Abstract
Tumor utvikling og progresjon blir påvirket av makrofager i det omkringliggende mikromiljøet. For å undersøke påvirkning av en betennelses svulstens mikromiljø på vekst og metastasering av prostata kreft, denne studien brukte en co-kultur modell av prostatakreft (PCA) celler med tumorassosiert makrofag (TAM) -conditioned medium (MCM). MCM markedsføres PCa celle (LNCaP, DU145 og PC-3) vekst, og en xenograft modell i nakne mus konsekvent vist at MCM kunne fremme tumorvekst. MCM også stimulert migrasjon og invasjon
in vitro
. Somatostatin derivat (smsDX) betydelig svekket TAM-stimulert spredning, migrasjon og invasjon av prostatakreft. Immunhistokjemi viste at NF-kB var over-uttrykt ved PCA og BPH med kroniske betennelses vevsprøver og var positivt korrelert med makrofag infiltrasjon. Ytterligere undersøkelse av den underliggende mekanisme vist at NF-kB spilt en viktig rolle i makrofag infiltrering. SmsDX hemmet parakrint sløyfe mellom TAM og PCA celler og kan representere en potensiell terapeutisk middel for PCa
Citation. Guo Z, Xing Z, Cheng X, Fang Z, Jiang C, Su J et al. (2015) Somatostatin derivat (smsDX) Demper TAM-stimulert spredning, migrasjon og invasjon av prostatakreft via NF-kB forordning. PLoS ONE 10 (5): e0124292. doi: 10,1371 /journal.pone.0124292
Academic Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanita, ITALIA
mottatt: 30 august 2014; Godkjent: 12 mars 2015; Publisert: May 26, 2015
Copyright: © 2015 Guo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 30772294). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen som påvirker menn og representerer den nest største årsaken til kreftrelatert dødelighet i den vestlige verden [1]. Flertallet av prostatakreft utvikler seg fra prostata intraepitelial neoplasi gjennom lokalt invasive adenokarsinom til kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) [2], noe som fører til høy dødelighet og lite behandling er effektiv. Til tross for mye forskning, er den indre mekanismen om CRPC fortsatt uklart. Nylig Zhu et al fant at cytokiner, inkludert IL-1β produsert av makrofager bidratt til utviklingen av CRPC [3].
Makrofager er vanligvis den mest tallrike immun populasjon tilstede i tumoren mikro-miljø [4-6 ]. Nylig har to forskjellige tilstander av polariserte makrofager blitt identifisert: den «klassisk» aktivert (M1) og «alternativt» aktivert (M2) makrofager. Og det er nå generelt akseptert at TAM har en M2 fenotype, og kan produsere en serie av cytokiner /chemokiner i den lokale svulsten mikromiljøet som kan være forbundet med promotering av tumorvekst, angiogenese og metastase i prostatakreft [7-10]. Men fortsatt ukjent detaljert mekanisme.
Nuclear faktor-kB (NF-kB) er et medlem av en familie av overalt uttrykt transkripsjonsfaktorer som deltar i betennelser, immunforsvar og onkogenese [11,12]. Det er allment tilstede i de fleste (om ikke alle) celler, innbefattende makrofager. Og det avvikende aktivering har også blitt observert i de fleste svulster. Nylig har flere studier vist at cytokiner (for eksempel IL-1 og TNF) produsert av TAM kunne fremme aktivering av NF-kB [13,14], og fremme tumorcelle-proliferasjon, tumorgenese, migrering og invasjon [15,16]. I tillegg, kan aktivering av NF-kB i makrofager forverre insulin insensitivitet og påvirker glukosemetabolismen, og innebærer i metabolske lidelser omfattende fedme, insulinresistens, type 2 diabetes og aterosklerose [17-19]. Det antas at NF-kB fremmer cellevekst og onkogenese, i det minste delvis, ved å reorganisere metabolske kretser.
