av cellens genuttrykk profil. Tudor domene som inneholder protein 1 genet (
TDRD1
) ble rapportert å være forskjellig uttrykt mellom
TMPRSS2: ERG
-negativ og
TMPRSS2: ERG
-positivt prostatakreft. Målet med vår studie var å gi en mekanistisk forklaring på transkripsjonen aktivering av
TDRD1
i ERG omorganisering-positive prostatakreft.
Metodikk /hovedfunnene
genuttrykk målinger av sanntids kvantitativ PCR viste en bemerkelsesverdig co-uttrykk for
TDRD1 Hotell og
ERG plakater (r
2 = 0,77), men ikke
ETV1 plakater (r
2 0,01) i menneskelig prostata kreft
in vivo
. DNA metylering analyse av MeDIP-Seq og bisulfite sekvensering viste at
TDRD1
uttrykk er omvendt korrelert med DNA metylering på
TDRD1
arrangøren
in vitro Hotell og
in vivo product: (ρ = -0,57). Følgelig demetylering av
TDRD1
promoter i
TMPRSS2: ERG
-negative prostatakreftceller ved DNA metyltransferase hemmere resulterte i
TDRD1
induksjon. Ved manipulering av
ERG
dosering gjennom genet taushet tvunget uttrykk vi vise at ERG styrer tap av DNA metylering på
TDRD1
promoter-forbundet CpG island, som fører til
TDRD1
overekspresjon.
Konklusjon /Betydning
Vi viser at ERG er i stand til å forstyrre en vev-spesifikk DNA metylering mønster på
TDRD1
promoter. Som et resultat,
TDRD1
blir transcriptionally aktivert i
TMPRSS2: ERG
-positivt prostatakreft. Gitt forekomsten av ERG fusjoner,
TDRD1
overekspresjon er et vanlig endring i menneskelig prostata kreft som kan utnyttes for diagnostiske eller terapeutiske prosedyrer
Citation. Kacprzyk LA, Laible M, Andrasiuk T, Brase JC, Borno ST, Fälth M, et al. (2013)
ERG
induserer epigenetisk Aktivering av Tudor Domain-inneholder protein 1 (
TDRD1
) i
ERG
Omorganisering-positiv Prostate Cancer. PLoS ONE 8 (3): e59976. doi: 10,1371 /journal.pone.0059976
Redaktør: Bandana Chatterjee, University of Texas Health Science Center, USA
mottatt: 04.09.2012; Godkjent: 19 februar 2013; Publisert: 29 mars 2013
Copyright: © 2013 Kacprzyk et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av det tyske føderale Kunnskapsdepartementet (https://www.bmbf.de/en/) i rammen av Program for medisinsk genomforskning (NGFNplus; IG-Prostate Cancer, 01GS0890 og 01GS0891, IG-Mutanom , 01GS08107, Intestinal Modifier, 01GS08111) samt Helmholtz International Graduate School for kreftforskning av DKFZ ((www.dkfz.de/phd/)). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
om lag halvparten av menneskelige prostata kreft tilfeller identifisert av PSA-screening havne genomiske rearrangements der androgen-responsive regulatoriske elementer er sidestilt til gener som koder for transkripsjonsfaktorer i ETS familien [1] – [3]. Som et resultat, ETS gener blir koplet til androgenreseptoren (AR) signalering og er overuttrykt i fusjons-positive prostatakreft [4] – [6]. Den mest utbredte av disse genomiske rearrangementer,
TMPRSS2 product::
ERG
genfusjon, fører til en sterk overekspresjon av ERG transkripsjonsfaktor som ellers er fraværende i celler av prostata epitelet [7] ; under fysiologiske betingelser
ERG
viser en vev-ekspresjon begrenset mønster og blir transkribert i det hematopoetiske linage [8] og endoteliale celler [9]. Spørsmålet om hvordan ERG opphopning påvirker biologien til prostata kreft celler
in vitro Hotell og
in vivo
har fått en betydelig interesse. Inntil nå ble ERG foreslått å modulere fenotypen av prostata kreftceller ved en lang rekke fremgangsmåter, inkludert: avbrudd av AR-signalering [10], aktivering av c-myc signalering [11] og østrogen reseptor nettverk [12], aktivering av Wnt sti og induksjon av epitelial til mesenchymale overgang [13], fremme celle invasjon [14], fysisk interaksjon med PARP1 [15] og aktivering av TGF-β /BMP signaliserer [16]. Svulster skjuler ERG fusjon ble også funnet å bli beriket for tap av
PTEN
tumor suppressor [17], [18]. Følgelig, i musemodeller av prostatakreft ERG ble vist å samarbeide med PI3K vei å kjøre kreftutvikling [19], [20]. Akkumulering av ERG ble også funnet å være forbundet med en endret DNA-metylering mønster i prostatakreftceller [10], [21], [22]. Analyse av prostatakreft transkriptomet utføres av oss og andre viste at svulster huse
TMPRSS2
:
ERG
fusjon aksje en unik genekspresjon profil som i betydelig grad avviker fra profiler av godartet prostatavevet og ondartede svulster mangler fusjons [1], [10], [12], [13], [16], [23]. Spesielt er tumorer som overuttrykker ERG karakterisert ved transcriptional modulering av gener som er involvert i de Wnt og TGF-β /BMP-trasé [16], β-østradiol nettverk [12], [23] og NF-kB veien [24].
