Abstract
Vår fersk studie viste at høyere uttrykk av N-myc downregulated gen 1 ( NDRG1) er nært korrelert med dårlig prognose i mage kreftpasienter. I denne studien, spurte vi om NDRG1 har sentrale roller i ondartet progresjon inkludert metastasering av mage kreftceller. Ved genekspresjon microarray analyse uttrykk for NDRG1 viste større økning blant totalt 3691 oppregulert gener i en svært magekreft med spredning cellelinje (58As1) enn foreldre lav metastatisk motstykke (HSC-58). Den svært metastatisk cellelinjer viste redusert uttrykk av E-cadherin, sammen med forbedret uttrykk for vimentin og Snail. Dette reduserte uttrykk for E-cadherin ble restaurert av Snail knockdown i svært metastatisk cellelinjer. Vi neste etablerte stabile NDRG1 knockdown cellelinjer (AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54) fra svært metastatisk cellelinje, og begge disse cellelinjene viste forbedret uttrykk for E-cadherin og redusert uttrykk for vimentin og Snail. Og også, E-cadherin promoter-drevet luciferase-aktivitet ble funnet å være økt ved NDRG1 knockdown i det svært metastatisk cellelinje. NDRG1 knockdown i magekreft celle viste trykkes invasjon av kreftceller i surround vev, undertrykt metastaser til peritoneum og redusert ascites akkumulering i mus med betydelig forbedret overlevelse. Dette er den første studien som viser at NDRG1 spiller sin avgjørende rolle i ondartet progresjon av magekreft gjennom epitel mesenchymale overgang
Citation. Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M , et al. (2012) N-myc Nedstrøms regulert Gene 1 (NDRG1) Fremmer metastasering av menneskelig scirrhous Gastric kreftceller gjennom epithelial Mesenchymale Transition. PLoS ONE syv (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 08.12.2011; Godkjent: 22 juni 2012; Publisert: 23.07.2012
Copyright: © 2012 Ureshino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av et stipend-i-aid for kreftforskning fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (Dr. Ono), og ved den tredje Term omfattende kontroll Forskning for Cancer fra Helsedepartementet, Arbeiderpartiet og velferds av Japan (Dr. Kuwano). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kreftformen hos Japan og andre asiatiske land. Pasienten prognose scirrhous magekreft er spesielt dårlig. Scirrhous gastrisk karsinom er ofte ledsaget av peritoneal formidling og metastasering til lymfeknutene og leveren, som er alvorlige problemer som må bli kontrollert. Genekspresjon profil avslørte genet amplifikasjoner av K-sam og c-Met i 30-40% av scirrhous mage kreft, og at overekspresjon av forskjellige vekstfaktorer, såsom transformerende vekstfaktor-β (TGF-β), blodplateavledet vekst faktor (PDGF), insulin-lignende vekstfaktor (IGF) og fibroblastvekstfaktor-2 (FGF-2) [1]. Nyere DNA microarray analyse viste spesifikk oppregulering av flere gener inkludert
SPARC
,
RGEIII
,
S100A10
, og kollagen type I [2] – [4].
Dyremodeller modeller~~POS=HEADCOMP som gjenspeiler egenskapene til kreft peritonitt og metastaser til peritoneum er viktig for å forstå utviklingen av ondartet progresjon av magekreft. Yanagihara
et al. Product: [5] først etablert HSC-58 cellelinje fra menneske scirrhous magekreft, og deretter etablert to underlinjer, 58As1 og 58As9, med et stort potensial for peritoneal formidling og lymfeknutemetastase ved gjentatte ortotopisk inokulering av HSC-58 celler i den gastriske vegg i atymiske mus [6], [7]. Disse underlinjer ofte føre til akkumulering av ascites etter ortotopisk implantasjon og viser økt ekspresjon av gener som koder for proteaser og proteiner som er involvert i celleadhesjon, celle motilitet, proliferasjon og angiogenese [6]. De har også vokser selektivt i den gastriske submucosa, og invadere det dypere laget for å nå den serosale planet i magen [7]. Imidlertid er det fortsatt uklart hvorfor de har fått et så høyt potensial for metastasering under valget.
