Abstract
Keratin 23 (KRT23) er sterkt uttrykt i tykktarm adenokarsinomer, men fraværende i normal tykktarm slimhinne. Array basert metylering profilering av 40 kolon prøvene viste at arrangøren av KRT23 ble metylert i normal tykktarm slimhinner, mens hypomethylated i de fleste adenokarsinomer. Arrangøren metylering korrelert med fraværende uttrykk, mens økt KRT23 uttrykk i tumorprøver korrelert med arrangøren hypometylering, som bekreftet av bisulfite sekvensering. Demetylering indusert KRT23 uttrykk
in vitro.
Expression profilering av shRNA mediert stabil KRT23 knockdown i tykktarm kreft cellelinjer viste at KRT23 utarming påvirket molekyler i cellesyklusen og DNA replikasjon, rekombinasjon og reparasjon.
In vitro
analyser bekreftet at KRT23 utarming betydelig redusert mobil spredning av SW948 og LS1034 celler og markert redusert uttrykket av gener involvert i DNA-skade respons, hovedsakelig molekyler av dobbel tråd pause reparasjon homolog rekombinasjon veien. KRT23 knockdown redusert transkripsjon og protein uttrykk for nøkkelmolekyler som f.eks MRE11A, E2F1, RAD51 og BRCA1. Knockdown av KRT23 gjengis tykktarmskreftceller mer følsomme for stråling og redusert spredning av KRT23 utarmet celler sammenlignet med bestrålte kontrollceller
Citation. Birkenkamp-Demtröder K, Hahn SA, Mansilla F, Thorsen K, Maghnouj A, Christensen R, et al. (2013) Keratin23 (KRT23) Pusse Reduserer spredning og påvirker DNA Damage Response of Colon kreft celler. PLoS ONE 8 (9): e73593. doi: 10,1371 /journal.pone.0073593
Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 20 november 2012; Akseptert: 25. juli 2013, Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Birkenkamp-Demtröder et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet med tilskudd fra John og Birthe Meyer Foundation, Lundbeck Foundation, Novo Nordisk Foundation og den danske Forskningsrådet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) står for ca 10% av den totale verdensbasis krefttilfellene med en samlet fem år overlevelse på rundt 50% [1]. Tidlig diagnose og bedre behandling av CRC krever identifisering av nye biomarkører samt innsikt i de molekylære mekanismene for kolorektal kreftutvikling.
To viktige molekylære undergrupper av tykktarmskreft eksisterer, mikro ustabil (MSI) og mikro stabil (MSS ) [2], hvor MSI tumorer representerer omtrent 15% av den totale forekomst [3]. Mikro ustabil svulster viser mutasjoner eller epigenetiske forandringer i mismatch-reparasjonsgener som fører til endringer i mikro DNA (korte gjentatte sekvenser av DNA). Økende bevis tyder på at MSI svulster er assosiert med bedre prognose [4] og at pasienter med MSI ikke kan ha nytte av fluorouracil-basert adjuvant kjemoterapi [5] [6].
Flere epigenetiske forandringer er blitt beskrevet for CRC [ ,,,0],7]. Aberrant metylering i tykktarmen kan observeres allerede i begynnelsen av premaligne lesjoner, samt i tumor-tilstøtende normal-vises mucosa. Epigenetisk genaktivering basert på DNA-demetylering eller hypometylering av promoter-regionen er involvert i initiering og progresjon av kreft [7].
keratin er de mellomliggende filamentdannende proteiner av epitelceller. I dag blir 54 pattedyr keratiner kjent 28 type I (sur) og 26 type II (basis-til-nøytral) keratiner [8]. Flere studier har gitt bevis for aktiv keratin engasjement i kreftcellevekst, invasjon og metastase, såvel som i behandlingen reaksjonsevne. Videre har det vært foreslått å videre undersøke hvilken rolle keratin som multifunksjonelle regulatorer av epitel tumorigenesis [9].