Blant gener deregulerte i
ERG
-rearranged prostatakreft, minst to uavhengige studier identifisert Tudor domene som inneholder protein 1 (
TDRD1)
som den mest forskjellig uttrykt gen mellom
ERG
omorganisering-positive og -negative prostatakreft, bortsett fra
ERG
seg selv [16], [23]. I likhet med
ERG
,
TDRD1
ikke transkribert i normal prostata epitel [25], [26].
TDRD1
ble opprinnelig identifisert som en kreft /testikkel antigen, dvs. et gen som uttrykkes i testiklene og kreft, men taus hos voksne somatiske vev [26]. Dens mus ortolog,
Tdrd1
, er uttrykt i spermatogenesis hvor det fungerer i konservert Pirna vei å undertrykke aktiviteten til line1 retrotransposons ved metylering [27]. En fersk studie i sebrafisk antydet at Tdrd1 fungerer som en molekylær stillas for Piwi proteiner, piRNAs og Pirna mål [28]. I både mus og sebrafisk, er Tdrd1 nødvendig for en korrekt funksjon av Pirna sti og
Tdrd1
knockout i mus resulterer i en defekt spermatogenesis [28], [29].
Her har vi rapport som
ERG Hotell og
TDRD1
er co-uttrykt i humane prostata kreft og vi gir en mekanistisk forklaring på den observerte co-uttrykk. Vi viser at ERG aktiverer
TDRD1
transkripsjon ved å fremkalle tap av DNA metylering på
TDRD1
promoter-forbundet CpG island. Vi foreslår at dette epigenetisk følge av
TMPRSS2:. ERG
fusjon representerer en ny mekanisme som kan forklare en del av transkripsjonsmodule indusert av ERG i menneskelig prostatakreft
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Prostata vevsprøver ble oppnådd ved University Medical Center Hamburg Eppendorf. Godkjenning for studien ble hentet fra den lokale etikkutvalget og alle pasientene ble enige om å ytterligere vev prøvetaking til vitenskapelige formål.
Prostata vevsprøver, Genome-wide Expression Profilering og Metylering analyse
Detaljer om menneskelig prøvene samling, utvinning av RNA, konvertering til cDNA og genom-wide uttrykk profilering er beskrevet andre steder [16]. DNA-ekstraksjon og genome-wide metylering analyse av MeDIP-Seq er beskrevet andre steder [22]. Dataene fra genom-wide uttrykk profilering og genome-wide metylering analyse er offentlig tilgjengelig i Gene Expression Omnibus database (deponeringsnummer GSE29079 og GSE35342).
TMPRSS2: ERG
fusjon status ble bestemt ved PCR ved bruk tidligere beskrevne primere [30] og ved qPCR [16]. Prøvene, som både mRNA uttrykk og DNA metylering data var tilgjengelig, ble inkludert i analysen.