I denne studien har vi brukt disse svært metastatisk cellelinjer for å undersøke hvordan menneskelige mage kreftceller kan skaffe metastatisk potensial. Vi først sammenlignet genuttrykk profiler mellom høyt metastatiske og lave metastatiske foreldrecellelinjer av microarray analyse. Vi fokuserte på ett gen som heter N-myc nedstrøms regulert gen 1 (NDRG1) fordi det ble funnet å være markert oppregulert i svært magekreft med spredning cellelinjer forhold til sin kollega celler. Det ble også tidligere rapportert at NDRG1 uttrykk var en prediktiv markør for ondartet progresjon og dårlig prognose i mage pasienter [8]. I samsvar med denne studien, observerte vi at høy NDRG1 uttrykk var signifikant korrelert med tumor angiogenese og ondartet progresjon sammen med dårlig prognose i magekreft [9]. Vi rapporterte også at NDRG1 knockdown induserer redusert produksjon av potente angiogene faktorer og tumor angiogenese ved lungekreft celler, og også at NDRG1 er en prediktiv markør for tumor angiogenese og dårlig prognose for pasienter med ikke-småcellet lungekreft [10]. NDRG1, en av de fire NDRG familie gener, viser således forskjellige funksjoner [11], og NDRG1 fungerer enten som metastase demper eller som onkogen og ondartet promoter, avhengig av tumortyper, [11], [12]. Videre er uttrykk for NDRG1 genet tett kontrollert av N-myc og relaterte MYC familie proteiner [13] og overekspresjon av c-myc indusert epitelial mesenchymale overgang (EMT) i mammary epitelceller [14]. Den viktige rolle EMT er ofte referert i dens nære forbindelse med utvikling og tumorprogresjon inkludert kreft metastase [15], [16]. Men i disse studiene ble det regulatoriske rolle NDRG1 ikke undersøkt. I vår nåværende studie undersøkte vi metastatisk potensial av magekreftceller ved sin sammenheng med EMT-baserte rollen NDRG1.
Resultater
Sammenligning av cellevekst, Cell morfologi, tumorvekst, Formidling og genuttrykk profiler mellom meget magekreft med spredning cellelinjer og deres lav metastatisk Motparts
i samsvar med tidligere studier [6], [7], de svært metastatisk kreft cellelinjer 58As1 og 58As9 viste høyere vekst enn foreldre motstykke, HSC-58, med dobling tider av 23-26 timer, sammenlignet med 30 timer for foreldre celler (Figur 1a). 58As1 celler ble enkelt frittliggende og viste suspensjon-type cellevekst med rund morfologi, mens HSC-58 og 58As9 celler ble festet og viste lagdelt cellevekst med en fibroblastisk morfologi (Figur 1B). Begge 58As1 og 58As9 celler viste mye høyere svulst vekst i en subkutan xenograft modell i forhold til foreldre HSC-58 celler (figur 1C). Tidligere studier har vist at det orthotopic transplantasjon av 58As1 celler indusert mye høyere peritoneal formidling og ascites opphopning enn for HSC-58 celler [6], [7]. Vi har videre bekreftet peritoneal spredning av cellene ved å implantere dem inn i bukhulen til mus. Mus implantert med 58As1 celler viste utseendet til et gjennomsnitt på 8 ± 3 synlige noduler i mesenterium av hver enkelt mus og akkumulering av ascites (varierende fra 0.7-2.5 ml /mus) (figur 1D, E). I motsetning til mus implantert med foreldre HSC-58 celler viste dannelsen av få, om noen små knuter, og tilsynelatende uten akkumulering av ascites.
