Abstract
Lung adenokarsinom, den vanligste undertype av lunge kreft, er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Til tross for forsøk for behandling av lungekreft som har vært samler, er lovende nye terapier fortsatt nødvendig. Her fant vi at syklisk-AMP responselement-bindende protein (CREB) -CREB bindende protein (CBP) transkripsjonsfaktorer kompleks inhibitor, Naphthol AS-TR fosfat (NASTRp), er en potensiell terapeutisk middel for lungekreft. Vi viser at NASTRp hemmet onkogene celle egenskaper gjennom cellesyklus arrest med samtidig undertrykkelse av tumor-fremme autofagi med ned-forskrifter Atg5-12 og Atg7, og akkumulering av p62 i human lunge kreft cellelinjer. I tillegg NASTRp indusert uttrykk for endoplasmatisk retikulum stress-markører som DDIT3 /CHOP, og førte til apoptose sammen med Bim induksjon. Disse funnene tyder på at transkripsjonsfaktor /co-aktivator kompleks, CREB-CBP, kan være en potensiell terapeutisk mål og dens hemming kan være en roman terapeutisk strategi for lungekreft
Citation. Lee JW, Park HS, Park SA, Ryu SH, Meng W, Jürgensmeier JM et al. (2015) A Novel Small-Molecule Inhibitor Targeting CREB-CBP Complex Innehar anti-kreft effekter sammen med Cell Cycle forordning, Autophagy Suppression og endoplasmatiske retikulum stress. PLoS ONE 10 (4): e0122628. doi: 10,1371 /journal.pone.0122628
Academic Redaktør: Hyun-Sung Lee, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 17 juli 2014; Godkjent: 23 februar 2015; Publisert: 21 april 2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute stipend R01-CA126801 (JSK), en Pilot Grant fra Yale Comprehensive Cancer Center (JSK), og National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA-16359 (til Yale Comprehensive Cancer Center)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de viktigste årsakene til kreft dødelighet over hele verden, og det er anslått at 159 480 lungekreftpasienter vil dø i USA i 2013 [1]. Omtrent 25% av lungekreft adenokarsinomer, en dominerende formen for lungekreft havn onkogene
KRAS
mutasjoner, og dette utgjør en betydelig terapeutisk utfordring, som
KRAS
mutasjoner er vanligvis forbundet med dårlig prognose og motstand mot kjemoterapi [2, 3]. Direkte farmakologiske målretting av aktivert KRAS mutant protein har vært mislykket så langt, og dermed alternative tilnærminger til å blokkere KRAS aktivering signalveien blir vurdert. Spesielt, driver mutant KRAS aktivering av syklisk-AMP responselement-binding (CREB) gjennom RAF /MEK /ERK signalveien for å tvinge kreft celle vekst og overlevelse. Således kan man mulighet for å hemme veksten av KRAS-mutant tumorer være å målrette transkripsjonsfaktorer (f.eks CREB), som ofte er den endelige regulator av flere signaleringsprosesser, og kan potensielt bli målrettet uavhengig av forandringer av oppstrøms signaliserings komponentene som er involvert i kreftutvikling, progresjon og invasjon /metastasering.
CREB er en kritisk transkripsjonsfaktor involvert i normal homeostase [4-6], metabolisme [7], hukommelses /lære [8], flere krefttyper [9-12] og immun-sykdommer [1. 3]. Våre tidligere studier viste at CREB er sterkt oppregulert og hyperfosforylert i de fleste av de ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) vevsprøver, og at denne oppregulering er signifikant assosiert med dårlig overlevelse [10-12]. CREB er fosforylert ved serin /treoninresiduer, avhengig av de stimuli fra ekstracellulære komponenter og flere oppstrøms kinaser. Aktivert /fosforylert CREB rekrutterer sin transkripsjon co-aktivator, CREB-bindende protein (CBP) til en cAMP respons element (CRE) region av målgener [14]. Denne rekrutteringen av CBP er et kritisk punkt for transkripsjonen aktivering av CREB [15]. Derfor blokkerer interaksjonen mellom CREB-CBP kan være en metode for å hemme CREB transkripsjonen aktivitet. Faktisk, identifisering av små molekyl hemmere forstyrrer dannelsen av CREB-CBP komplekse gjennom målretting KID og KIX domener av CREB og CBP, henholdsvis, er rapportert ved bruk av en NMR screening tilnærming [16]. I tillegg har vi tidligere har vist at en av disse inhibitorene, 2-naftol-AS-E fosfat (KG-501), som direkte rettet mot det KIX domene av CBP, resulterte i en forstyrret CREB-CBP kompleks, hemmet CREB-målgenet induksjon og hemmet IL-1β-mediert angiogen aktivitet i NSCLC [10].