Cell Culture
Vcap, NCI-H660, LNCaP, DU145, PC-3, og RWPE -1-celler ble erholdt fra ATCC (Manassas, VA, USA). BPH-1 celler var en slags gave av Doris Mayer (DKFZ, Heidelberg). K-562 og KG-1 celler ble gitt av Christoph Plass og Peter Krammer, henholdsvis (DKFZ, Heidelberg). MOLT4 og CMK-celler ble oppnådd fra DSMZ (Braunschweig, Tyskland). Vcap celler ble opprettholdt i DMEM medium (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% FBS (Gibco). NCI-H660-celler ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco) supplementert med 5% FBS (Gibco), 2 mM L-gluatmine, 0,005 mg /ml insulin, 0,01 mg /ml transferrin, 30 nM natriumselenitt, 10 nM hydrokortison og 10 nM beta-østradiol (alle fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). LNCaP og DU145 ble opprettholdt i RPMI-1640 (Gibco) supplementert med 10% FBS. PC-3-celler ble dyrket i F12-K-medium (ATCC) supplert med 10% FBS. RWPE1 celler ble dyrket i keratinocytt serumfritt medium supplert med 0,05 mg /ml bovint pituary ekstrakt og 5 ng /ml rekombinant EGF (Gibco). BPH1 celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Gibco) supplementert med 10% FBS og 20 ng /ml 5α-dihydrotestosteron (Sigma). K-562 og MOLT-4-celler ble dyrket i RPMI-1640 og supplert med 10% varme-inaktivert FBS, KG-1 og CMK-celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 20% varme-inaktivert FBS.
Generering av Stabile LNCaP Clones og Induksjon av transgene uttrykk
ERG-kodesekvensen (eksoner 4-11 fra NM_004449.3), noe som tilsvarer TMPRSS2: ERG fusion T1 /E4 [31], ble forsterket fra NM_004449. 3-holdig plasmid (Genomics og proteomikk Kjerne Facility, DKFZ) ved PCR ved bruk primere: forover GCAGGCTCCACCATGACCGCGTCCTCCTCCAG, revers CAAGAAAGCTGGGTCTTAGTAGTAAGTGCCCAGAT. Stabilt transfekterte LNCaP-kloner ble samlet som tidligere beskrevet [32]. Transgene uttrykk ble indusert med 50 ng /ml doksycyklin (Sigma).
RNA Utvinning og revers transkripsjon
Total RNA ble isolert fra eksponentielt voksende cellelinjer ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden ) etter produsentens anvisninger. cDNA syntese ble performend bruker Super III revers transkriptase (Life Technologies) og oligo-dT primere (Sigma-Aldrich) etter produsentens instruksjoner. For måling av LINE1-ORF2 mRNA, ble total RNA behandlet med Turbo DNase (Life Technologies) for å fjerne kontaminerende genomisk DNA. DNase-behandlet RNA ble deretter renset ved hjelp RNeasy MinElute Opprydding Kit (Qiagen) og utsatt for revers transkripsjon ved hjelp RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, Canada) og tilfeldige heksamerprimere.
Kvantitativ RT PCR
genuttrykk ble målt på LightCycler 480 real-Time PCR System (Roche, Mannheim, Tyskland). cDNA ekvivalent av 10 ng total-RNA ble anvendt per brønn. Alle målinger ble utført in triplo. TAQMAN analyser (Applied Biosystems) ble kjørt med 2x absolutt QPCR Mix (Abgene, Thermo Fischer, Epsom, UK). Universal Probe Library (UPL) systemanalyser (Roche) ble kjørt ved hjelp av 480 prober Master (Roche). Rå Cp verdier ble beregnet av Roche LightCycler 480 programvaren med andre deriverte maksimal metoden. Analyser og primer sekvenser er listet opp i tabell S1 sammen med tilsvarende tall tallene. Expression nivåer er presentert som absolutte verdier (Cp) eller som uttrykk i forhold til en intern referanse genet (ved hjelp ΔCp metoden).