(A) Sammenligning av celleproliferasjonsprosesser priser
in vitro
. Celler ble sådd ut på dag 0 (5 x 10
4 celler /skål) og spredning ble målt i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS. Dobling ganger var 34, 27, og 23 timer for HSC-58 (sort), 58As1 (grå) og 58As9 celler (hvit), henholdsvis. (B) Morfologi av magekreft cellelinje
in vitro
. HSC-58 og 58As9 cellevekst var synlig som festet lag med fibroblastisk morfologi. 58As1 celler viste suspensjon-type cellevekst med rund morfologi. (C) Tumor vekst av magekreft cellelinjer på dag 14 og 28. HSC-58 (sort), 58As1 (lys grå), og 58As9 (mørk grå) ble subkutant implantert med 1 × 10
7 celler på dag 0 . 58As1 eller 58As9 celler viste signifikant (*
p
0,01) høyere kreftvekstrater enn HSC-58 celler. (D, E) Peritoneal formidling og ascites dannelse
in vivo
. Typiske tall viser høy og lav peritoneal formidling og ascites opphopning på dag 55 etter inokulering av 1 x 10
6 celler i bukhulen. Hver mus viste ascites opphopning av 0.7-2.5 ml og 5-12 knuter på mesenterium følgende 58As1 inokulasjon, men dette var ikke tydelig med HSC-58 celler. N.d., ikke oppdages. (F) Microarray analyse på ekspresjon av gener som er opp- eller ned- regulert i høyt metastatisk cellelinje, 58Asl, sammenlignet med HSC-58. Relative ekspresjonshastigheter presenteres på gener som tilhører tre biologiske funksjoner.
neste forhold genuttrykk profiler mellom 58As1 celler og deres foreldre motstykke, HSC-58, ved hjelp av DNA microarray analyse. Av de 41.000 RNA transkripsjoner og varianter, identifiserte vi 3691 differensielt uttrykte gener som ble oppregulert til to ganger, og 3536 gener som ble nedregulert til 0,5 ganger eller mindre i 58As1 celler sammenlignet med HSC-58 celler. Figur 1F presenterte gener som er differensielt uttrykt i 58As1 celler sammenlignet med HSC-58-celler, begrenset til de som tilhører den NDRG familien, og gener relatert til metastase, inkludert matriks-metalloproteinaser (MMP) /katepsiner, adhesjon og epitelial-mesenchymale-overgang ( EMT). Av de fire genene i NDRG familien [17], ble ekspresjonen av NDRG1 og NDRG4 oppregulert i den svært metastatisk cellelinje (58As1) sammenlignet med den parentale cellelinje (HSC-58). Uttrykket av EMT-relaterte gener i 58As1 celler ble spesielt påvirket av oppkjøpet av en høy metastatisk potensial. Uttrykket av epitel-spesifikke gener, inkludert E-cadherin (
CDH1
), P-cadherin (
CDH3
) og β-catenin (
CTNNB1
) ble nedregulert . I motsetning bare MMP1 (
MMP1
) uttrykk ble markert oppregulert; uttrykket av cathepsin L (
CTSL1
) ble økt, men at av cathepsin B (
CTSB
) var det ikke. Uttrykket av mesenchyme-spesifikke gener, vimentin (
VIM
) og Snail (
SNAI1
), en nøkkel transkripsjonsfaktor for undertrykkelse av E-cadherin uttrykk, ble oppregulert.
Forbedret NDRG1 genuttrykk i Highly magekreft med spredning cellelinjer
Vi ytterligere sammenlignet protein uttrykk av flere gener i HSC-58, 58As1 og 58As9 celler (figur 2A). Ekspresjon av NDRG1 ble markert forsterket, og det av vimentin, snegle, p-ERK1 /2, p-Akt, og p-GSK-3β ble også øket, i både 58As1 og 58As9 celler sammenlignet med HSC-58-celler. Det var ingen tydelig uttrykk for Wnt3a og Wnt5a i disse cellelinjer (data ikke vist). Derimot, observerte vi redusert uttrykk av E-cadherin og β-catenin i 58As1 og 58As9 celler sammenlignet med HSC-58 celler (figur 2A). Fosforylering av β-catenin Ser33 /37 og Ser552 ble funnet å være mye mindre i 58As1 og 58As9 enn HSC58. I samsvar med protein uttrykk nivåer, mRNA uttrykk nivåer av NDRG1, vimentin, Snail og MMP-1 var høyere i begge svært metastatisk cellelinjer enn foreldre motpart (figur 2B). Det var mye mindre mRNA ekspresjon av E-cadherin og β-catenin i både 58As1 og 58As9 enn HSC-58.