Keratin 23 (
KRT23
) tilhører den sure type I keratins [10] . Den KRT23 transkriptet ble funnet å være sterkt indusert i den humane bukspyttkjertelkreft cellelinje ASPC-1 ved behandling med en histondeacetylase-inhibitor (HDACi) [11]. Videre K23 ble identifisert som et tumorassosiert antigen i serum fra pasienter med leverkreft [12]. I tidligere studier, identifiserte vi KRT23 transkripsjon og K23 protein for å være sterkt oppregulert i tykktarm adenokarsinomer i forhold til normal slimhinne [13] [14]. Verken KRT23 transkripsjon eller det K23-protein har vist seg å være en prognostisk markør i tykktarmskreft; Men observerte vi en tendens til at pasienter med stadium II kolon adenokarsinomer med høye KRT23 transkripsjonsnivåer syntes å ha en lavere tilbakefall. Fosfoproteinet K23 akkumulert i Golgi av flertallet av MSS svulster, mens de fleste av MSI svulster viste mindre cytoplasma uttrykk eller var helt negativ for K23 protein uttrykk [14]. Overekspresjon av KRT23 redusert den cellulære levedyktigheten til MSI cellelinjer mens det hadde ingen betydelig funksjonell virkning på MSS-cellelinjer [14]. Arrangøren bindende analysen identifisert flere gener som korrelerer med KRT23 uttrykk i adenokarsinomer. Nylig ble smad4 induserbare K23 protein kjent for å interagere med keratin K8 og K18, varmesjokkproteiner 60 og 70, plectin 1, samt 14-3-3epsilon og y [15], hvilket antyder en viktig rolle for K23 i reguleringsprosesser . Dens regulerende rolle kan også bli støttet av de aller siste funn av Starman et al identifiserer KRT23 som en potensiell biomarkør for steatohepatitis [16].
Formålet med denne studien var å identifisere en reguleringsmekanisme for KRT23 uttrykk. Videre ment vi identifisere nedstrøms målgener og tilhørende veier på KRT23 knockdown, for å belyse effekten av KRT23 utarming på de molekylære og cellulære funksjoner av kreftceller.
Materialer og metoder
informerte skrevet samtykke ble innhentet fra alle pasienter og alle studiene ble godkjent av Region Midtjylland komiteer på Biomedical Research Ethics.
Whole Genome Metylering Analyse
Genomisk DNA fra seriefrysesnitt ble hentet ved hjelp Puregene DNA rensing kit (Gentra Systems, Plymouth, MN). Når det er nødvendig, ble tumor biopsier makroskopisk trimmet for å berike brøkdel av neoplastiske celler til et minimum på 60% før DNA-isolering. Median kreftcelle andelen var 80%. En mikrogram av DNA var bisulfit endres ved hjelp EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, København, Danmark) med EZ-96 DNA Metylering D5004 (Zymo Research, Orange, CA) for mikromatriser og bisulfite sekvensering. Bisulfite modifisert DNA var hele genomet forsterkes og hybridisert til infinium HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, San Diego, California) over natten som beskrevet av produsenten. BeadChips ble skannet med en BeadXpress Reader instrument (Illumina) og data analysert ved hjelp av Bead Studio Metylering Module programvare (Illumina) som beskrevet i detalj i [17]. Metylering nivåene ble gitt i betaverdier, med en betaverdi på 0 tilsvarer ingen metylering, og en tilsvarende full metylering. For sammenligning av metylering status versus ekspresjonsdata, ble log2 ekspresjon intensitetene som oppnås ved microarray ekspresjon profilering av de samme prøvene ble prøver normalisert ved RMA og transkripsjons intensiteter log2 5 ble ansett som «ikke uttrykte»
Bisulfite Sequencing.