Somatostatin (sms) er en sur polypeptid, som er utbredt i hele det sentrale nervesystemet, forskjellig perifer vev og organer. Den har et bredt spekter av biologiske aktiviteter i endokrine, betennelse og tumor. Sms derivat (smsDX) er basert på naturlig sms14, og kan binde seg til alle fem somatostatin reseptorsubtypene (SSTR) [20]. Vår tidligere forskning har funnet smsDX kunne fremme apoptose, undertrykke spredning, migrasjon og invasjon av prostatakreftceller [21]. Og flere studier har vist somatostatin-reseptoren var tilstede i makrofager, sms og dens analoge kunne modulere funksjonen til makrofager [22-24]. Imidlertid fortsatt mekanismen uklart. Somatostatin og dets analoge har blitt rapportert i flere studier for å undertrykke aktiviteten av NF-kB [25,26]. Men om smsDX kan regulere NF-kB i prostata kreft er ukjent.
Denne studien vurderte sammenhengen mellom NF-kB uttrykk og TAM infiltrasjon i prostata cancer (PCA), benign prostatahyperplasi (BPH) og BPH med kroniske betennelser prøver via immunhistokjemi. For å simulere svulsten mikromiljøet, en co-kultur modell av PCA celler (LNCaP, DU145 og PC-3) med TAM-kondisjonert medium (MCM) ble etablert
in vitro
. MCM fremmet spredning, migrasjon og invasjon av PCA celler, og denne simuleringen kan bli hemmet av smsDX. Videre undersøkelser viste at NF-kB spilt en viktig rolle i denne prosessen, og kan være involvert i en autokrint /parakrint sløyfe mellom TAMs og PCA celler. Våre funn tyder på at en inflammatorisk mikro fremmer PCa progresjon, og at smsDX kan representere en hjelpe medikament for prostatakreft på grunn av sin potensielle anti-inflammatorisk rolle.
Resultatene
P65 uttrykket er positivt korrelert med makrofag rekruttering i menneskelige prostata vev
immunoreactive farging for P65 subenhet av NF-kB ble vurdert i prøven av 24 PCA 12 BPH med kronisk betennelse og 33 BPH prøver. Når graden av farging i alle vevsprøver ble kvantifisert på 0-3 + omfanget, observerte vi en gradert økning blant BPH vev, BPH med kronisk inflammasjon prøver, og PCa. Ingen av BPH vev farget som 3+, og 87,8% utstilt 0+ eller 1+ farging. Mengden av flekker i BPH med kroniske betennelser prøvene var middels, med 75% av prøvene som utviser 1+ eller 2+ flekker og 25% stiller 3+. I motsetning til alle de kreft prøver var 2+ til 3+ (37,5 og 62,5%, henholdsvis), som vist i tabell 1. I tillegg ble bare svak P65 farging observert i cytoplasma i BPH vev, P65 farging ble observert i begge cytoplasma og kjernen av tumor og betennelsesceller.
for å vurdere forholdet mellom P65 og makrofag infiltrasjon i menneskelige prostata vev videre, ufargede snitt ble immunolabeled med CD68. Som vist i figur 1, ble CD68-positive celler og P65 koordinert uttrykt ved moderate til høye nivåer i BPH med kronisk betennelse og prostata kreft lesjoner. I motsetning til dette ble minimal CD68-farging observert for BPH. Videre er de fleste av de CD68-positive celler viste morfologiske trekk av makrofager. Derfor P65 ekspresjon var positivt korrelert med makrofag tetthet.
(A) Sterk farging av NF-kB i cytoplasma og cellekjernen av PCa. (B) Moderat infiltrasjon av makrofager ved PCA. (C) Svak farging av NF-kB i cytoplasma og cellekjernen av prostatitt. (D) Høy infiltrasjon av makrofager i kronisk prostatitt. (E) Svak farging av NF-kB i cytoplasma av BPH. (F) Mild infiltrering av makrofager i BPH. Alle bilder er representative bilder.