Western Blotting
eksponentielt voksende celler ble lysert med RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS) supplert med 5 mM EDTA og HALT protease inhibitor cocktail (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med BCA Protein Assay kit (Pierce). Med mindre annet er angitt, ble 30 mikrogram av protein lysates separert i 10% SDS-PAGE-geler og blottet på nitrocellulosemembraner (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland) og analysert med antistoffer som er oppført i tabell S1. Signaler ble oppdaget ved hjelp av ECL substrat løsning [33] og spilt med Fusion-SL 3500 WL bildet oppkjøpet system (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Frankrike).
siRNA-mediert Gene Dempe
Alle siRNAs brukes i studien ble syntetisert av Dharmacon (Thermo Fisher Scientific, Epsom, UK) og resuspendert i 1x siRNA Buffer (Dharmacon). Med mindre annet er angitt, ble cellene sådd ut en dag før transfeksjon ved sammenløpet av 50-70%. siRNA transfeksjon ble utført ved hjelp Lipofectamine RNAi Max (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Transfeksjon kompleksene ble fremstilt i serumfritt OptiMem medium (Gibco) og tilsatt til en komplett vekstmedium i 20:80 volum /volum forhold. Sluttkonsentrasjoner på sirnas var 50 nM (ikke-måls basseng siRNA, ERG siRNA) eller 25 nM (TDRD1 sirnas). Alle siRNA brukt i studien er oppført i tabell S1.
CpG Island Definisjon og Bisulfite DNA sekvense
TDRD1
-promoter forbundet CpG island ble definert i henhold til standard kriterier gitt av UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/). Genomisk DNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp av QIAamp DNA blod Mini Kit (Qiagen). Natriumbisulfitt omdannelse av DNA ble utført med EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) ved anvendelse av 1 pg av genomisk DNA. Den 525-bp DNA-fragment inneholdende TDRD1 promoter-assosierte CpG-øy ble amplifisert med HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen) ved bruk av primere som er oppført i tabell S1. PCR-produktet ble klonet inn i pCR2.1 vektor ved hjelp av TOPO TA-kloningssett (Life Technologies). TOP10 kjemisk kompetente celler (Life Technologies) ble transformert med ligerings produktet. Etter blå-hvit screening, ble plasmider fra koloniene som inneholdt innsatsen utsettes for Sanger-sekvensering (GATC, Konstanz, Tyskland). Raw Sanger-sekvensering leser ble analysert for metylering hendelser ved hjelp av elektroniske verktøy BISMA [34].
5-aza-2′-deoxycytidine Behandling
LNCaP eller Vcap celler ble sådd ut på poly-L- lysin (Sigma-Aldrich) belagte 12-brønners plater med lav tetthet. Som i det følgende dag ble cellene behandlet med bærer (0,1% DMSO, Applichem, Darmstadt, Tyskland) eller de indikerte konsentrasjoner av 5-aza-2′-deoksycytidin (Sigma-Aldrich) i fem påfølgende dager. Hver 24. time, vekstmedium ble erstattet med en nylaget medium som inneholder enten 5-aza-2′-deoxycytidine eller kjøretøy.
celleviabilitet analysen
For levedyktighet analysen, 2.5×10
4 VCap-celler ble sådd i svart bunn 96-brønners plater (Perkin Eimer, Waltham, MA, USA) i 80μl av den normale vekstmediet. Etter 24 timer ble cellene transfektert med sirnas som beskrevet ovenfor og denne dagen ble referert til som «dag 1». Celleviabilitet ble vurdert med CellTiter-Blue celleviabilitet Assay (Promega Corporation, WI, USA) på dag 1, 3, 5, 7 og 9 i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescens ble spilt inn med Tecan Infinite M200 plateleser (Tecan Group Ltd, Männedorf, Sveits).
Statistisk dataanalyse
Alle data ble analysert ved hjelp GraphPad Prism 5.04. Kvantitative data er vist som gjennomsnitt ± SEM (standardfeil av middelverdien) beregnet fra alle utførte eksperimenter, med mindre annet er angitt. Alle sammenligninger mellom eksperimentelle grupper ble utført ved Mann-Whitney-Wilcoxon test med Bonferroni korreksjon (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). Spearman (
ρ
) og Pearson (r) korrelasjonskoeffisienter ble beregnet med GraphPad Prism 5.04.