Bisulfite modifiserte DNA ble forsterket ved hjelp av primere designet med MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html). PCR produktene ble gelrenset og klonet ved hjelp TOPO TA Cloning ® Kit for Sekvensering (Invitrogen, Taastrup, Danmark). PCR-amplifikasjon for sekvensering ble utført direkte på koloniene med M13-primere (DNA-teknologi, Risskov, Danmark) og TEMPase DNA Polymerase (Amplicon, Skovlunde, Danmark). For hvert gen, ble 10 kloner valgt tilfeldig og sekvensert ved anvendelse av BigDye terminatorsyklussekvenseringssett og en 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). I detalj, analyserte vi en sekvens omfattende 253 bp overlappende transkripsjonsstart (1) og den første KRT23 ekson. Genomisk DNA ble isolert fra to forskjellige sett, 23 tumorbiopsipasientprøver (4 normal slimhinne, 3 adenomer, 5 MSI og 12 MSS) og cellene AZA behandlede HCT116-celler som er beskrevet ovenfor ved hjelp av Gentra PUREGENE DNA Purification Kit (Qiagen). DNA var bisulfite omregnet til MethylEasy DNA Bisulfite Modification Kit (Diagenode)
253 bp KRT23 amplicon ble PCR forsterket med TEMPase Hot Start-DNA Polymerase (Amplicon) med en blanding som inneholder primere F1 (C). 5 « – GTGGTTTTCGTTTTTAGATTGTTT-3 «og F1 (T) 5′- GTGGTTTTTGTTTTTAGATTGTTT og R1:5′- TCAAAACCAAACAACCCTAACCTA-3». De amplikonene ble gelrenset (Gel 11Band Purification Kit, GE Healthcare) og subklonet inn i pCR4-TOPO vektor (Invitrogen) var 12-16 kloner fra hvert forsøk ble sekvensert ved hjelp av M13 forover primere. For visualisering av metylering status, brukte vi følgende programvare:. https://quma.cdb.riken.jp/
Colon cellelinjer
Innhentet fra American Type Culture Collection (ATCC-LGC standarder, Borås, Sverige) eller hentes fra Hahn lab ble re-godkjent via STR-analyse [18] med Cell-ID-system (G9500, Promega, Nacka, Sverige), ble analysert på en Applied-Biosystems3130 Genetic Analyzer. Ingen mycoplasma forurensning ble oppdaget ved hjelp nestet PCR-basert mycoplasma gjenkjenning. Tykktarmskreft cellelinjer i denne studien var HCT116 (MSI), DLD1 (MSI), SW480 (MSS, p53 mutert), SW948 (MSS, Dukes «type C, klasse III, tumorigent, p53 mutert), LS1034 (MSS, Dukes C , mutasjoner i p53 (G245S), APC (E1309fs * 4) og KRAS (A146T). Den humane embryonale nyrecellelinje HEK293 anvendt for E2F1 overekspresjon ble også gjen autentisert via STR analyse.
Cellene ble høstet etter skraping flaskene med en ml lysisbuffer og total RNA ble ekstrahert ved hjelp GenElute pattedyr Total RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Art.nr. RTN350) i henhold til produsentens instruksjoner og RNA integritet ble vurdert av en . Bioanalyzer (RIN = 9,9) RNA ble analysert på U133plus2.0 eller ExonST1.0 arrays (Affymetrix), sammenligning analyse ble utført ved hjelp MAS5.0 programvare prober ledsaget av en Inc /desember samtale og en log2 ratio | . 0.5 |. ble inkludert, men ekskludert da oppført som » fraværende » gener ble kommentert med Affymetrix nETAFFX annotering (NCBI Bygg 36.1, netaffx-build = 28). Exon Array data ble quantile-normalisert ved hjelp av Exon16 algoritmen med kjerne transkripsjoner (17881 transkripsjoner) og antigenomisk bakgrunns sonder eller iterPLIER uttrykk konsollen. All data analyse ble utført ved hjelp av GeneSpring GX 10 software (Agilent).
Colon vevsprøver
Total RNA ble renset fra seriefrysesnitt med mer enn 75% tumor innhold ved hjelp RNeasy MinElute kolonner følge produsentens instruksjoner (Qiagen). God kvalitet RNA (RIN 7) ble bekreftet ved analyse på 2100 Bioanalyzer (Agilent). Analyse på U133A og U133plus2.0 GeneChips og normalisering av dataene ble utført som tidligere beskrevet (10). Ekspresjons-verdier er gitt i «log2». For Exon 1,0 ST Array analyserer prøvene ble merket i henhold til Genechip Whole Avskrift (WT) Sense Target merkingsassay Menneskelig og hybridisert til Exon 1,0 ST Arrays (Affymetrix) som tidligere beskrevet (11). Exon Array data ble quantile-normalisert ved hjelp av ExonRMA16 algoritmen med kjerne transkripsjoner (17881 transkripsjoner) og antigenomisk bakgrunns sonder. All data analyse ble utført ved hjelp av GeneSpring GX 10 software (Agilent).
cDNA syntese
In vitro transkripsjon og merking av Sort, hybridisering til Affymetrix U133plus2.0 GeneChips og skanning av disse ble utført ved hjelp standardprosedyrer, se referanse (12). Sammenligning analyser av celle linje som ble utført med Affymetrix MAS5.0 programvare. Filtre brukes: prober ble inkludert hvis sammenligningen oppført et Inc /desember samtale ledsaget av en log2 ratio 0,5 eller -0,5 (terskelen til log 0,5 eller log2 -0,5 ble vilkårlig definert). Prober ble ekskludert fra analysen hvis de ble oppført som » fraværende » og /eller hadde uttrykk verdier log2 4 i begge prøvene sammenlignet. Gener ble kommentert med Affymetrix NETAFFX annotering (NCBI Bygg 36.1, netaffx-build = 28).