(A) Western blot-analyse av totale cellelysater viser protein ekspresjonsnivå av NDRG1, vekstfaktor-reseptor , EMT-relaterte proteiner, Wnt /β-catenin relaterte proteiner, og andre faktorer i HSC-58, 58As1 og 58As9 celler. (B) Sammenligning av mRNA uttrykk nivåer av NDRG1, E-cadherin, vimentin, sneglen, MMP-1 og β-catenin i HSC-58, 58As1 og 58As9 celler ved QRT-PCR-analyse. (C) immuncytokjemisk analyse av E-cadherin og β-catenin i HSC-58 og 58As9, ved hjelp av spesifikke antistoffer mot E-cadherin, β-catenin og DAP1. Forstørrelse × 200. (D) Western blot-analyse viser ekspresjon av β-catenin og snegl i kjernen og cytosol fraksjon. CREB, en kjernefysisk markør, og α-tubulin, en cytosol markør. (E, F) Sammenligning av luciferase aktivitet drevet av E-cadhrin promoter og β-catenin (TopFlash) drevet promoter mellom HSC-58 og dets høyt metastatiske cellelinjer. Den relative promoter aktivitet er presentert når normalisert ved aktiviteten i HSC-58. * P. 0,01
immunocytokjemisk analyse viste at lokalisering av E-cadherin både i cytoplasma og membran, og β-catenin var hovedsakelig lokalisert i cytoplasma i begge HSC-58 og 58As9 celler (figur 2C) . Immunocytokjemisk analyse for 58As1 kunne ikke utføres som 58As1 vokser i suspensjon. Videre er ekspresjon av β-catenin var forholdsvis lavere både i cytoplasma og cellekjernen, men det fra snegle ble funnet å være mye høyere i kjernen av 58As1 og 58As9 enn HSC-58 (figur 2D). Vi undersøkte også E-cadherin promoter-aktivitet (figur 2E) og β-catenin indusert rapportøraktivitet, ved TopFlash reporter-analyse (figur 2F) og fant at det var signifikant nedgang i luciferase-aktivitet drevet av E-cadherin-promoteren og også ved β-catenin både 58As1 og 58As9 sammenlignet med HSC-58, i samsvar med mRNA nivåer av både gener.
NDRG1 knockdown induserer oppregulering av E-cadherin og nedregulering av vimentin og Snail i Highly Metastatisk Cells
Vi neste undersøkt om NDRG1 knockdown spesielt påvirket uttrykk for EMT-relaterte gener i den svært metastatisk cellelinje, 58As1. Vi etablerte to stabile NDRG1 knockdown celle kloner, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 ved trans NDRG1 shRNA inn 58As1 celler. Begge AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler viste lignende vekstrater til hverandre og deres foreldre motstykke AS1 /Mock3, med dobling tider av 25-27 timer i kultur (figur 3A). Begge NDRG1 forstummet cellelinjer viste tett adhesjon av celler til kulturen fatet og fibroblastisk morfologi, mens AS1 /Mock3 celler viste en suspensjon-type cellevekst med rund celle morfologi (Figur 3B). Vi neste undersøkt effekten av NDRG1 stanse på den tumorgene aktiviteten av 58As1 celler ved hjelp av en forankrings-uavhengig vekst analysen. Begge NDRG1 stilnet cellelinjene viste signifikant reduksjon av deres forankrings-uavhengig vekst, som indikert ved koloni-nummer i bløt agar (
*
p
0,01). (Figur 3C)
( A) Celleproliferering i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS ble fulgt etter såing 5 × 10