Resultater
TDRD1
er co-uttrykkes med
ERG
men ikke med
ETV1
i human prostate Cancer
Vår tidligere uttrykk profilering studiet av menneskelige prostata kreft prøvene viste at
TDRD1
er, bortsett fra
ERG
, den mest forskjellig uttrykt gen mellom
TMPRSS2
:
ERG
-negativ og -positive svulster [16]. Vi utførte derfor en korrelasjonsanalyse på data fra 93 prostata vevsprøver (46 godartet, 30
TMPRSS2: ERG
-negativ, 17
TMPRSS2: ERG
-positive prostatakreft) og fant at mRNA nivåer av
ERG Hotell og
TDRD1
målt av human Exon 1,0 ST Array er bemerkelsesverdig korrelert på tvers av alle prøvene (r
2 = 0,84), noe som tyder på en mekanistisk kobling mellom de to gener. I kontrast,
TDRD1
ble ikke co-uttrykkes med
ETV1 plakater (r
2 = 0,05) som er en ETS transkripsjonsfaktor funnet å være sporadisk omorganisert i prostatakreft. For å underbygge disse observasjonene, målte vi
TDRD1
,
ERG Hotell og
ETV1
mRNA nivåer med kvantitativ RT-PCR i samme sett av prøver. Igjen,
TDRD1
uttrykk ble funnet å korrelere med
ERG plakater (r
2 = 0,77), men ikke med
ETV1 plakater (r
2 0,01 ) ekspresjon (fig. 1a). For å gi en uavhengig validering av funnene våre, spørres vi Oncomine databasen [35] med «TDRD1» og «prostatakreft» som søkeord. Analysen av to identifiserte studier støtter våre observasjoner: i data av Grasso et al. [36]
ERG
ble den øverste genet co uttrykt med
TDRD1
. I dataene på Taylor et al. [17],
TDRD1
ble funnet å være co uttrykkes med
ERG plakater (r
2 = 0,55), men ikke med
ETV1 plakater (r
2 = 0,02) over 149 primær prostatakreft. For å forklare den observerte co-uttrykk, vi ansatt cellulære modeller av prostatakreft, inkludert celler som representerer godartet (RWPE-en, BPH-1), fusion-negative (PC-3, DU145),
ERG
-rearranged (Vcap, NCI-H660) og
ETV1
-rearranged (LNCaP) prostatakreft. Genuttrykk målinger i prostata cellelinjer viste at mens
TDRD1
mRNA nivåer var uavhengig av
ETV1
uttrykk, finnes en tydelig sammenheng mellom
TDRD1 Hotell og
ERG
uttrykk
in vitro plakater (fig. 1b). Ingen av cellelinjer uten
ERG
overekspresjon uttrykt
TDRD1
, mens NCI-H660 og Vcap cellelinjer, som begge er bærere av
TMPRSS2: ERG
fusion, uttrykte høy nivåer av
TDRD1 plakater (fig. 1b). Vi spurte om de høye nivåene av både
TDRD1 Hotell og
ERG
messenger RNA i ERG-positive prostataceller sette til betydelige mengder av de respektive proteiner og funnet ut at Vcap celler uttrykker ERG og TDRD1 på nivåer påvises ved western-blotting (fig. 1c). Basert på disse første resultatene, bestemte vi oss for å bruke Vcap celler som
in vitro
modell for å studere mekanistiske forholdet mellom
ERG Hotell og
TDRD1
gener i
ERG –
omorganiseres prostatakreft
(A) korrelasjon analyse av mRNA nivåer målt ved QRT-PCR i
TMPRSS2: ERG
-negativ (ERG-, n = 30) og
TMPRSS2: ERG
-positivt (ERG +, n = 17) prostatakreft samt tilstøtende godartet prostatavevet (n = 46). Pearson korrelasjonskoeffisient er vist. (B) Analyse av mRNA uttrykk i prostata cellelinjer ved QRT-PCR. To uavhengige eksperimenter ble utført in triplo. Menneskelig testis RNA ble brukt som positiv kontroll for
TDRD1
uttrykk. (C) Analyse av protein ekspresjon i prostata cellelinjer ved western blotting. (D) Analyse av mRNA-ekspresjon i hematopoetiske kreftcellelinjer ved QRT-PCR. To uavhengige eksperimenter ble utført i tre eksemplarer.