5-Aza-2′-deoxycytidine Behandling av tykktarmskreft Cells
KRT23 negativ HCT116 eller DLD1 tykktarmskreftceller ble behandlet med 2,5, 5 eller 7,5 pM 5′-AZA-dC i DMSO eller CH3COOH (Sigma-Aldrich, København, Danmark) hver 24. time i 2 dager etterfulgt av en rekonstituering dag som beskrevet i litteraturen.
Reverse Transcription Kvantitativ PCR (RTqPCR)
RNA ble ekstrahert fra HCT116 tykktarm kreft celler behandlet med ulike konsentrasjoner av AZA bruker RNeasy kolonner i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen). cDNA fra disse prøvene ble syntetisert som beskrevet (13), ved bruk av oligo-dT primer i stedet for tilfeldige primere. RTqPCR analyse ble utført i tre paralleller på en ABI 7500 Fast Real Time System (Applied Biosystems) ved hjelp av TaqMan® sonde analysen Ker23 ID Hs0021096_m1 som anbefalt av produsenten. Data ble normalisert mot Ubiquitin C (UBC) som tidligere beskrevet [19].
shRNA-vektor Forberedelse, Lentivirus Produksjon og Lentiviral Infeksjon
shRNA-vektor forberedelse, lentivirus produksjon og lentiviral infeksjon ble utført som tidligere beskrevet (9). For hver av de tre cellelinjer SW480, SW948 og LS1034, en stabil kontrollcellelinje inneholdende en tom lentiviral vektor og fem forskjellige KRT23 bestemte stabile knock-out ble etablert; de to mest effektive sh-1010 og sh-1506 ble anvendt til videre studier. I korte trekk ble de shRNA vektorkonstruksjoner fremstilt med pLKO.1 puro (vennligst tilveiebrakt av Sheila Stewart, Washington University, USA) inneholdende et 1,8 kb stuffer sekvens i stedet for den shRNA kassetten. Den pLKO.1 plasmid ble dobbelt fordøyd med EcoRI og AgeI i 1 time for å frigjøre det 1,8 kb stuffer-fragmentet. DNA-fragmentene ble deretter separert ved anvendelse av en 1% agarosegel. Den 7,1 kb EcoRI /AgeI bandet ble skåret ut og DNA ble ekstrahert ved hjelp Qiaquick gel utvinning kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Par av fornuft og antisense hårnål oligonukleotider ble hentet fra Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Tyskland). For å danne den shRNA kassetten 5,4 ug av hvert oligonukleotid ble hybridisert i et volum på 100 ul. Den annealing buffer var 1x T4-DNA ligase buffer (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Den annealing Blandingen ble inkubert i en termosykler (DNA Engine Opticon®2 cycler MJ Research, Waltham, MA, USA), gradvis avkjøling fra 99 ° C til 16 ° C i løpet av 70 min. Ligering ble utført i 20 pl reaksjonsvolum ved anvendelse av 1 enhet T4 DNA-ligase (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) og 100 ng av vektor-DNA i en 01:04 molar vektor-insert-forhold og inkubert ved 16 ° C over natten. 2 pl av ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere 40 pl kompetente 10 på topp-celler (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) under anvendelse av standard prosedyre elektroporering. De transformerte cellene ble utvunnet i 0,8 ml av LB i 1 time ved 37 ° C og sådd ut på ampicillin (100 ug /ml) inneholdende agarplater. Plasmid DNA forberedelser ble gjort fra over-natt kulturer av individuelle kolonier med Pure Yield® plasmidet MidiPrep System (Promega, Mannheim, Tyskland) etter produsentens protokoll. Den riktige sekvensen ble verifisert via standard syklus-sekvensering for hver shRNA kassett. Lentiviruses ble fremstilt ved transfeksjon av emballasje celler (HEK293T) med et 3-plasmid-systemet. DNA for transfeksjoner ble fremstilt ved å blande 12 ug pCMVΔRR8.2, 1 ug Phit G og 12 ug pLKO.1 plasmid-DNA med 62 pl av 2 M CaCl