SmsDX hemmet MCM-forfremmet spredning og koloni dannelsen av prostata kreft celler
For å studere effektene av MCM og smsDX på spredning av PCA celler, LNCaP, DU145 og PC-3-celler ble separat utsatt for MCM og smsDX for 24, 48 og 72 timer i en CCK-8-analyse. Følgelig MCM betydelig fremmet spredning av LNCaP, DU145 og PC-3-celler i en tidsavhengig måte, mens smsDX kan svekke virkningen av MCM på celleformering (figur 2). Levedyktigheten av LNCaP, DU145 og PC-3-celler økte til 51,7%, 44,3% og 57,6%, henholdsvis, etter eksponering for MCM i 72 timer, men levedyktighet ble redusert til 44,8%, henholdsvis 44,1% og 41,6%, ved smsDX behandling.
effekten av MCM og /eller smsDX på celle levedyktighet ble målt via CCK-8 analysen. (A) LNCaP-celler, (B) DU145-celler og (C) PC-3-celler ble ko-dyrket med MCM og /eller behandles med smsDX for 24, 48 og 96 timer. Ko-kultur med MCM vesentlig fremmet proliferasjonen av PCA-celler i en tidsavhengig måte, wheras smsdx kan i det vesentlige svekker denne påvirkningen. (D) Virkning av MCM og smsDX på kolonidannelse. (E) Antallet kolonier, definerte asclusters på minst 50 celler, ble tellet under mikroskop. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, * p 0,05, ** p. 0,01
Vi undersøkte videre effekten av MCM og smsDX på kolonien dannelsen av PCA celler. MCM dramatisk tilrettelagt kolonien dannelsen av LNCaP, DU145 og PC-3 celler. Imidlertid kolonien nummer ble signifikant redusert etter behandling med smsDX som vist i figur 2 (* P 0,05, ** P 0,01).
Effekter av MCM og smsDX på cellemigrering og invasjon
i vitro
Skrape analysene ble utført for å evaluere effektene av MCM og smsDX på migrasjon av PCA celler. Migrasjon mulighetene i LNCaP, DU145 og PC-3 ble markert økt etter co-kultur med MCM i 24 timer (fig 3). For ytterligere å teste påvirkning av MCM og smsDX på celle migrasjon og invasjon, ble transwell analyse utført. Våre resultater viste at antall trekk og invaderende celler som passerer gjennom filteret økes betydelig når makrofager ble dyrket i det nedre kammer (figur 3) (# P 0,05, ## P 0,01). Imidlertid smsDX (10 nM) ble dramatisk inhibere migrering og invasjon av PCA-celler.
(A, C, E) Co-kultur med MCM forbedret cellemigrering av LNCaP, DU145 og PC-3-celler. SmsDX trykt effekten av MCM. (B, D, F) Migrasjons endringen er presentert som prosentandelen av den opprinnelige avstand mellom de to kanter. (G, I, L) Transwell migrering og invasjon assay av LNCaP, DU145 og PC-3-celler behandlet med MCM og /eller smsDX. (H, J, M) The LNCaP, DU145 og PC-3 celler som vellykket migrerte og invaderte ble talt opp. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, * p 0,05, ** p 0,01, # p 0,05, ## p. 0,01
SmsDX hemmer MCM avhengig tumorvekst i en xenograft modell
Etter å demonstrere effekten av smsDX i hemme PCa celle levedyktighet og invasjon
in vitro
, vi undersøkt nærmere sitt potensial antitumor effekt hos mus. PC-3-celler (5 x 10
6) ble injisert subkutant i hver flanke av nakne mus. Behandling med MCM økte den gjennomsnittlige tumorvolumet betydelig. Imidlertid tumorveksten ble hemmet etter behandling med smsDX ved 1 mg /kg /d (figur 4) (* P 0,05, ** P 0,01). Videre ble ingen signifikant toksisitet ble observert i mus behandlet med MCM og smsDX (1 mg /kg /d) som evaluert ved hjelp av vekten til hvert dyr i 3 grupper (Fig 4). For å undersøke uttrykket av NF-kB samt makrofag infiltrasjon
in vivo
, immunhistokjemi ble utført på parafinsnitt av PC-3 tumorxenotransplantater fra nakne mus. NF-kB og CD68 ble sterkt uttrykt i mus behandlet med MCM, og var positivt assosiert med tumorvolum (figur 4).