TDRD1
ikke er co-uttrykkes med
ERG
i Hematopoietic Kreft
Noen blodkreft kreftformer overuttrykker ERG protein [37], [38], og det er kjent at myeloid, T- og Bcell leukemier er avhengig av ERG for vedlikehold [39], [40]. Vi derfor undersøkt
ERG Hotell og
TDRD1
co-uttrykk ved QRT-PCR i et panel av cellelinjer som representerer ulike blodkreft kreft. Selv om vi har oppdaget høye nivåer av
ERG
mRNA i flere kreftcellelinjer avledet fra det hematopoetiske linjen, det tilsvarende uttrykk for
TDRD1
mRNA var omtrent 50 ganger lavere enn i VCap-celler (fig. 1d). For å utvide vår analyse utover cellelinjer, vi sammenlignet
ERG Hotell og
TDRD1
mRNA uttrykk i prostata vev og i cytogenetisk unormal akutt myelogen leukemi (CA-AML) målt ved samme plattform (human Exon 1.0 ST Array) [41]. I motsetning til våre observasjoner i prostatakreft (r
2 = 0,84),
ERG Hotell og
TDRD1
ble ikke co-uttrykt i CA-AML (r
2 = 0,07 ).
ERG
har også blitt rapportert å være overuttrykt i Ewings sarkom [42] – [45]. Vi dermed analysert tilgjengelig genuttrykk profilering studier av Ewing sarkom svulster for
TDRD1 Hotell og
ERG
uttrykk [46], [47]. I motsetning til prostata kreft, var det ingen ko-ekspresjon av
ERG
og
TDRD1
i en hvilken som helst av disse studiene (R «> 2 = 0,03 og 0,02, henholdsvis). Dette tyder på at co-uttrykk for
ERG Hotell og
TDRD1
er spesifikk for prostatakreft.
ERG transkripsjonsfaktor er nødvendig for å opprettholde høy
TDRD1
Expression i
TMPRSS2: ERG
-positive Cells
Samtidig uttrykk for to genene kan forklares med blant annet regulering av et av genene av andre eller av deres felles regulering i en feed-frem loop. For å teste disse mulighetene, utarmet vi enten ERG eller TDRD1 protein i Vcap celler ved RNA interferens og bestemt mRNA og protein uttrykk av både gener. Stanse av
ERG
med 80% virkningsgrad resulterte i 3,9 ganger nedregulering av
TDRD1
mRNA 72 timer etter transfeksjon (P . 0,0001, figur 2a). I kontrast, stanse av
TDRD1
førte ikke til noen endringer i
ERG
mRNA uttrykk. Analyse av de tilsvarende protein nivåer av western blot viste at stanse av
ERG Hotell og
TDRD1
gener var svært effektive, noe som fører til en fullstendig nedbryting av både proteiner fra cellene (fig. 2b). Mens knockdown av
ERG
forårsaket en dyp nedregulering av TDRD1 protein på 72 timer, ingen slike effekter på ERG ble oppdaget etter å kneble av
TDRD1
genet. Et lignende uttrykk mønster ble også observert ved 48 timer etter transfeksjon (data ikke vist). I konklusjonen, er en konstant tilstedeværelse av ERG er nødvendig for å opprettholde høy uttrykk for
TDRD1
i Vcap celler og den observerte co-uttrykk av de to genene i prostatakreft kunne forklares med en ensrettet aktivering av
TDRD1
gjennom ERG transkripsjonsfaktor.