2 i et endelig volum på 500 ul. Deretter ble 500 ul av 2 x HBS fosfatbuffer ble dråpevis tilsatt til blandingen og inkubert i 10 minutter ved RT. 1 ml-transfeksjon Blandingen ble tilsatt til 50% sammenflytende celle HEK293T sådd dagen før i et 10 cm brønners plate. Celler ble inkubert i 16 timer (37 ° C og 10% CO
2), og mediet ble endret for å fjerne gjenværende transfeksjon reagens. Lentivirale supernatanter ble samlet opp ved 36 timer etter transfeksjon og for hver infeksjon 3 ml supernatant inneholdende 4 mikrogram /ml polybren ble umiddelbart anvendt for å infisere målceller sådd dagen før i 6 cm-brønners plater for å nå 70% konfluens på infeksjonsdagen. Celler ble inkubert i 24 timer, og mediet ble endret for å fjerne viruspartikler. For å kontrollere infeksjonsrate en parallell infeksjon under identiske forhold rettet mot samme cellelinje ble utarbeidet med en lentiviral GFP uttrykk kontroll vektor (pRRLU6-CPPT-PSK-GFP, vennlig levert av S. Stewart). 6 dager etter infeksjonen 2 ug /ml puromycin ble tilsatt til cellekulturmedier. Kvantitativ RT-PCR ble brukt til å validere effektiv knockdown og data ble normalisert mot GAPDH, HPRT1 eller PPIA. Total RNA fra stabilt transfekterte cellelinjer ble isolert ved syre fenolekstraksjon. cDNA ble syntetisert ved anvendelse av 2 pg av total RNA, oligo (dT)
18 primere og Superscript ™ II RNase H
– revers transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) ved å følge produsentens protokoll og fortynnet til et sluttvolum på 50 mL med 1x første tråd buffer. Intron spenner primersett for QRT-PCR ble utformet ved hjelp Primer Express 2.0-programvare (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). QRT-PCR ble utført ved anvendelse av en SYBR grønn I reaksjonsblanding inneholdende 75 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM ammoniumsulfat, 0,01% (v /v) Tween 20, 2 mM magnesiumklorid (alle Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland), 1 mL av en 600-gangers fortynning av SYBR Grønn i (BioWhittaker, Rockland, ME, USA), 2,5 U Taq polymerase (NEB, Frankfurt aM, Tyskland), 0,2 mM dNTP (Promega, Mannheim, Tyskland) og 0,2 uM av forover og revers primer (Qiagen, Hilden, Tyskland) i et sluttreaksjonsvolum på 20 ul. Reaksjonene ble kjørt på en DNA Engine Opticon®2 cycler (MJ Research, Waltham, MA, USA). Sykkel betingelser besto av 3 min innledende denaturering ved 94 ° C og 40 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sekunder og 80 ° C i 3 sek. Fluorescens ble målt ved det siste trinn i hver syklus. Melting kurver ble oppnådd etter hver PCR-kjøring og viste enkelt PCR-produkter. cDNA ble kjørt i tre eksemplarer, ble ikke-RT (uten revers transkriptase) og ingen mal kontroller kjøres i duplikater. PCR effektivitet ble bestemt med serielle fortynninger av et cDNA avledet fra cellelinje SW480 Expression nivåer for gener av interesse og for rengjøring gener ble målt etter i uavhengige PCR går. Expression forhold ble beregnet som beskrevet av M. Pfaffl [20] med den geometriske betyr uttrykket av renhold gener GAPD, HPRT1 og PPIA å normal uttrykket data for det aktuelle genet.