Bilder av nakne mus (A) og det utskårede tumorer (C) ble tatt fra forskjellige grupper. (B) Kroppsvekt kurve på nakne mus som bærer PC-3-tumorer i forskjellige grupper. (D) grafer som representerer den gjennomsnittlige tumorvolumer av PC-3-xenografter ble behandlet med MCM og /eller smsDX. (E) Korrelasjonen mellom CD68 og NF-kB i PCA tumorxenotransplantater. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, * p 0,05, ** p 0,01
SmsDX hemmer atomtrans og aktivering av NF-kB indusert via makrofag-kondisjonert medium i PCA celler
NF-kB kan representere et kritisk mekanisk kobling mellom betennelse og kreft, og dens avvikende aktivering kan fremme tumorcelle-proliferasjon, tumorgenese, migrering og invasjon [15,16]. Vi først observerte ekspresjon av fosforylert P65, som modulerer NF-kB transkripsjonsaktivitet [27,28]. Som vist i figur 5, ko-kultur med MCM signifikant oppregulert fosforylert P65 i LNCaP-celler, som var sterkest til uttrykk når disse cellene ble inkubert med MCM i 30 minutter. Deretter utforsket vi effekten av smsDX på fosforyleringen av P65. De oppregulert fosforylering nivåer av P65 sekundært til MCM behandling ble effektivt undertrykkes via smsDX i tre PCA-cellelinjer (figur 5).
(A) Konsentrasjonene av fosforylert NF-kB i LNCaP-celler etter eksponering til MCM for forskjellig varighet. (B-D) nivåer phosphory og total NF-kB ble analysert via Western blotting. Kvantifisering av p-NF-kB /NF-kB forholdet ble bestemt via densitometry analyse.
For å vurdere videre effektene av MCM og smsDX på translokasjon av NF-kB, cytosoliske og nukleære proteiner Det ble tatt ut, henholdsvis. Western blot analyse viste at MCM redusert overflod av P65 i cytoplasma av LNCaP-celler (Fig 6). Videre ble det observert økte nivåer av P65 i kjernen (figur 6), noe som indikerer at NF-kB ble aktivert. Imidlertid behandling med smsDX i 24 timer dramatisk inhiberte virkningen av MCM på NF-kB-aktivering. Lignende resultater ble oppnådd i den DU145 (figur 6) og PC-3 cellelinjer (Fig 6). De immunfluorescens Resultatene i figur 7, videre bekreftet at, i likhet med Western blot-analyse, en betydelig økning i den kjernefysiske akkumulering av P65 ble observert etter ko-kultur med MCM i LNCaP-celler, og at smsDX dramatisk inhibert P65 translokasjon. Lignende resultater ble observert i DU145 og PC-3 cellelinjer (figur 7).
(A, C, E) Uttrykket av p65 i cytoplasma ble redusert etter at co-kultur med MCM, smsDX dempes dette effekt i LNCaP, DU145 og PC-3 celler. A-tubulin ble valgt som cytosolprotein lasting kontroll. (B, D, F) Co-kultur med MCM økt ekspresjon av p65 kjernefysiske, og behandling med smsDX svekket effekten av MCM. Histoner ble valgt som kjernefysisk protein lasting kontroll. Kvantifisering av den C-p65 /a-tubulin og N-p65 /histon-forholdet ble utført som densitometri analyse.