med sikte på å forbedre terapeutiske forsøk for lungekreft husing KRAS mutant, fant vi en multifunksjonell transkripsjonsfaktor inhibitor heter Naphthol AS-TR fosfat (NASTRp), rettet mot CREB-CBP kompleks, som en potent anti-kreft agent for lungekreft. Kollektivt, NASTRp viste tydelig effekt på flere biologiske analyser og kan og vil være en potensiell terapeutisk tilnærming for kreft hos mennesker, spesielt for lungekreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
human lunge-cancercellelinjer, A549, NCI-H1734, NCI-H1792, NCI-H441, NCI-H23, NCI-H1975 og NCI-H520-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) . Normale human epitelial tracheobronchial (NHTBE) celler ble oppnådd fra Lonza (Walkersville, MD, USA). Cellelinjer ble passert for mindre enn 6 måneder etter gjenoppliving og ble ikke godkjent. Alle kreftcellelinjer ble holdt under 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI-1640-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 1% antibiotikum-Anti-fungal (Anti-Anti, Life Technologies). NHTBE celler ble dyrket i BEBM supplert med vekstfaktorer og hormoner som tilbys av manufactory (Lonza), og tre-demensional organotypiske luft-væske-grenseflate (ALI) cellekultur-metoden ble anvendt for NHTBE cellekultur, som beskrevet tidligere [5, 17-19 ]. HEK293T celler ble holdt i DMEM-medium supplert med 10% FBS og 1% Anti-anti.
proliferasjon, kolonidannelse og myk-agar-assays
celler ble sådd i 96-brønners plater ved 2 x 10
3 celler /brønn med RPMI-1640 medium supplert med 5% varmeinaktivert FBS og uten anti-anti. Cellene ble behandlet med Naphthol AS-TR fosfat dinatriumsalter (NASTRp, Sigma-Aldrich, N6125) som 0-80 mikromol /L i 96 timer. Celleproliferasjon ble målt med MTT eller CellTiter Glo lysende celleviabilitet analysen (Promega, Madison, WI, USA). Celleviabilitet av bærer-behandlede celler ble satt til 100% av proliferasjon. For kolonidannelse analysen ble cellene sådd ut i 6-brønners plater på 1 x 10
3 celler /brønn. Celler ble behandlet med NASTRp som 0, 5, 10 og 20 pmol /l og ble skiftet med friskt medium inneholdende NASTRp annenhver dag i 10-17 dager, på hvilket tidspunkt 0,1% (vekt /volum) krystallfiolett (Thermo Scientific, NJ , USA) ble anvendt for å visualisere kolonier. Myk-agar assay ble utført som beskrevet tidligere [12]. I korthet kolonier ble farget med p-iodonitrotetrazolium fiolett (Sigma-Aldrich) for å velge levende kolonier og deretter, farget Koloniene ble telt ved hjelp av Image J programvare (NIH, USA). En koloni ble definert som noe som inneholder mer enn 10 celler, som indikert 50 piksler i bilde J.
