Abstract
5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-CDR) er mye brukt som en demethylating agent og handlinger i konsert med histondeacetylase hemmere (HDACI) for å indusere apoptose eller hemming av celle spredning i humane kreftceller. Hvorvidt handlingen av 5-aza-CDR i denne synergistisk effekt resultater fra demetylering av denne agenten er ennå ikke klart. I denne studien fant vi at hemming av celleproliferasjon ble ikke observert når celler med knockdown av DNA metyltransferase 1 (DNMT1), eller dobbelt knock down av DNMT1-DNMT3A eller DNMT1-DNMT3B ble behandlet med HDACI, noe som tyder på at demethylating funksjon av 5- aza-CDR kan ikke være involvert i denne synergistisk effekt. Videre studier viste at det var en årsakssammenheng mellom 5-aza-CDR indusert DNA skade og mengden av [
3H] -5-aza-CDR inkorporert i DNA. Imidlertid inkorporert [
3H] -5-aza-CDR gradvis redusert når celler ble inkubert i [
3H] -5-aza-CDR fritt medium, noe som indikerer at 5-aza-CDR, som er en unormal basen kan utelukkes av cellen reparasjonssystem. Det var av interesse som HDACI vesentlig utsatt fjerning av inkorporert [
3H] -5-aza-CDR fra DNA. Videre HDAC hemmer viste selektiv synergi med nukleosid analog-indusert DNA skade hemmer celledeling, men viste ingen slik effekt med andre DNA skade påkjenninger som γ-ray og UV, etoposid eller cisplatin. Denne studien viser at HDACI synergi hemmer celledeling med nukleosidanaloger ved å undertrykke fjerning av innlemmet skadelige nukleotidanaloger fra DNA
Citation. Chai G, Li L, Zhou W, Wu L, Zhao Y, Wang D, et al. (2008) HDAC hemmere loven med 5-aza-2′-Deoxycytidine å hemme celleproliferasjon ved å undertrykke Fjerning av Incorporated Abases i lungekreft celler. PLoS ONE 3 (6): e2445. doi: 10,1371 /journal.pone.0002445
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina
mottatt: 15 mars 2008; Godkjent: 12 mai 2008; Publisert: 18 juni 2008
Copyright: © 2008 Chai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien er støttet av National Natural Science Foundation of China (No.30425017, 30670417 og 30621002), og tilskudd (2005CB522403, 2006AA02Z101, 2006CB910300 og B07001) fra departementet for vitenskap og teknologi i Kina
Konkurrerende interesser:. den forfatterne har erklært at noen konkurrerende interesser eksistere
Innledning
Det er vel kjent at DNA-metylering er assosiert med histon acetylering status i reguleringen av genekspresjon [1] -. [4] eller celleproliferasjon og aldring [5]. Denne sammenhengen mellom histon status og DNA metylering ble godt bekreftet av Cameron
et al
som fant at flere gener forstummet ved metylering ble reaktivert ved behandling med demethylating agenten 5-aza-CDR og histondeacetylase inhibitor (HDACI) trichostatin A (TSA) sammen, men ble ikke reaktiveres i nærvær av 5-aza-CDR eller TSA alene [6]. Senere har en rekke laboratorier, inkludert vår egen utvidet disse funnene til å sette opp en terapeutisk strategi for kreftbehandling, der 5-aza-CDR fungerer i forbindelse med depsipeptide /TSA å indusere betydelig apoptotisk celledød [7] – [10]. Siden DNA-metylering i promoterregionen er forbundet med HDAC1 med en metyl-bindende protein MeCP2 [11], er det troverdig at visse gener, hvis hypermethylated i deres promoter-regionen blir mer tettpakket ved histoner og dermed transkripsjonsfaktorer få tilgang til deres DNA-bindende nettstedene bare med større vanskelighetsgrad. Følgelig kan celledød relaterte gener, som er forstummet grunn hypermethylation, reaktiveres ved behandling med 5-aza-CDR; denne reaktivering bør styrkes ved HDACI, og på samme tid, bør celledød være lettere observeres også.
Imidlertid, 5-aza-CDR spiller også en anti-neoplastisk rolle som er metylering uavhengig [ ,,,0],12] – [14]. 5-aza-CDR kan handle direkte på mitokondriene og indusere apoptose i pattedyrceller [14]. En direkte metylering uavhengig bevis for at 5-aza-CDR-indusert celledød, er at 5-aza-CDR øker ekspresjon av Apaf-1 eller p19 i betydelig grad
INK4d å indusere celledød, imidlertid promotorområdene for disse genene er helt unmethylated [12], [13]. 5-aza-CDR har også blitt rapportert å indusere en synergistisk effekt ved å øke cisplatin bundet til DNA, via en endring i topologien av DNA forårsaket av 5-aza-CDR uten at dens funksjon som en demethylating middel [15]. Disse dataene antyder at 5-aza-CDR spiller ulike roller i celler som inkluderer både demethylating funksjoner og metylering uavhengige funksjoner.