(A) Co-kultur med MCM vesentlig fremmet atom akkumulering av p65 i LNCaP celler. Behandling med smsDX hemmet p65 kjernefysisk translokasjon. (B og C) Dette uttrykk og translokasjon av p65 etter eksponering for MCM og behandling med smsDX i DU145 og PC-3-celler, henholdsvis, ble analysert via immunofluorescens.
diskusjon
tilstedeværelsen av leukocytter i løpet av svulster ble først observert i det 19. århundre av Rudolf Virchow, denne observasjonen ga den første indikasjon på en sammenheng mellom betennelse og kreft [29]. Epidemiologiske studier har nylig vist at makrofager representerer en viktig del av verts leukocytt infiltrere i de fleste av ondartede svulster [30]. Men infiltrerer den kliniske betydningen av TAM i prostata kreft er fortsatt kontroversielt. Kiran el al rapporterte at det midlere antall TAMs var høyere i prostata cancer enn i benign vev [31], mens Norio et al rapporterte det motsatte resultat [32]. I denne studien, observerte vi økt makrofag infiltrasjon i prostatakreft og BPH med kronisk betennelse sammenlignet med godartet vev. Økt TAM infiltrasjon har også blitt rapportert å være assosiert med dårlig PCa progresjon [33]. Derfor kan TAMs representere en potensiell prediktor for prostatakreft. Noen tidligere studier har også vist at M2-polariserte THP-1 makrofager kan fremme tumorvekst, invasjon og metastase [34,35]. I denne studien fant vi at TAM-lignende M2-type makrofager økt migrasjon og invasjon av prostatakreftceller. I tillegg MCM fremmet tumorigenisitet av PC-3-celler i en xenograft modell i nakne mus. Videre administrasjonen av smsDX dempet den trekkfugl og invasiv potensialet i prostatakreftceller som ble stimulert av M2-type makrofager.
Vi observerte også at NF-kB uttrykk ved PCA og BPH med kroniske betennelser prøvene var betydelig høyere enn det i BPH, ble dette uttrykket positivt korrelert med makrofag infiltrering. Derfor har vi fokusert på rollen av NF-kB i denne prosessen. Nukleær faktor-kB (NF-kB) er en induserbar dimer transkripsjonsfaktor som tilhører Rel /NF-kB familie. Den over-ekspresjon av gener som koder for rela /NF-kB faktorer har blitt observert i mange tumorer [36-39], og den feilregulering av NF-kB er antatt å fremme celleproliferasjon, motilitet, invasjon og metastase i de fleste tumorer inkludert prostata kreft [40,41]. NF-kB er ansett for å være en stor molekylær produsent av inflammasjon og kan fremme immunitet ved å kontrollere ekspresjonen av gener som er involvert i inflammasjon [42]. Denne studien viste at makrofager aktiveres NF-kB ved PCA. Dette førte til utviklingen av prostata kreft celler etter co-kultur med MCM. I svulsten mikromiljøet, kunne cytokiner fra TAMs aktivere NF-kB i tumorceller, og dermed fremme tumorigenesis. Tumorceller i sin tur å uttrykke CSF-1, og kan ytterligere stimulere og rekruttering av makrofager [43]. Derfor er det en parakrin sløyfe innenfor TAM-forbedret tumorprogresjon. Og NF-kB spiller en viktig rolle i handlingen i denne sløyfen.
Somatostatin og dets analoger er nevroendokrine hormoner og representerer viktige formidlere mellom nerve- og immunsystemet. Vår og andre grupper har funnet at disse hormonene kan hemme proliferasjonen og invasjon av flere tumortyper [21,44]. I den senere tid har betydelige eksperimentelle data har vist at SMS-analoger utviser anti-inflammatorisk aktivitet på grunn av deres hemmende virkning på sekresjonen av TNF-α, IL-8 og IL-1β [45,46]. Men til vår beste kunnskap, har det ikke vært noen studier på effekten av SMS-analoger på uttrykket av NF-kB og biologisk oppførsel av PCA celler i en inflammatorisk mikromiljø. I denne studien fant vi at smsDX vesentlig svekket makrofag-mediert stimulering av PCa celleproliferasjon og invasjon ved å hemme uttrykket og aktiviteten av NF-kB
in vitro Hotell og
in vivo
. Somatostatin reseptorsubtypene 1 og 2 er påvist i humane makrofager [22], og immunoreactive somatostatin har blitt oppdaget i cytoplasma av makrofager. Derfor spekulere vi at smsDX kunne binde med SSTR1- eller to på overflaten av makrofager og bryte den parakrine sløyfen mellom tumoren og det inflammatoriske mikromiljøet, for derved å lette den makrofag-stimulerte utviklingen av PCa.