Kvantitativ revers transkripsjon-PCR
QRT-PCR-analyse ble utført som beskrevet tidligere [11 ]. I korte trekk, ble Total RNA renset fra celler ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Revers transkripsjon av totalt RNA ble utført ved anvendelse av MMLV revers transkriptase (Promega). Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn PCR kjerne Reagenser (Applied Biosystems, Life Technologies). Alle primere ble kjøpt fra Keck (New Haven, CT, USA). Alle reaksjoner ble utført in triplo og ribosomale protein L32 cDNA-nivåer ble anvendt som en endogen kontroll. Primersekvensene som brukes i QRT-PCR var som følger: syklin A2; framover; 5′-CCAAGAGGACCAGGAGAATA-3 «, omvendt; 5»-CGGTGACATGCTCATCATT-3 «, cyklin B1; framover; 5»-AGTCACCAGGAACTC GAAAA-3 «, omvendt; 5»-GTTACCAATGTCCCCAAGAG-3 «, Cyclin D1; framover; 5»-CTTC AAATGTGTGCAGAAGG-3 «, omvendt; 5»-AGCGGTCCAGGTAGTTCAT-3 «; Cyclin E2; framover; 5»-AGAGAGGAGGTCACCAAGAAA-3 «, omvendt; 5»-CAGGCAAAGGTGAAGGAT TA-3 «, GRP78; framover; 5»-CACAGTGGTGCCTACCAAGA-3 «, omvendt; 5’TGTCTTTTGTC AGGGGTCTTT-3 «, CHOP; framover; 5»-AGCCAAAATCAGAGCTGGAA-3 «, omvendt; 5»-TGG ATCAGTCTGGAAAAGCA-3 «, IRE1; framover; 5»-CTCTGTCCGTACCGCCC-3 «, omvendt; 5’GAAGCGTCACTGTGCTGGT-3 «, Perk; framover; 5»-TCATCCAGCCTTAGCAAACC-3 «, omvendt; 5»-ATGCTTTCACGGTCTTGGTC-3 «, ATF6; framover; 5»-GCAGAAGGGGAGACAC attt-3 «, omvendt; 5»-TTGACATTTTTGGTCTTGTGG-3 «, XBP1; framover; 5»-CGAATGAG TGAGCTGGAACA-3 «, omvendt; 5»-GGCCATGAGTTTTCTCTCGT-3 «, L32; framover; 5»-CAC CAGTCAGACCGATATGT-3 «, omvendt; 5»-ACGTTGTGGACC AGGAACT-3 «. The real-time PCR analyse av data ble utført ved hjelp av sammenlignende terskel syklus (Ct) metode iCycler termosykler analysator program (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Database forberedelse, søking og molekylær docking modellering
Alle modellering beregninger ble gjennomført på en fire-prosessor MIPS R16000 Silicon Graphics Tezro kjører Sybyl 7,1 modellering suite. De strukturelle databaser som inneholder over 600.000 strukturer som består av tilgjengelige forbindelser fra nesten 50 kommersielle leverandører av kjemiske databaser [20]. Sammensatte bibliotekene ble mottatt i SDF filformatet [21] og en todimensjonal likhet søk ble kjørt på hver database benytte søkefunksjonen DB. De resulterende hitlistene ble kombinert sammen til et felles trefflisten av tredimensjonale (3D) SLNs. Den DBslnfilter ble brukt til å filtrere ut strukturer som inneholder de følgende egenskaper: blandinger, metaller, isotoper, ingen 3D-koordinatene, MW 100, eller MW 500. Trefflisten manager ble brukt for å eliminere alle forbindelser unntatt de som inneholder karboksylater, fosfater og sulfonamider. KIX domene koordinater ble oppnådd ved å ta gjennomsnittet av NMR strukturer av KIX domene (PDB ID: IKDX). KIX og NASTRp koordinere ble generert ved hjelp phenix.elbow [22]. Dokking beregninger ble utført ved å bruke HEX 6.3 [23]. Korrelasjonen type som brukes i docking er «Shape + Electrostatistics». Forbindelsen Likheten screening ble utført ved hjelp av pubchem Compounds.