4 celler /skål på dag 0. Dobling tider var lik for AS1 /Mock3 (svart), AS1 /Sic50 (grå) og AS1 /Sic54 (hvit) celler (26-30 timer). (B) Cell morfologi AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54. Typiske cellemorfologi i kultur viser AS1 /Mock3 suspensjon-type cellevekst og festet lag-type cellevekst både NDRG1 knockdowned cellelinjer. (C) Representative bilder av kolonier av AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 når ruges i 14 dager i myk agar (venstre panel). Kvantitativ analyse av kolonidannelse aktivitet ved tre cellelinjer når 5 retter for hver linje ble scoret (høyre panel). Signifikante forskjeller (*
p
0,01). I kolonien tall mellom 58As1 og dets NDRG1 knockdown cellelinjer
Da vi sammenlignet de genuttrykk profiler mellom AS1 /Mock3 og AS1 /Sic50 celler ved hjelp av DNA microarray analyse (Figur 4A). NDRG1 knockdown resulterte i økt uttrykk av E-cadherin (
CDH1
) og P-cadherin (
CDH3
), men redusert uttrykk for vimentin (
VIM
) og Snail (
SNAI1
). Vi neste utførte western blot og QRT-RCR analyser for flere molekyler som ble modulert av NDRG1 knockdown i microarray analyse (figur 4B, C). Disse to cellelinjene viste mye lavere ekspresjon av både NDRG1 mRNA og protein sammenlignet med de AS1 /Mock3 celler. Forbedret uttrykk for E-cadherin ble konsekvent observert i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler sammenlignet med AS1 /Mock3 celler ved western blot analyse. I AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler, både western blot og QRT-PCR-analyser bekreftet redusert uttrykk for vimentin og Snail uten å påvirke uttrykket av p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β og GSK-3β (figur 4B, C).
(A) Microarray analyse for virkningen av NDRG1 knockdown på ekspresjon av gener som er opp- eller ned- regulert i Asl /Sic50 versus AS1 /Mock3. Relative ekspresjonshastigheter presenteres på gener som tilhører tre biologiske funksjoner. (B) Sammenligning av protein ekspresjonsnivåer av NDRG1, EMT-relaterte proteiner, β-catenin, Akt, p-Akt, ERK1 /2, p-ERK1 /2, GSK-3P, p-GSK-3P og EGFR ved western blot analyse med totalt cellelysat. (C) Et mRNA-ekspresjon av NDRG1, E-cadherin, vimentin, sneglen, MMP-1 og β-catenin ble bestemt ved QRT-PCR-analyse. (D) Sammenligning av luciferase-aktivitet drevet av β-catenin (TopFlash) mellom AS1 /Mock3 og dens NDRG1 knockdowned cellelinjer. Relativ luminescens fold blir presentert når normalisert ved verdien i AS1 /Mock3. Hver kolonne er gjennomsnittet av triplikate forsøk ± SD.
På den annen side er NDRG1 vel kjent for å undertrykke metastase og celleproliferasjon ved prostata og kolon kreftceller. Nylige studier har vist at NDRG1 modulerer Wnt-β-catenin signalveien med øket ekspresjon av E-cadherin i human prostata og tykktarm kreftcelle [18], [19]. Imidlertid har NDRG1 knockdown i 58As1 celler ikke påvirker β-catenin ekspresjon både protein og mRNA nivå (figur 4B, C). Og også β-catenin drevet promoter aktivitet ved TopFlash reporter analysen viste ingen forskjell i promoter aktivitet mellom AS1 /Mock og NDRG1 forstummet cellelinjer. Derfor β-catenin ekspresjon ble ikke påvirket av NDRG1 knockdown. NDRG1 knockdown dermed konsekvent økt uttrykk av E-cadherin og redusert uttrykk av sneglen og vimentin i svært metastatisk cellelinje. Men det var ingen synlig endring i uttrykket av β-catenin av NDRG1 knockdown.