Nylig, metabolske sykdommer inkludert fedme, type 2 diabetes, og aterosklerose er histologisk sett på som kronisk lavgradig betennelse med betydelig makrofagin [47,48]. Makrofager har blitt observert å være i umiddelbar nærhet med metabolske celler og ble observert å ha en utstrakt transkripsjonen signatur som reguleres metabolismen av adipocytessuch som pyruvat karboksylase, PPAR-γ, apolipoprotein C1, etc [18]. Hos overvektige individer, kan energioverskudd eller produkter fra makrofager aktiverer NF-kB, ytterligere utløser makrofag rekruttering, aktivering og initiering og opprettholdelse av en inflammatorisk reaksjon som til slutt resulterer i insulinresistens [18]. I tillegg til å forverre perifer insulin insensitivitet, kan NF-kB også påvirke glukosemetabolismen og mitokondriell respirasjon, som er viktig for cellevekst og onkogenese [49]. Vår tidligere studie rapporterte at smsDX kan påvirke cellenes stoffskifte og mitokondrienes funksjon av PCA celler. Derfor spekulere vi at smsDX kan svekke virkningen av MCM på PCA-celler via virkning på cellemetabolismen i tillegg til anti-inflammasjon.
Til sammen vår undersøkelse viser at TAM kan fremme utvikling og progresjon av PCa, og at smsDX demper denne effekten ved å nedregulere NF-kB. Disse resultatene indikerer at smsDX kan være et lovende terapeutisk legemiddel for pasienter med prostatakreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle menneskelige prøvene ble oppnådd i løpet av terapeutisk kirurgi. Denne studien ble utført ved hjelp av prøvene over hyllene etter den patologiske diagnose. Vi ringte alle pasienter og fått muntlig informert samtykke. Dette er spesielt godkjent av Qilu Hospital komité Shandonguniversitetet for menneskeeksperimenter. Alle dyr omsorg og eksperimentelle protokoller holdt Animal Ledelse Regler for Helsedepartementet av Folkerepublikken Kina (Dokument nr 55, 2001). Alle dyrene ble opprettholdt på Key Laboratory of Cardiovascular Ombygging og funksjon Forskning ved Qilu Hospital of Shandong University. Denne studien ble godkjent av Qilu Hospital komité Shandonguniversitetet for menneske Eksperimenter og av Animal Care komité Shandong University.
Pasienter og prøver
I alt 24 pasienter diagnostisert med PCa og 45 pasienter diagnostisert med BPH behandlet ved Institutt for Urologi kirurgi, ble Qilu Hospital of Shandong University mellom oktober 2010 og juli 2012 deltok i denne studien. Dertil, seksten av PCA pasientene gjennomgikk transrectal prostatabiopsi, og 8 pasienter gjennomgikk transurethral reseksjon av prostata. Tolv av 45 prostatahyperplasi (BPH) pasienter godartede ble diagnostisert med histologisk kronisk prostatabetennelse. De kliniske parametre og patologiske klassifikasjoner blir presentert og oppsummert i tabell 1. Ingen av pasientene hadde fått preoperativ adjuvant behandling. Diagnosen av hvert tilfelle ble bekreftet ved to patologer.
PCA-cellelinjer og cellekultur
Humant PCA-cellelinjer (LNCaP, DU145 og PC-3) og THP-1-celler ble kjøpt fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences. Alle celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone, Logan, UT) inneholdende 10% føtalt kalveserum ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Fordi TAM representerer en distinkt M2-polarisert makrofag befolkning [50], THP-1 monocytter ble differensiert til makrofager i RPMI-medium inneholdende 5 ng /ml forbol 12-myristat 13-acetat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) for 48 timer i henhold til tidligere etablerte protokoller [51]. Deretter kultursupernatanter ble filter-sterilisert og lagret ved -20 ° C inntil de er klare for bruk.