Strømningscytometrisk analyse og apoptose assay
Strømningscytometri og TUNEL-analyser ble utført som tidligere beskrevet [12]. NCI-H441 human lunge adenokarsinom celler ble behandlet med NASTRp fulgt farging med PI /RNase flekker buffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Cellesyklus distribusjon ble analysert ved BD LSRII Flowcytometer (BD Biosciences) og FlowJo programvare (Treestar, Ashland, OR, USA). For TUNEL analysen, ble A549 human lunge adenokarcinomceller behandlet med NASTRp i 48 timer og fulgte farging med ApopTag Fluorescein direkte In Situ apoptose Detection Kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Immunobloting, co-immunoutfellingsstudier og immunfluorescens assays
Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) og western-blotting ble utført for å analysere ekspresjon av forskjellige proteiner. Cellelysater ble lysert ved RIPA-lysebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,1% SDS, 1% natriumdeoksykolat, 1% NP-40) supplert med Complete EDTA -fri protease og fosfatase hemmere cocktails (Roche, South San Francisco, CA, USA) og utsatt for immunblotting ved hjelp av ulike antistoffer. De følgende antistoffer ble anvendt: anti-Cyclin A2 (# 4656), anti-cyklin B1 (# 4138), anti-cyclin E2 (# 4132), anti-LC3B (# 3868), anti-ATG7 (# 8558), anti -ATG5 (# 12994), anti-GRP78 /Bip (# 3177), anti-Caspase 3 (# 9665), anti-spaltet Caspase 3 (# 9579), anti-Phospho-CREB (S133; # 9198) og anti- Bim (# 2933) fra Cell Signaling Technology, anti-Cyclin D1 fra Epitomics (# 2261-1, Burlingame, CA, USA), anti-p62 /SQSTM1 fra Amerika Forsknings Produkter (03-GP62-C, Waltham, MA, USA ), anti-CHOP fra Novus Biologicals (NBP2-13172, Littleton, CO, USA), anti-β-aktin og anti-FLAG fra Sigma-Aldrich (A2228). For co-immunoutfelling analysen HEK293T celler ble ko-transfektert med pcDNA3-HA-KIX (CBP, aminosyrer 586-666) og pcDNA3-Myc-KID (CREB, aminosyrer 87-146 fra transkripsjon variant A) ved hjelp Lipofectamine 2000 ( life Technologies). 48 timer etter transfeksjon, ble cellene forbehandlet med NASTRp i 3 timer etter 10 uM forskolin (Sigma-Aldrich) administrering i ytterligere 1 time. Cellelysater ble fremstilt med IP-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10% glycerol, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100) supplert med fullstendig EDTA-fri protease og fosfatase hemmere cocktails. Forhånds rengjøres lysatene ble utsatt for immunoutfelling hjelp av anti-HA mus monoklonalt antistoff (MMS-101P, Covance, Princeton, NJ, USA) med konjugert protein A /G PLUS-agarose (sc-2003, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Ved hjelp av Flag-CREB1 stabilt uttrykker 293T-celler, ble disse stabile celler transfektert med pcDNA3-HA-KIX, etterfulgt behandlinger av forskolin eller NASTRp som beskrevet ovenfor. Immunkomplekser av rullegardin med anti-fosfo-CREB-antistoff ble underkastet SDS-PAGE og western blot. For immunofluorescens-analysen, ble A549 humane lunge adenokarsinom-cellelinjer behandlet med de angitte konsentrasjoner i 24 timer og fulgt fiksering med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Fikserte celler ble permeabilisert med 50 mg /ml digitonin i PBS (D141, Sigma-Aldrich) i ytterligere 10 min. Blokkerte celler med 3% bovint serum albumin (BSA, A9647, Sigma-Aldrich) ble undersøkt med primære antistoffer og fulgte konjugering med Alexa Fluor 488 og 568 esel anti-kanin IgG antistoffer (Life Technologies), for p62 /SQSTM1 og CHOP, henholdsvis . Fargede celler ble montert med Forleng Gold Antifade Reagens med DAPI (Life Technologies) og fulgte observasjon under fluorescens mikroskop (Olympus America Co, Center Valley, PA, USA).
Kaplan-Meier plott analyse
for å analysere sammenhengen mellom pasient overlevelse i lunge adenokarsinom og uttrykk for autofagi protein, for eksempel ATG7 (Affymetrix ID: 218670_s_at), ATG5 (210639_s_at) eller p62 /SQSTM1 (201471_s_at), vedtok vi databasene resultatene fra Kaplan-Meier Plotter (https://www.kmplot.com) [24] med kriteriene; (1) total overlevelse (OS), (2) split-pasienter ved median, (3) oppfølging terskel som 9, (4) histologi som adenokarsinom, (5) Cox regresjon som uni-varians og (6) matrise kvalitetskontroll ekskludert partisk arrays.
Statistiske analyser
Hver forsøket ble gjentatt minst tre uavhengige ganger. For generering av grafer og statistiske analyser, ble Graph Pad Prism programvare (v.6) brukes.
P
verdier mellom grupper ble bestemt av en to-haler uparede Student
t
tester.