Western Blotting
Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [21]. De polyklonale kanin-anti-K23-antistoff, er beskrevet i detalj i [14], ble anvendt i en 1:500 og 1:1000 fortynning. En monospesifikke antistoff ble generert av affinitet-rensing mot peptid CKWHQQRDPGSKKDYS, posisjon 106-120 i protein sekvens NP_056330.3 (Eurogentec, Belgia). Den monospesifikt anti-K23-antistoff ble anvendt i en fortynning 1:150 for western blotting. BioRad er «All Blue» ble benyttet som molekylvektmarkør, beta-aktin monoklonalt antistoff (# A-1978, klon AC-15, Sigma-Aldrich Denmark A /S) fortynnet til 0.05μg /ml ble brukt som kontroll lasting. Mus monoklonalt anti-humant MRE11A antistoff (ab214, Abcam, Storbritannia, masse 912 394) ble anvendt i 1:500-1:1000 fortynninger, muse-monoklonalt anti-humant RAD51 (H-92) (sc-8349, Santa Cruz, USA, mye E0610) i en 1:100 fortynning, mus monoklonalt anti-human BRCA1 (MS110) (ab16780, Abcam, UK, mye GR3646-1) i en 1:200 fortynning. Musen monoklonalt anti-E2F1 var en slags gave fra professor Kristian Helin, BRIC, København, Danmark og ble brukt i en 1:05 fortynning. Utdrag fra HEK293-celler som overuttrykker rekombinant HA-merket E2F1 fra ekspresjonsvektoren pCMVHA-E2F1 ble brukt som en kontroll [22].
immunfluorescens Mikros
Celler ble sådd på 16 brønn kammer lysbilder ( . Nunc, glass katt nr 178599, ingen endogen fluorescens), fiksert i kald metanol (-20 C) og farget med de følgende antistoffer: kanin polyklonalt anti-K23-antistoff (1:500) (11), muse-monoklonalt anti-Ki67 (1:100, DAKO Cytomation), anti-E2F1 ufortynnet, anti-MRE11A 1:1000, anti-RAD51 01:50 og anti-BRCA1 1: 200. De sekundære antistoffene som ble anvendt AlexaFlour 488 geit-anti-kanin-IgG mange kryss adsorbert (1:2,000;. Mol Probes Inc., Eugene, OR) eller AlexaFlour 488 geite-anti-muse-IgG mange kryss adsorbert (1:2,000; Mol. probes Inc., Eugene, Oregon). Hoechst 33342 ble brukt for atom flekker og lysbilder ble montert med Fluorescence Mounting Medium (DakoCytomation) og et dekkglass (Nunc, Cat No. 171080). Bilder ble kjøpt med en Axiovert 200 M (Zeiss Microimaging, Inc.).
Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA)
Microarray uttrykk data normalisert med RMA (Robust multichip gjenomsnitt) ble utsatt for IPA, versjon 8.8. Data under vilkårlig satt terskelen til log2 4,0 ble ekskludert fra analysene, log2 intensiteter av log2 5 ble ansett som fraværende uttrykk. Expression verdier ble normalisert rundt null. Normalisert forhold gitt som (-Inf, -1] og [1, + INF) ble sendt til IPA.
Proliferation Studies
Livskraftig og spredning av kolon cellelinjer stabilt transfektert med sh-RNA mot KRT23 ble bestemt ved en MTT-assay (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] 2,5-difenyltetrazoliumbromid) som en funksjon av cellulær metabolisme i henhold til produsentens instruksjoner (Roche, Tyskland). Absorbans ved 550 nm /690 nm ble målt på ulike tidspunkter. Spredning av tykktarm kreft celler ble vurdert av CyQUANT® NF-analysen i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). Fluorescensintensiteter ble målt med en Synergy ™ HT Microplate Reader (Biotek, Tyskland) ved anvendelse av eksitasjon ved 485/20 nm og fluorescens deteksjon ved 528/20 nm. Cell cytotoksisitet ble vurdert av en LDH-analysen (laktat dehydrogenase) i henhold til produsentens instruksjoner (Cytotoksisitet Detection kit, Cat. No. 11 644 793 001, Roche Diagnostics, Hvidovre, Danmark). Etikett-fri overvåking av spredning og levedyktighet over et område på flere dager ble utført på 96-brønners E-plater på en RTCA (sanntidsovervåking av celler) SP enkelt plate instrument eller 16-brønn E-plater eller CIM plater (cellular invasjon og migrering) på en DP Dual Plate instrument (Roche). Adhesjon ble overvåket ved hjelp av e-plater i intervaller på 1-5 minutter i løpet av de første 1-6 timer etter seeding. Spredning ble overvåket ved hjelp av e-plater i intervaller på 15 minutter i perioder med 1-120 timer, såing 4000-16000 celler per brønn, henholdsvis. Analyser ble utført i tre paralleller, og resultatene ble validert ved konvensjonelle analyser. Cellemigrasjon på CIM-plater ble overvåket i duplikater i 1 minutts intervaller innenfor perioder på 2-48 h timer, såing 40.000-60.000 celler per brønn. Ved hjelp av den iboende RTCA programvaren ble dobling tid (DT) beregnet i henhold til DT = log2 /skråning utgitt av Zhang et al [23], https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/RTCA. html. Den beregnede DT er den celleindeks doblingstiden, som ikke er lik tiden når cellen nummer dobles, fordi Cell indeksverdier er en kombinasjon av en måling av cellenes levedyktighet, cellenummer, cellemorfologi, og graden av celleadhesjon.