(A)
ERG Hotell og
TDRD1
mRNA uttrykk nivåer i Vcap celler målt 72 timer etter genet stanse med siRNAs. Tre uavhengige eksperimenter ble utført in triplo. (B) ERG og TDRD1 protein uttrykk i Vcap celler 72 timer etter genet stanse med sirnas
TDRD1
Arrangøren-forbundet CpG Island er Hypomethylated i
TMPRSS2. ERG
-positivt prostatakreft
uttrykk for
TDRD1
, sammen med at andre bakterie linje-spesifikke gener, er kjent for å bli undertrykt i somatiske vev ved epigenetisk stanse [26], [48 ]. Vi undersøkte derfor metylering status for
TDRD1
promoter og tilhørende CpG øy i sammenheng med
ERG
rearrangements. Vi inspisert metylering av DNA rundt
TDRD1
transkripsjon start stedet i prostatakreft, som vi hadde analysert av MeDIP-Seq [22], og fant denne regionen skal forskjellig metylert mellom svulster med og uten
TMPRSS2: ERG
genet fusjon. Nærmere bestemt en kb regionen spenner over
TDRD1
promoter-forbundet CpG island ble betydelig hypomethylated i
TMPRSS2: ERG
-positive svulster i forhold til godartet og
TMPRSS2: ERG
-negative tumorer (P . 0,0001, figur 3a). En 500-bp vindu umiddelbart nedstrøms for CpG øya viste ingen forskjeller i DNA-metylering mellom ERG-negative og ERG-positive tumorer (P = 0,41, fig. 3a). Videre DNA sekvens flankerer den antatte
TDRD1
arrangøren ble ikke ulikt metylert mellom noen av de tre gruppene (P 0,05), noe som indikerer at differensial DNA metylering skjer i direkte nærhet av
TDRD1
transkripsjonell starte nettstedet, men ikke rundt det. Av notatet, det gjennomsnittlige nivået på
TDRD1
promoter metylering ble omvendt korrelert med
TDRD1
mRNA nivåer på tvers av alle 93 prøver (
ρ
= -0,57), noe som tyder på at tap av promoter metylering bidrar vesentlig til
TDRD1
overekspresjon i
TMPRSS2. ERG
fusion-positive prostatakreft (fig. 3b)
(A) Analyse av
TDRD1
promoter metylering i prostatakreft ved MeDIP-sekv. Verdiene representerer gjennomsnittet grad av DNA metylering av de 500 bp binger. (B) Korrelasjon analyse av
TDRD1
promoter metylering og
TDRD1
mRNA uttrykk i prostatakreft. Den Spearman korrelasjonskoeffisient vises.
ERG-indusert Tap av epigenetiske undertrykkelse på
TDRD1
Arrangøren er en Major Mekanisme
TDRD1
Aktivering
Siden forskjellig metylert regionen spredte CpG øy forbundet med
TDRD1
promoter og CpG øyer er kjent for å spille en rolle i å regulere transkripsjon [49], har vi utført bisulfite sekvensering av
TDRD1
-associated CpG øy i prostata cellelinjer. Vi fant at CpG øya var fullt metylert i godartede celler og ERG-negative kreftcellelinjer, med en gjennomsnittlig metylering i området fra 89,3% for LNCaP til 98,6% for PC-3 (fig. 4a). I kontrast CpG metylering var nesten helt fraværende i
TMPRSS2: ERG
-positive cellelinjer NCI-H660 og Vcap (11,4% og 0,7%, henholdsvis). Sammenligning av
TDRD1
mRNA nivåer (Fig. 1b) til DNA metylering av CpG-øya på
TDRD1
promoter (fig. 4a) viste en invers korrelasjon mellom de to parametrene over undersøkte cellelinjer, noe som var i samsvar med de tilsvarende data fra prostata-tumorer. Gitt sterk forskjeller i DNA metylering på
TDRD1
promoter mellom ERG-omorganiseres og gjenværende cellelinjer, vi hypotese at tap av DNA metylering på
TDRD1
arrangøren er den viktigste mekanismen ansvarlig for
TDRD1
aktivering. For å teste denne muligheten, behandlet vi ERG-negative LNCaP celler med DNA metyltransferase hemmer 5-aza-deoxycytidine (decitabine [50]). Etter fem dager med behandling med submicromolar konsentrasjoner av decitabine observerte vi en doseavhengig økning i ekspresjon av
GSTP1
gen som er kjent for å bli brakt til taushet ved metylering i LNCaP-celler [51] (fig. 4b). Spesielt,
TDRD1
mRNA ble oppregulert med mer enn 25 ganger. Derfor, etter økning i
TDRD1
mRNA nivåer ble TDRD1 protein påvises i LNCaP celler ved immunoblotting (Fig. 4b, innsats), noe som indikerer at tap av DNA metylering kan faktisk være nok til å kjøre
TDRD1
uttrykk.