Resultater
Identifikasjon av naphthol analoger som CREB-CBP transkripsjon faktor /co-aktivator komplekse hemmere
Vi har tidligere vist at CREB er en kritisk transkripsjonsfaktor i utviklingen av lungekreft gjennom sitt engasjement i celleoverlevelse, cellecyklusprogresjonen, spredning og apoptose regulering [5, 6, 10- 12]. Vi først foreslått at CREB kan være et molekylært mål for forebyggelse og behandling av NSCLC [11]. Faktisk viste vi at CREB regulerer IL-1 p-regulert CXC kjemokiner, kritiske for cellemigrering og angiogenese i NSCLC ved hjelp av KG-501 [10]. Dermed disse studiene føre til begrunnelsen for identifisering av lavmolekylære inhibitorer som målretter CREB transkripsjonen aktivitet beskrevet i denne studien. For å identifisere bedre forbindelser, vi først valgt totalt 4,547 forbindelser, som besto av en to-dimensjonal likhet cutoff på 80% ved hjelp av KG-501 struktur som en spørring. Siden fosfat i KG-501 struktur ble ansett for å være et viktig element ved lease en del, for løselighet, utvalget ble deretter ytterligere raffinert for å sikre forbindelsene inneholdt gruppene anses å være ekvivalent med fosfat og dette resulterte i en 67 kandidatforbindelser. Av disse har vi identifisert 6 forbindelser naphthol analoger som har anti-kreft effekt, som vist figur 1A.
(A) Kjemiske strukturer av s_elected naphthol analoger. (B) Hemmende effekt av naphthol analoger på cellevekst i NCI-H1734 lunge adenokarsinom-cellelinje. Cellelevedyktighet ved 96 timer etter behandling ble målt ved MTT-analyse med absorbans ved 590 nm. Eksperimentene ble triplicated og gjentatt minst tre ganger.
å bestemme hvorvidt kandidatforbindelser har anti-kreft effekt, human lunge adenokarsinom-cellelinje, NCI-H1734, ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av seks utvalgte forbindelser. Alle forbindelser viste inhibitorisk virkning på celleformering som antydet med IC50s (figur 1B). Av disse NASTRp var den mest potente forbindelsen i disse spredningsanalyser som vist. IC50 = 3,701 mikromol /L
neste gjennomførte dokking simulering og beregning ved hjelp NASTRp og KIX domene av CBP som ligand og reseptor, henholdsvis . Resultatet viser at NASTRp er nær Arg-600 av KIX domenet av CBP, en kritisk rest for CREB-CBP interaksjon, i samsvar med KG-501 (S1 A Fig, ref. [17]). Vi videre observert at NASTRp fullstendig avskaffet ikke bare samspillet mellom KIX og KID i kotransfiserte HEK293T celler, men også samspillet mellom fosforylert helaftens CREB og KIX i Flag-merket CREB stabilt uttrykker 293T cellsby co-immunoutfellingsstudier analyser (S1B og S1C fig). Derfor NASTRp ble valgt og undersøkt i flere biologiske analysene beskrevet i denne artikkelen.
Anti-kreft effekt av NASTRp i human lunge kreft cellelinjer
For å bestemme anti-kreft effiect av NASTRp, flere lungecancercellelinjer ble valgt for celleproliferasjonsanalyse. Utgangspunktet valgte celler husing
KRAS
mutasjoner; A549 (KRAS-G12S), NCI-H1792 (KRAS-G12C), NCI-H441 (KRAS-G12V), og NCI-H1734 (KRAS-G13C). For å bestemme den hemmende virkning på celleformering ble hver cellelinje utsatt for forskjellige doser av NASTRp. I samsvar med den anti-proliferative effekt av NASTRp i NCI-H1734-celler, som vist i figur 2A, NASTRp dramatisk undertrykkes celleformering i alle lungecancer-cellelinjer med
KRAS
-mutasjoner som ble undersøkt (IC50 = A549, 3,574 mikrometer; NCI-H1792, 11,769 mikrometer; NCI-H441, 11,074 mikrometer; NCI-H1734, 4,025 mm). Gitt potent hemmende effekt på celleproliferasjon av NASTRp utvidet vi lungekreftceller til lungekreftcellelinjer som bærer
EGFR
mutasjoner, NCI-H1975 (EGFR-L858R /T790M) og plateepitelkarsinom med sterkt uttrykker FGFR og CREB, NCI-H520 (IC50 = NCI-H1975, 8,891 mikrometer; NCI-H520, 4,363 mikrometer, ref. [11]). Vi observerte også at NASTRp betydelig hemmet cellevekst i lav serum inneholdt tilstand under behandling (S2 fig). Vi fant ut at NASTRp viste signifikant anti-proliferativ effekt på teser lunge kreft cellelinjer uavhengig av sin genetisk mutasjon status.