Enhanced E-cadherin Arrangøren aktivitet ved NDRG1 knockdown gjennom sneglen i magekreft Cells
Av ulike transkripsjonsfaktorer som undertrykker uttrykk for E-cadherin inkludert Snail, Slug, Twist, TCF4 og SIP1 [20], uttrykk for Snail ble spesielt modulert av NDRG1 i magekreftceller. Vi undersøkte om uttrykk for E-cadherin og /eller vimentin kunne være regulert av Snail i HSC-58 celler. Forbigående behandling med snegle siRNA resulterte i økt ekspresjon av E-cadherin, men ikke den av vimentin og NDRG1, i tidsavhengig måte (figur 5A). Det var bare en liten om noen økning i β-catenin uttrykk ved Snail knockdown. Videre E-cadherin promoter-drevet luciferase-aktivitet ble betydelig undertrykt ved transfeksjon av snegle komplementære DNA i to cancercellelinjene som ble testet (figur 5B). Vi sammenlignet neste E-cadherin promoter aktivitet mellom AS1 /Mock3 og dets NDRG1 forstummet cellelinjer. Som vist i figur 5C, var signifikant (*
p
0,05). Forbedring av E-cadherin promoter-aktivitet ved NDRG1 knockdown
(A) sammenligning av protein ekspresjonsnivåer av E- cadherin, β-catenin, NDRG1 og vimentin når forbigående behandlet med Snail siRNA for 0, 48 og 96 timer etter western blot analyse i HSC-58 celle. (B) E-cadherin promoter-drevet luciferase-aktivitet i fravær eller nærvær av snegle-ekspresjon i HSC-58 og BxPC-3-celler. E-cadherin-luc ble transfektert med eller uten pcDNA3-snegle, og luciferaseaktiviteten ble målt. Hver kolonne er gjennomsnittet av tredoble studier (*
p
0,05). (C) Sammenligning av E-cadherin promoter-drevet luciferase aktivitet (E-cadherin-Luc) i AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54. Hver kolonne er gjennomsnittet av tredoble studier (*
p
0,05). (D) Virkning av CT99021 på protein ekspresjon av NDRG1 og forskjellige EMT-relaterte molekyler ved Western blot-analyse. 58Asl celler ble behandlet med angitte doser av stoffet i 24 timer. (E) Virkningen av β-catenin knockdown etter dens sirnas for ekspresjon av E-cadherin. HSC-58 celler ble transfektert med sirnas for 24 timer, og totale cellelysatene ble analysert ved Western blot analyse.
GSK-3β er et viktig enzym for aktivering av EMT vei [20], [21 ], og også for fosforylering av NDRG1 [22], [23]. Ekspresjon av p-GSK-3β ble øket i den svært metastatisk cellelinje, 58As1 (se figur 2A). Vi undersøkte om GSK-3β var involvert i NDRG1 indusert endret uttrykk for E-cadherin og vimentin. Behandling med en inhibitor (CT99021) av GSK-3β resulterte i redusert ekspresjon av p-NDRG1 og p-GSK-3β, og også økt ekspresjon av E-cadherin og β-catenin i 58As1 celler (figur 5D). Som vist i figur 5E, gjorde β-catenin knockdown ikke påvirke uttrykket av E-cadherin, vimentin og Snail.
NDRG1 knockdown induserer Mesenchymale Epitelial Overgang og undertrykker metastaser til peritoneum av høyt magekreft med spredning Cells
Sammenligning svulst vekst på AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 celler i en xenograft modell avslørte tregere svulst vekst på både AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 av NDRG1 knockdown (Figur 6A, B). NDRG1 knockdown fortrengt lokal infiltrasjon i AS1 /Mock3 tumorceller inn i det omkringliggende stroma og tilstøtende adipose og /eller muskelvev, og innkapsles tumorvekst (figur 6C). Høy uttrykk for E-cadherin ble observert i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 svulster, mens høy uttrykk for vimentin ble observert i kreftceller av AS1 /Mock3 tumorer (Figur 6D). Derimot, var det nesten ingen endring i uttrykket av β-catenin i AS1 /Sic50 og AS1 /Sic54 svulster sammenlignet med AS1 /Mock3 svulst.