(A) DNA metylering analyse av
TDRD1
promoter-forbundet CpG øy i prostata cellelinjer ved bisulfite sekvensering. Gjennomsnitt metylering nivået for hele CpG øy beregnet fra fem sekvenserte kolonier er vist (%). (B) Analyse av mRNA-ekspresjon i LNCaP-celler etter behandling med demethylating midlet 5-aza-2′-deoksycytidin. Sett: analyse av protein ekspresjon i LNCaP-celler etter behandling med 5-aza-2′-deoksycytidin. 75μg av protein lysat fra LNCaP celler ble brukt per kjørefelt. (C) Analyse av mRNA uttrykk i stabile LNCaP kloner overekspresjon
ERG
. To uavhengige eksperimenter ble utført in triplo. Sett inn: ERG uttrykk analyse på 48 timer i LNCaP kloner av western blotting. (D) Bisulfite sekvensering av
TDRD1
promoter-forbundet CpG øy i LNCaP celler 48 timer etter induksjon av ERG uttrykk med doksycyklin. (E) Bisulfite sekvensering av
TDRD1
promoter-forbundet CpG island 96 timer etter å kneble av
ERG
i Vcap celler. Dataene som vises i (D) og (E) er gjennomsnittet% av metylering av hele CpG island beregnet fra 11-12 sekvensert kloner.
For å sjekke om ERG kan etterligne effekten utøves på
TDRD1
uttrykk ved demetylering av LNCaP genomet, genererte vi stabile LNCaP celler som overuttrykker kodende sekvens av
TMPRSS2: ERG
fusion T1 /E4 i en induserbar måte. Induksjon av
ERG
uttrykk med doksycyklin førte til en nesten fem ganger økning i
TDRD1
mRNA, mens doksycyklin hadde ingen innflytelse på
TDRD1
uttrykk i LNCaP klone bærer Målt ekspresjonsvektor (fig. 4c). Vi har brukt bisulfite sekvensering for å analysere den tilsvarende DNA metylering status for
TDRD1
promoter-forbundet CpG island på ERG induksjon. ERG overekspresjon førte til hypometylering av
TDRD1
promoter-regionen i 27% av de undersøkte lene, mens vi ikke observere noen hypometylering på doxycycline behandling i den tomme vektor kontroll (Fig. 4d, fig. S1 A). Gitt at converse forsøket, dvs. uttømming av ERG i Vcap celler ved RNAi, har ført til nedregulering av TDRD1 uttrykk (Fig. 2) har vi også utført bisulfite sekvensering av
TDRD1
CpG øy etter ERG stanse i Vcap celler. På 96 timer etter transfeksjon, tie av ERG med 65% virkningsgrad resulterte i nesten tre ganger økning i gjennomsnittlig DNA metylering ved CpG island, fra 15,7% av denaturert CPGs i ikke-måls kontrollen til 45% i celler behandlet med siRNA målretting
ERG plakater (fig. 4e, fig. S1b).
de ovennevnte observasjonene viser at DNA metylering status for
TDRD1
promoter og dermed dets transkripsjonen aktivitet er mechanistically knyttet til nivåer av ERG transkripsjonsfaktor i prostatakreftceller.
Differensial rolle
TDRD1
i testikkel og prostatakreft
Den evolusjonære konservert Pirna pathway spiller en viktig rolle i mannlig kimcellelinje under sædcelle [52] – [54]. Komponentene av Pirna pathway virker til å undertrykke aktiviteten av transposable elementer, potensielt for å opprettholde integriteten av kimlinje kromosomer under genom-wide demetylering i opphavelige kjønnsceller [55] – [57]. Studier utført i mus og sebrafisk har vist at Tdrd1, ortolog av menneskelig
TDRD1
, er en del av Pirna sti som spesielt samhandler med Pirna-assosierte proteiner for å forsterke Pirna-mediert stanse av line1 retrotransposons. Følgelig tapet av Tdrd1 i mus ble vist å resultere i LINE1 derepresjon [27], [58]. Hos mennesker, fire ortologer koder for Pirna-assosierte proteiner finnes:
PIWIL1 Anmeldelser –
PIWIL4 product: [59]. [17].