(A) Hemmende effekt av NASTRp på celleproliferasjon i human lunge kreft cellelinjer. A549, NCI-H1792, NCI-H441, NCI-H1734, NCI-H1975 og NCI-H520 cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av NASTRp i RPMI-medium supplert med 5% FBS i 96 timer. Celleformering ble bestemt ved CellTiter Glo-analyse som beskrevet i metodene. (B) Lav tetthet kolonidannelse analysen med NASTRp behandling. Celler ble sådd ut som enkeltcellekulturer og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av NASTRp lov til å kultur inntil store kolonier var synlige. Koloniene ble farget med krystallfiolett og fotografert å telle. (C) Suppression of Anchorage uavhengig vekst av NASTRp. Celler ble platet ut med lav tetthet av agarose (0,4%) inneholdende forskjellige konsentrasjoner av NASTRp. NCI-H1734-celler ble vist som representative bilder av myk agar assay. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD av triplikate brønner. *
P
0,05 versus kjøretøy.
Neste, vi preget enten NASTRp påvirker kolonidannelse og forankringsuavhengig cellevekst. I samsvar med den inhiberende effekt av NASTRp på celleproliferasjon, ble koloninumrene til alle former for lungekreftceller dramatisk redusert ved NASTRp behandling i forankringsavhengig og uavhengig cellevekst (Fig 2B og 2C, S3 fig). For å avgjøre om den anti-kreft effekt av NASTRp er spesifikk for lungekreft, har vi gjennomført lignende celleproliferasjon og kolonidannelse analyser i bukspyttkjertelen og brystkreft celler. Vi observerte den hemmende effekten av NASTRp på celleproliferasjon og kolonidannelse i kreft i bukspyttkjertelen celler (Panc-1, ASPC-en og SU.86.86.) Og brystkreftceller (MCF-7, MDA-MB-231 og SKBR3) samt (S4 fig). Dermed disse resultatene tyder på at NASTRp inhiberer celleproliferasjon, kolonidannelsen, og forankrings-uavhengig vekst i humane kreftceller, inkludert minst, lunge, bukspyttkjertel og brystcancercellelinjer.
Induksjon av cellesyklus-stans igjennom nedregulering av cykliner ved NASTRp
Det har vist seg at CREB regulerer cellesyklusutvikling ved oppregulering av cyclin-proteiner, inkludert cyklin D1 og cyclin A2, som inneholder CRE elementer i deres promotorområdene [25, 26] . Vi bekreftet også at cykliner inneholde CRE elementer i sine arrangører av sekvensbasert analyse ved hjelp av offentlige databaser (f.eks BioBase eller TESS). Som vist i figur 3A, cyclin A2, B1, D1, og E2 inneholder antatte CRE regioner i deres aktivatorer. For å avgjøre om en CREB inhibitor, NASTRp faktisk nedregulerer cykliner, undersøkte vi uttrykket nivåer av cellesyklusrelaterte cykliner henhold NASTRp behandling av QRT-PCR og Western blot analyser. Som vist Fig 3B og 3C, NASTRp dramatisk nedregulert uttrykk for cykliner, inkludert cyclin A2, B1, D1 og E2 på mRNA og proteinnivå. Videre NASTRp redusert bestanden av celler i S-fase cellesyklus og førte til cellesyklus arrest i G1 og G2 faser i NCI-H441-celler (figur 3D). Disse data indikerer at NASTRp undertrykker NSCLC celleproliferasjon, i hvert fall delvis, gjennom nedregulering av viktige regulatorer av cellesyklus, cykliner.
(A) CRE i promotorene til gener cyclin. Sekvensanalyse av arrangører av genene indikerte de potensielle bindingsseter for CREB-CBP. (B og C) Effekt av NASTRp av ekspresjonen av cykliner i RNA (B, QRT-PCR) og protein (C, Western blot) i A549 (venstre), NCI-H1792 (i midten) og NCI-H441 (høyre). Kjøretøykontroll er satt til 1 i QRT-PCR-analyse. For QRT-PCR-data er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *
P
0,05 versus kjøretøy. (D) NCI-H441-celler ble behandlet med 10 uM NASTRp i 24 timer og cellesyklusfordelingen ble bestemt ved propidiumjodidfarging etterfulgt av FACS-analyse.