bestråling av tykktarmskreft Cells
for å finne ut om stråling kan ha en innvirkning på SW948 eller LS1034 celler med en KRT23 knockdown vi utført en dose optimalisering bestråle med 0-10 GY av gammastråler hjelp en
137Cs radiator Gammacelle 2000RH (AEK Risø, Danmark) som tidligere beskrevet [24].
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av STATA 10 (Statacorp, Texas, USA). Transkripsjon verdier ble uttrykt som median log2 ± standardavvik (sd). En to-tailed t-test ble brukt og p-verdier p. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
KRT23 Arrangøren Metylering
metylering status for KRT23 promoter ble vurdert i 40 vevsprøver kolon (seks normal slimhinne, seks adenom, fem MSI og 23 MSS adenokarsinom vev) ved hjelp av Illumina Perler arrays avhør CG-sider i posisjon cg06378617 og cg22392708 ligger i KRT23 promoter (figur A på figur S1 i File S1). En meget betydelig reduksjon i nivåene av metylering MSS adenokarsinomer kunne observeres for begge avlest CG-områder sammenlignet med seks normal slimhinne prøver (Mann-Whitney U-test, p-verdi 1.9E-04 for cg06378617 og 5.3E-04 for cg22392708). MSI adenokarsinomer samt adenomer viste signifikant redusert metylering for cg06378617 CG nettstedet bare (Mann-Whitney U-test, p-verdi 1.7E-02 og 2.2E-03, henholdsvis). Parallell transkripsjon ekspresjon profilering av de samme prøver ved hjelp av Exon 1,0 ST arrays viste at KRT23 transkriptet var fraværende i normale slimhinner, noe som bekrefter tidligere resultater (8). Men entydige transkripsjonsnivåer ble identifisert i 4/6 adenomer og i de fleste adenokarsinomer. En negativ korrelasjon ble identifisert mellom arrangøren metylering og KRT23 transkripsjon uttrykk i posisjoner både avhørt CG nettsteder, posisjon cg06378617 og cg22392708 med Spearman rang korrelasjonskoeffisient på -0,64 og -0,74, henholdsvis (figur 1). Illumina array-data ble validert av bisulfite sekvense bruker prøver med ulike KRT23 uttrykk nivåer som spenner fra lav til høy fra en uavhengig utvalg satt ikke tidligere analysert på Illumina arrays, og hvor DNA-prøver og uttrykk microarray data var tilgjengelige. Som det ikke var mulig å få spesifikke primere for Illumina CpG-site cg06378617, analyserte vi promoter metylering ved cg22392708 (posisjon 116 i figur 2A) og fem ekstra tilstøtende CpG-sider (posisjonene 152, 167, 174, 189 og 228) . Bisulfitt sekvensering av minst 10 kloner pr prøve ble utført på DNA ekstrahert fra 23 vevsprøver som omfatter normal slimhinne (n = 3), en normal basseng (n = 10), adenomer (n = 3) og adenokarsinomer (MSI n = 5 og MSS n = 11) (figur 2A). Deretter ble metylering status i forhold til microarray transkripsjon profilering data. I alle stillinger, bortsett fra ved posisjon 116, ble høye nivå av metylering fulgt av lav KRT23 ekspresjon i 87% av tilfellene. Den KRT23 promoteren til normal slimhinne viste 50-75% metylering fulgt av fraværende KRT23 uttrykket (transkripsjonsnivåer av log2 5). I motsetning til de fleste av MSS tumorer viste mindre enn 25% metylering ledsaget av høy KRT23 ekspresjonsnivåer av log2 ni i 7/11 MSS tumorer som ble analysert (figur 2A)
Sammenligning av KRT23 transkripsjons data fra Exon. 1.0 ST arrays (- • -) til metylering data fra 2 sonder, cg22392708 og cg06378617 fra Illumina Perler arrays (□) viste en negativ sammenheng mellom metylering og transkripsjon i de 40 vevsprøver analysert (Spearman rang korrelasjonskoeffisient på -0,64 og – 0,74, henholdsvis).