Immunhistokjemisk analyse
Immunhistokjemi ble utført som beskrevet tidligere [52]. I korthet parafininnstøpte vev ble deparaffinized og vannes ut. Etter antigen gjenfinning, ble alle prøver utsatt for primært antistoff (CD68 01:50, P65 1: 100) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) over natten ved 4 ° C, og deretter inkubert med biotin-konjugerte sekundære antistoffer i 30 min ved 37 ° C, fulgt av avidin-biotinylert peroksidasekompleks i 20 minutter ved 37 ° C. Farging ble henrettet med 3,3N-diaminobenzidin tertrahydrochloride og haematin. Protein Ekspresjonsnivået ble bestemt i henhold til den prosent av positivt fargede tumorceller og fargeintensitet ved to patologer som tidligere beskrevet [53]. I korthet, ble prosentandelen av positiv farging scoret som 0 (0-9%, negativ), 1 (10% -25%, sporadiske), 2 (26% -50%, fokal) eller 3 (51% -100%, diffus), og intensiteten som 0 (ingen farging), 1 (svak farging, synlig ved høy forstørrelse), 2 (moderat farging, synlig ved lav forstørrelse) og 3 (mørke flekker, påfallende positiv ved lav forstørrelse). Den totale farging poengsum ble beregnet med verdien av prosent positivitet poengsum × fargeintensitet poengsum, som varierte fra 0 til 9. protein uttrykk nivået ble definert som følgende: «0+» (negativ, 0 poeng), «1+» ( svakt positive, score 1-3), «2+» (positiv, score 4-6), og «3+» (sterkt positiv, score7-9).
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble bestemt via CCK8 analysen. I korthet, LNCaP (6 x 10
3 celler /brønn), DU145 (4 x 10
3 celler /brønn) og PC-3 (4 x 10
3 celler /brønn) celler i 200 ul medium ble sådd ut i 96-brønners plater. Etter 12 timer for etterlevelse ble mediet erstattet med kondisjonert medium fra makrofager med /uten smsDX (10 nM). Etter 24-72 timer, ble de dyrkede celler ble behandlet med 20 ul av celletellings kit-8 (Dojindo, Japan) og inkubert ved 37 ° C i ytterligere 4 timer i henhold til instruksjonene fra fremstillingen. Absorbansen ble bestemt ved 450 nm.
klonedannelsen assay
LNCaP, DU145 og PC-3-celler ved en tetthet på 1 x 10
3-celler /brønn ble sådd ut i 6- brønners plater. Etter inkubering over natten kondisjonert medium med /uten smsDX (10 nM) ble tilsatt til mediet, og cellene ble inkubert ved 5% CO
2 og 37 ° C i to til tre uker. Når synlige kloner dannet på platene, ble cellene vasket klonene med PBS og fiksert med på forhånd avkjølt metanol, og farget med 0,1% krystallfiolett i 20 min. Koloniene som inneholdt mer enn 50 celler ble tellet under et mikroskop. Klone dannelsen rate = (klone nummer /antall celle inokulasjon) × 100%.
In vitro
scratch analysen
PCA-celler ble sådd i 24-brønns plater. Etter inkubering i 24 timer ble hver brønn manuelt ripet med en 200 ul pipette, vasket med PBS tre ganger og inkubert med kondisjonert medium med /uten 10 nM smsDX. Bilder ble tatt igjen etter 24 timer. Avstanden mellom to cellekantene ble analysert ved hjelp av ImageJ programvare.