(A) Tumorvekst ble fulgt etter subkutan inokulering av 5 × 10
6 AS1 /Mock3 (♦), AS1 /Sic50 (▪) og AS1 /Sic54 celler (▴). Inlet viser ingen tydelig NDRG1 uttrykk i enten AS1 /Sic50 eller AS1 /Sic54 svulster. (B) Tumor volum for AS1 /Sic50 (
p
= 0,87) og AS1 /Sic54 celler var litt mindre enn for AS1 /Mock3 (day28). Hver kolonne er et gjennomsnitt av fire dyr (± SD) (*
p
0,05). (C) Representative H 0,01) ble redusert til ca. 10% av det som blir indusert ved AS1 /Mock3 celler (figur 7C). Videre var det en signifikant (*
p
0,01) økning i overlevelsen av mus inokulert med AS1 /Sic50 celler (51 ± 16 dager) sammenlignet med 35 ± 14 dager for mus inokulert med AS1 /Mock3 celler, noe som indikerer at NDRG1 knockdown forlenger overlevelse (figur 7D).
(A) Makroskopiske bildene viser forstørret bukhulen og metastatiske knuter av AS1 /Mock3 og AS1 /Sic50. Pilspisser viser knuter. (B) Antall metastatiske knuter i mesenterium var 51 ± 16 (AS1 /Mock3) og 35 ± 14 (AS1 /Sic50) (
p
= 0,21), men nodule størrelse AS1 /Mock3 var 3- 4 ganger større enn de av AS1 /Sic50. (C) Sammenligning av volumet av ascites mellom AS1 /Mock3 (3,9 ± 1,0 ml) og AS1 /Sic50 celler (0,5 ± 0,6 ml) etter ortotopisk implantasjon (n = 7) (*
p
0,01 ). (D) Overlevelseskurvene viser at overlevelsen i AS1 /Sic50 tumorbærende mus var signifikant (*
p
0,01) lengre enn for AS1 /Mock3 tumorbærende mus (n = 6). (E) Vår hypotetisk modell hvor NDRG1 overekspresjon fremmer metastaser inkludert peritoneal formidling gjennom endring av EMT av scirrhous magekreftceller, eventuelt gjennom modifisering av Snail uttrykk.
Diskusjoner
Vi har tidligere rapportert at NDRG1 er nært korrelert med tumor angiogenese og dårlig overlevelse hos pasienter med magekreft, noe som tyder på at NDRG1 er en prediktiv biomarkør for ondartet progresjon av magekreft [9]. Fra vår nåværende studie, observerte vi følgende egenskaper ligger til grunn for kjøpet av en høy metastatisk potensial i magekreft: microarray, western blot og RT-PCR-analyser sammen avslørte oppregulering av NDRG1 i de svært metastatisk cellelinjer, 58As1 og 58As9, sammenlignet med deres lav metastatisk foreldre motstykke, HSC-58; høyere uttrykk av vimentin, sneglen, og MMP-1, og lavere uttrykk for E-cadherin og β-catenin var tydelig i de svært metastatisk cellelinjer i forhold til foreldre motstykke; av genene nedregulert i det svært metastatisk cellelinje, NDRG1 knockdown resulterte i oppregulering av E-cadherin, og nedregulering av vimentin og snegle, men nesten ingen virkning på ekspresjon av β-catenin; E-cadherin promoter aktivitet ble betydelig utvidet med NDRG1 knockdown; NDRG1 knockdown også undertrykt peritoneal spredning og akkumulering av ascites, og invasjon av høyt metastatiske celler til omkringliggende normalt vev.
I denne studien, NDRG1 knockdown resulterte i undertrykkelse av metastase av høyt magekreft med spredning celler (Figur 6 , 7), noe som tyder på at NDRG1 kan være en metastase promotor-gen i stedet for en metastase suppressorgen i magekreft. Vår nåværende studie støtter sterkt ideen om at om NDRG1 fremmer eller undertrykker ondartet progresjon av kreft hos mennesker avhenger av tumortyper og /eller differensiering status [11], [12]. Imidlertid er det fortsatt uklart hvorfor NDRG1 fungerer som tumor suppressor eller arrangøren avhengig av tumortyper eller histologiske typer. Vår tidligere studie viste at NDRG1 undertrykker tumorvekst og angiogenese av bukspyttkjertelen kreft gjennom NDRG1 drevet demping av NF-kB signalveien [24], [25]. Fersk studie har rapportert at uttrykket av metastaser suppressor genet,
KAI1
genet, er involvert i NDRG1 mediert metastaser undertrykkelse av prostatakreft gjennom ATF3-NF-kB vei [26]. Videre studier er nødvendig for å forstå hvilke reguleringsmekanisme er spesielt ansvarlig for NDRG1 drevet markedsføring av ondartet progresjon av magekreftceller.