Undertrykkelse av autophagy og induksjon av ER stress og celle døden ved NASTRp
Interessant, observerte vi flere vacuole lignende strukturer i cytosol av NASTRp-behandlede celler. Vi deretter hypotese at NASTRp kan undertrykke cytobeskyttende autophagy motvirker en tumor-fremmende rolle for å virke som et anti-kreft legemiddel. Autophagy er ofte betraktet som en alternativ kilde til næring for kreftcellene å overleve når de er under begrenset vekst forsyning. Således undersøkte vi Autophagy markører, slik som LC3B modifikasjon og p62 /SQSTM1 degradering i henhold NASTRp behandling i humane NSCLC-celler. Av notatet, er p62 en nøkkelmolekyl administrerende autophagic clearance av polyubiquitinated proteiner gjennom direkte binding til LC3 i autophagosomes [27]. Defekt i autophagy forårsaker akkumulering av p62, ubiquitin konjugere proteinaggregater og skadede organ særlig mitochondria [28, 29].
Vi fant at i alle cellelinjene som ble undersøkt, p62 dramatisk fremkommet som en følge av NASTRp behandling i en dose -avhengig måte (fig 4A). Mens andre kritiske autofagi relaterte proteiner inkludert ATG7 og ATG5-12 konjugering nivåene ble betydelig redusert etter NASTRp behandling, noe som indikerer en undertrykkende effekt av NASTRp på autofagi (fig 4A). Videre NASTRp blokkert basal autophagy fluks som vist på ingen endring av LC3B modifisering eller p62 nedbrytning i nærvær av bafilomycin A1 (en V-ATPase-inhibitor), som blokkerer de sene trinnene med autofagi (figur 4B).
(A) Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av NASTRp i RPMI-1640 medium supplert med 5% FBS i 24 timer. Cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse med de angitte antistoffer. (B) Hemming av autofagi forandring av NASTRp. NCI-H441-celler ble behandlet med 20 uM NASTRp i nærvær eller fravær av bafilomycin A1 (100 nM) i 24 timer. Cellelysater ble utsatt for SDS-PAGE /Western blot-analyse ved anvendelse av de angitte antistoffer. (C) Opphopning av P62 aggregater av NASTRp. A549-celler ble behandlet med 20 uM NASTRp i 24 timer. Behandlede celler ble fulgt immunofluorescens farging med anti-P62-antistoff. Skala: 10 mikrometer. (D) Potensiell klinisk nytte av NASTRp i lunge adenokarsinom pasienter. Kaplan-Meier overlevelseskurver for menneskelige lunge adenokarsinom datasett, som sammenligner det total overlevelse mellom svulster med høye nivåer (rød) eller lave nivåer (svart) på ATG7 (venstre panel), ATG5 (i midten panel) og p62 /SQSTM1 (høyre panel) genuttrykk fra Kaplan-Meier Plotter verktøyet. Log-rank
P
verdiene er vist.
Oppbyggingen av p62 ble ytterligere bekreftet celler ved hjelp av immunfluorescens i A549. I samsvar med den immunobloting resultat, P62 aggregater (mer enn 2-4 um) signifikant økning i cytosol følgende NASTRp behandling sammenlignet med vehikkel (figur 4C). Disse resultatene er i samsvar med hypotesen om at NASTRp kan undertrykke tumorfremmende /cytobeskyttende autophagy, i hvert fall delvis, gjennom ATG7 nedregulering og blokkering autofagi fluks som vist ved akkumulering av LC3B-II og p62.
Siden korrelasjonen mellom pasient overlevelse i lunge adenokarsinom og uttrykk for autofagi proteiner, slik som ATG7, ATG5 eller p62 ennå ikke er rapportert, neste gjennomførte vi en overlevelse analyse av lunge adenokarsinom pasienter scoret for
ATG7
,
ATG5
eller
p62
mRNA uttrykk ved hjelp av offentlige databaser. I
ATG7
-relaterte database (ID: 218673_s_at), er det 242 (49,8%) saker for høye tilfeller
ATG7
uttrykk og 244 (50,2%) for lav
ATG7
uttrykk. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viser at pasienter som hadde lav
ATG7
uttrykk hatt en betydelig forbedret overlevelse sammenlignet med de med høy
ATG7
uttrykk (Fig 4D, topp,
P
= 2.7e-06). Pasientene med lav
ATG5
uttrykk hadde bedre overlevelse i samsvar med
ATG7
tilfeller (figur 4D, midtre
P
= 1.1e-08). I kontrast til pasienter med høy ekspresjon av
p62
hadde signifikant bedre overlevelse resultat sammenlignet med pasienter med lav
p62
ekspresjon (Fig 4D, bunn,
P = 9,7
e-07).