Transwell invasjon assay
Transwell invasjon-analyse ble utført som beskrevet tidligere [54]. I korthet ble et total av 5 x 10
4 celler suspendert i 100 ul serumfritt medium ble tilsatt til de øvre kamrene i transwellsystemet (24 brønner, 8 mm porestørrelse, Corning Costar, Lowell, MA, USA) belagt med 2 mg /ml Matrigel (BD Biosciences). TAM-kondisjonert medium med /uten 10 nM smsDX ble deretter tilsatt til det nedre kammer. Etter 24 timer ble de ikke-invaderte celler i det øvre kammer forsiktig fjernet med en bomullspinne, mens cellene som knytter seg til den nedre overflate ble fiksert med på forhånd avkjølt metanol og farget med 1% eosin. Minst ti felt av hvert kammer ble tilfeldig valgt ut og cellene ble tellet under mikroskop.
For migrering analysen ble cellene sådd ut i de øvre kamrene uten belagt Matrigel. Resten av analysen ble utført som den Transwell invasjon analysen. Etter 24 timer ble cellene på undersiden også telles i minst ti tilfeldig felt, da celletallet ble analysert statistisk.
immunfluorescens analysen
PCA celler ble sådd ut på fibronektin-belagt glass Dekk. Etter 24 timer inkubering ble cellene vasket med PBS, fiksert i på forhånd avkjølte metanol, og permeabilisert med 0,2% Triton X-100. De fikserte celler ble preinkubert i 1,5% normalt geiteserum og videre inkubert over natten med et primært antistoff mot P65 (1: 100 fortynning) ved 4 ° C. Etter inkubering med fluorescein-konjugert geit-anti-kanin-IgG-antistoff ved 37 ° C, Dekkglass ble montert på objektglass med PermaFluor Vandig. Fluorescens ble observert ved hjelp av en Zeiss Axioplan Universal mikroskop.
Western blotting
Cellene ble lysert i RIPA buffer som inneholder 1% proteasehemmere. For å isolere cytoplasmatiske komponenten fra atom en, ble PCA celler behandlet med et kjernefysisk protein utvinning kit (Beyotime Biotechnology, Wuhan, Kina) og sentrifugert ved 3400 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. De cytoplasmatiske og nukleære komponenter ble deretter underkastet Western blotting. Like mengder av proteiner fra hver prøve ble separert via SDS-PAGE og overført på en PVDF-membran ved hjelp av en våt overføringsapparat (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i 2 timer ved romtemperatur og inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Membranene ble deretter utsatt for pepperrotperoxydase-merkede sekundære antistoff (1: 2000) i 1 time ved romtemperatur, og reaktivitet ble påvist ved anvendelse av et forbedret kjemiluminescens påvisningssystem (Amersham, Pittsburg, PA). Proteinnivåer ble analysert ved hjelp av ImageJ programvare.
tumor xenograft modell
patogenfrie 4-5 uker gamle BALB /c nakne mus (som veide 19 ± 2 g, SPF karakter, sertifikat SCXK2011 -0012) ble kjøpt fra Institutt for laboratorie Animal Science ved Peking University (Beijing, Kina). En total av 5 x 10
6 av PC-3-celler ble samlet opp, blandet med Matrigel og injisert subkutant i flanken av nakne mus. Musene ble tilfeldig inndelt i tre grupper (5 pr gruppe). Musene ble gitt av MCM med eller uten smsDX i en dose på 1 mg /kg /dag via intraperitoneal injeksjon i 4 uker med ukentlig overvåking av tumorstørrelse og kroppsvekt, mens kontrollmus ble gitt det samme volum av fysiologisk saltvann. Alle mus ble avlivet ved hjelp av natriumpentobarbital 8 uker etter inokulering med kreftceller, og tumorene ble oppsamlet.
Statistisk analyse
Data er for det meste presentert som gjennomsnitt ± SD. SPSS programvarepakke (versjon 13,0; SPSS, Chicago, IL) ble anvendt for alle statistisk analyse. Signifikante forskjeller mellom behandlings- og kontroll verdier ble analysert ved anvendelse av Students tohalede t-test eller en-veis analyse av varians der det er hensiktsmessig. Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant når p 0,05. Hver variabel ble testet to ganger, og forsøket ble gjentatt tre ganger.
Takk
American Journal Eksperter redigere dette manuskriptet.