EMT er en fersk høydepunkt som kan være nært forbundet med kreft ondartet progresjon inkludert tilegnelsen av høyt metastatisk potensial [15], [16]. I vår nåværende studie, NDRG1 knockdown forbedret uttrykk for E-cadherin og undertrykte uttrykk for vimentin både
in vitro Hotell og
in vivo
. NDRG1 kan spille en nøkkelrolle i overgangen fra en polarisert epitelial fenotype til en svært bevegelige mesenchymale fenotype. Delvis eller fullstendig tap av E-cadherin er ofte observert under progresjon mot malignitet i en rekke tumorer, inkludert magekreft [27], [28]. Oliveira et al. [29] rapporterte en nær sammenheng mellom E-cadherin tap og høy metastatisk potensial i magekreft. Chan et al. [30] rapporterte også løselig E-cadherin som en biomarkør for forlenget overlevelse av mage kreftpasienter. NDRG1 knockdown resulterte i relativt høyere E-cadherin uttrykk i AS1 /Sic50 svulster enn i AS1 /Mock3 svulster, noe som tyder på at NDRG1 kan spesielt kontrollere EMT eventuelt gjennom transkripsjonsfaktor sneglen av mage kreftceller (Figur 7E).
Wnt signal har sentrale roller i ondartet progresjon og metastasering av lunge- og brystkreftceller [31], [32], og Wnt signal induserer også EMT som innebærer metastatisk progresjon av epitelial kreft [31], [33]. NDRG1 er kjent som en metastase suppressorgen i prostata og tykktarmskreftcelle [11], [12]. Liu et al [18] har rapportert at NDRG1 undertrykker metastase gjennom Wnt /β-catenin signalveien i prostatakreftceller. En relevant studie av Chen et al [19] har også vist at NDRG1 modulerer TGF-β-indusert EMT gjennom endret ekspresjon av β-catenin og E-cadherin i tykktarmskreftcellen. Vår nåværende studie viste redusert uttrykk av β-catenin i begge svært metastatisk cellelinjer i forhold til foreldre motstykke, HSC-58. Men analyser både western blot og QRT-PCR viste ingen markant endring i uttrykket nivåer av β-catenin og også β-catenin drevet promoter aktivitet mellom høyt metastatiske 58As1 celler og sine to NDRG1 forstummet cellelinjer. Det synes mindre sannsynlig at β-catenin spiller en sentral rolle i undertrykkelse av metastase av NDRG1 knockdown i svært metastatiske kreftceller.
På den annen side er GSK-3β også kjent for å spille en rolle i kontrollen av EMT [20], [21], og GSK-3β er et viktig enzym for fosforyleringen av NDRG1, et utmerket substrat av GSK-3β [22], [23]. Ekspresjonen av p-GSK3P var forholdsvis høyere i den svært metastatisk cellelinjene enn foreldrecellelinje (figur 2B). Behandling med en potent inhibitor av GSK-3β resulterte i en undertrykket ekspresjon p-NDRG1, ledsaget av oppregulering av E-cadherin og β-catenin (figur 5D). Imidlertid var det nesten ingen forskjell i ekspresjonen av GSK-3β og p-GSK-3β ved NDRG1 knockdown i de høyt metastatiske celler (figur 4B), som antyder at GSK-3β ikke kan spille en vesentlig rolle i induksjon av EMT gjennom NDRG1 i mage kreftceller.
sneglen er et representativt transkripsjonsfaktor som styrer uttrykket av E-cadherin [20]. Av ulike regulatoriske faktorer som transcriptionally styrer E-cadherin, uttrykk for Snail ble spesielt modulert av NDRG1 i mage kreft cellelinjer brukt i denne studien. Kjernene ble farget med DAPI.