Det er blitt rapportert at defekte autofagi gjennom nedregulert ATG7 resulterte i forhøyet eR stress i metabolsk leversykdom [30]. Gitt den undertrykkelse av ATG7 av NASTRp, vi videre undersøkt uttrykk for ER stress markører, for eksempel GRP78, CHOP, IRE1, ekstra fordel, ATF6 og XBP1, for å avgjøre om NASTRp induserer ER stress i lungekreftceller. Som vist i figur 5A, NASTRp indusert ER stress og aktivert ufoldede protein respons (UPR), demonstreres ved oppregulering av GRP78 [31] og CHOP. I tillegg er uttrykket nivåer av andre gener relatert til ER stress, slik som IRE1, ATF6, PERK og XBP1 også økt etter NASTRp behandling i humane kreftceller (figur 5A). Vi har bekreftet at NASTRp oppregulert nivået av grp78 og CHOP proteiner i en tid og doseavhengig oppførsel (figur 5A og 5B) og observert en dramatisk økning av CHOP ekspresjon i kjernen (figur 5C). Den ER stress ble uoverstigelig i nærvær av NASTRp og førte til celledød, som vist ved økte spaltes caspase-3, Bim uttrykk og TUNEL-positive punkter (figur 5B og 5D).
(A) QRT-PCR analyse av biomarkører for ER stress /UPR beslektede gener i NCI-H441 behandlet med 20 mikrometer NASTRp i tid selvfølgelig måte. (B) NASTRp indusert ER stress og aktivert UPR førte til apoptose med Bim induksjon hos NSCLC cellelinjer. Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av NASTRp i 24 timer og cellelysatene ble underkastet SDS-PAGE /Western blot-analyse ved bruk av de angitte antistoffer. (C) oppregulering av CHOP av NASTRp. NCI-H441-celler ble behandlet med 20 NASTRp for 0-24 timer. Ved de angitte tidspunkter ble cellene fiksert og utsatt for immunofluorescens-analyse med anti-CHOP antistoff. Celle bildene ble microphotographed med fluorescens mikroskopi ved 60x forstørrelse. Skala barer: hvit; 10 mikrometer. (D) TUNEL-positive celler i NASTRp-behandlede (i 48 timer) A549 celler ble talt og analysert som relativ% av TUNEL-positive celler. *
P
0,05 versus kjøretøy.
Vi evaluerte deretter på målet effekten av NASTRp å bruke normal menneskelig tracheobronchial epitel (NHTBE) celler i to-dimensjonale (vanlig vev kultur tilstand) og tre-dimentsional organotypiske (luft- væske grensesnitt kultur tilstand, ALI) kultur-systemer [5, 17-19]. Selv om det var mindre drepende virkning av NASTRp på NHTBE-celler, ble cellelevedyktigheten ikke gått ned lavere enn 50%, til og med 20 pM av NASTRp behandling (Fig 6A og 6B). Mens p62 ble akkumulert i lunge kreftceller, p62 i NHTBE celler var uforanderlig følgende NASTRp behandling (figur 6C). Disse data indikerer at NASTRp kan spesifikt rettet inn i kreftcellen i stedet for normal celle, særlig innenfor terapeutiske vindu områder. Tatt sammen tyder disse resultater på at NASTRp undertrykker tumorfremmende rolle autophagy gjennom ATG7 nedregulering og p62 akkumulering, induserer ER stress med aktivering av UPR, og til slutt fører til celledød i humane NSCLC-celler (figur 6D).
(A) Celleviabilitet assay som reaksjon på NASTRp av NHTBE celler. (B) NHTBE celler som ble dyrket i 3D organotypiske luft-væske-grensesnittet (ALI) systemet under NASTRp behandling. NHTBE-celler ble behandlet med 10 uM NASTRp i 96 timer. Representative bildene ble innhentet ved hjelp av fasekontrast lysmikroskopi. (C) Uendret p62 nivå i NASTRp behandlet NHTBE celle. NHTBE-celler ble behandlet med de angitte doser av NASTRp i 24 timer.