Posisjons 116 tilsvarer Cg22392708. • metylert, ○ unmethylated; MSI og MSS tykktarm adenokarsinomer. A) Metylering status av kolon biopsier ble sammenlignet med avskrift uttrykk data fra Exon 1,0 ST arrays. For de fleste av prøvene, høy metylering verdier er i overensstemmelse med lave verdier og vice versa. Log2 intensiteter vises i panelet til høyre, ble verdier under log2 = 5 betraktet som fraværende uttrykk. B) Behandling av HCT116-celler (MSI) ikke uttrykker KRT23 med 5′-AZA-dC viste at redusert metylering resultert i en økt uttrykk for KRT23 karakterutskriften.
KRT23 Expression er indusert av Demetyler
to MSI colon-cellelinjer, HCT116 og DLD1 uten KRT23 ekspresjon, ble behandlet med økende konsentrasjoner av 5-aza-2′-deoksycytidin (5′-aZA-dC) og DMSO eller CH3COOH som kontroller og cellelevedyktigheten ble overvåket ved MTT-analysen (ikke vist). RTqPCR analyse bruker en SYBR-grønn sonde eller en Taqman sonde mot KRT23 viste at 2.5μM 5′-AZA-DC var tilstrekkelig til å indusere en sterk oppregulering av KRT23 resulterer i en 18-fold (HCT116-celler) eller 120 ganger (DLD1 celler) økning, sammenlignet for å spotte behandlede celler (Figur B i figur S1 i File S1). Hele genomet uttrykk profilering ved hjelp Exon 1,0 ST arrays bekreftet den sterke oppregulering av KRT23 i HCT116 og DLD1 celler på 5’AZA-dC behandling og viste re-uttrykket av flere gener som f.eks MAEL og UCHL1 (data ikke vist), gener som tidligere er rapportert å være induserbart med en demethylating middel [25]. Bisulfitt-sekvensering ved seks posisjoner i KRT23 promoteren til 5′-AZA-dC behandlede HCT116-celler bekreftet en 80% -100% metylering i CH3COOH behandlede kontroller, mens metylering ble redusert til 25% -50% metylering ved behandling med, 2.5 5,0 mikrometer 5′-AZA-dC (figur 2B). I konklusjonen, er det KRT23 transkripsjon uttrykk 5′-AZA-dC induserbare tyder på et potensiale epigenetisk regulering for KRT23.
Lentiviral mediert Stabil knockdown av KRT23 i tykktarmskreft cellelinjer
Som tidlig stadium adenokarsinomer allerede uttrykk for moderate til høye nivåer av KRT23
in vivo product: [14], vi ønsket å vite om uttømming av KRT23 kan påvirke de molekylære og cellulære funksjoner av tykktarmskreftceller. I en første tilnærming, ble lentiviral mediert knockdown av KRT23 påført på den humane koloncancer cellelinje SW480. Fem forskjellige shRNA sekvenser målgruppe KRT23 ble analysert, hvor de mest effektive konstruksjonene var sh-1010 og sh-1506 (figur A på figur S2 i File S1). Transkriptet profilering ved hjelp av U133 2.0plus matriser ble utført på ekstrakter fra SW480 celler som er stabilt transfektert med sh-1506 eller sh-1010, og sammenlignet med kontrollceller som er stabilt transfektert med tom vektor. Konstruer sh-1010 resulterte i 3968 gener forskjellig uttrykt (log2 | 0.5 |) på KRT23 utarming, mens konstruere sh-1506 med en knockdown virkningsgrad på ca 90% resulterte i 7156 gener forandret, herav 3145 (log2 | 0,5 |) mål gener i felles for begge knockdown-konstruksjoner, øket eller redusert i begge analysene i samme retning. Konstruer sh-1506 ble videre brukt til å studere effekten av KRT23 knockdown i tre forskjellige tykktarmskreft cellelinjer.
Expression Profilering av KRT23 utarmet cellelinjer
I en utvidet tilnærming vi brukte tre forskjellige MSS