Den cytotoksisitet av 5-aza-CDR resultater fra sin kapasitet til å skade DNA som 5-aza -CdR er en nukleosid-analog (NA) og kan bli innlemmet i DNA ryggraden [16], [17], som i sin tur kan indusere dannelsen av en kovalent addukt mellom 5-aza-CDR-molekylet og methyltranferases [16]. Det har blitt demonstrert at NAs slik som 5-aza-CDR eller cytarabin (Ara-C), fosforyleres til trifosfatformen sin og blir deretter inkorporert i DNA i løpet av replikasjonen [18]. Deretter ble innlemmet NA tjene som en abase som kan indusere DNA-skade, mutasjoner og steiling av DNA-replikasjonsgaffelen [19], [20]. Disse endringene i DNA ryggrad er skadelige, og DNA skade sensorer som DNA-PK, p53, ATM og ATR gjenkjenne disse skadede områdene og reparere unormal DNA [21], [22]. Tidligere både vår gruppe og andre forskere direkte bekreftet at fem-aza-CDR induserer DNA-skader og utløser p53-avhengige biologiske reaksjoner [23] – [25]. Men hvis unormale DNA endringer indusert ved inkorporering av NRS, er overveldet, eller de DNA-reparasjonssystemer er sterkt hemmet, vil cellene gjennomgå apoptose [26].
HDAC-inhibitorer, er nye og effektive anticancermidler [27 ], [28], som er involvert i regulering av mange gener, inkludert aktivering av p53 [29], eller downregulating anti-apoptotiske gener [28], [30] for å utøve en anti-neoplastisk effekt. Derfor undersøkelse av hvorvidt HDACI påvirker også DNA reparasjonsenzymer for å forbedre NA-indusert DNA skade kalles for.
I denne studien bekrefter vi at 5-aza-CDR opptrer i konsert med HDACI å indusere en signifikant inhibering av celleproliferasjon i en metylering uavhengig måte. 5-aza-CDR ble inkorporert i DNA i en dose- og tidsavhengig måte som var tydelig i forbindelse med induksjon av DNA-enkelttrådbrudd (SSB) av 5-aza-CDR. HDAC hemmere undertrykte betydelig fjerning av innlemmet 5-aza-CDR fra DNA og dermed produseres en synergistisk effekt resulterer i hemming av celleproliferasjon
Materialer og metoder
Cell kultur og kjemisk behandling
human lungecancer cellelinjer A549 og H719 ble anvendt i denne studien. Både 5-aza-CDR (oppløst i 50% eddiksyre) og Ara-C (oppløst i DMSO) (begge innkjøpt fra Sigma, St. Louis, MO) ble tilsatt friskt i mediet hver 24 timer. TSA (Sigma) ble oppløst i etanol. Depsipeptide (vennligst tilveiebrakt av NIH) ble oppløst i DMSO.
Bestemmelse av celleproliferering ved MTT-assay
Like antall celler (ca. 5000 /brønn) ble sådd på en 96-brønns plate 24 timer før eksperimentering. Celler ble behandlet med 5-aza-CDR, Ara-C, γ-bestråling og HDACI alene eller i kombinasjon. Etter behandling, ble MTT-fargestoff-oppløsning (Sigma) tilsatt til 96-brønns plate. Den korrigerte absorbans av hver prøve ble beregnet ved sammenligning med ubehandlet kontroll.
RT-PCR
For å finne ut om knockdown av DNA metyltransferaser (DNMTs) er effektivt i DNA demethylating og reaktive silenced gener, RT-PCR ble utført for å oppdage endringer i uttrykket av p21 som er brakt til taushet på grunn av en hypermethylation i
p21
promoter [31]. PCR-primere var som følger: p21, venstre primer- GGA AGA CCA TGT GGA CCT GT og høyre primer- GGA TTA GGG CTT CCT CTT GG;
β
aktin, venstre primer- TGG AGA AGA GCT ACG AGC TGC CTG og høyre primer- GTG CCG CCA GAC AGC ACT GTG TTG.
Western Blot
For å identifisere endringer i protein ekspresjon i celler behandlet med knockdown av DNMTs eller 5-aza-CDR, ble cellene høstet med en skrape og deretter vasket en gang med kald fosfatbufret saltløsning. Cellene ble deretter lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0,15% Igepal CA-630, og 1,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid). Like mengder av proteiner (100-150 ug) ble størrelsesfraksjonert på 7.5 til 12.5% SDS-PAGE. I tillegg, for å bestemme mengden av kromatin-bundet RPA, ble cellene lysert i oppløsning A (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,34 M sukrose, 10% glyserol, 1 mM Na
3VO
4 og proteasehemmer cocktail). For å oppnå nukleære ekstrakter ble cellene lysert i buffer B (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 0,34 M sukrose, 10% glycerol, 0,1% Triton X-100, protease-inhibitor cocktail) . Isolerte kjerner ble vasket en gang med buffer B og videre lysert i buffer A som ovenfor. For å oppnå kromatin bundne proteiner, ble isolerte kjerner lysert i buffer C (3 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 1 mM DTT) og videre lysert i buffer A som ovenfor.
Antistoffene som ble brukt var anti-PARP ( Santa Cruz, F-2), anti-RPA (Santa Cruz, MA34 og MA70-2), anti-γ-H2AX (Upstate, 05-636), anti-DNMT1 (Santa Cruz, H-300), anti-DNMT3A (Santa Cruz, P-16), anti-DNMT3B (en gave fra Dr. Xu, G, Shanghai Institute of Biological Science) og β-aktin antistoffer ble kjøpt fra Santa Cruz.
DNA bisulfite behandling og bisulfite sekvense
for å vurdere endringer i DNA metylering status etter behandling med knockdown av DNMTs, ble DNA behandlet med natriumbisulfitt og renset for PCR som beskrevet tidligere [31]. De primere for sekvensering av
p21
promoteren var som følger: venstre primer, 5′-GGG AGG AGG GAA GTG TTT TT -3 «og høyre primer, 5′-ACA ACT ACT CAC ACC TCA ACT-3» . PCR-produktene ble ekstrahert gel (Qiagen, Valencia, CA) og ligert inn i en pGEM-T enkel vektor, ved hjelp av TA kloningssystemet (Promega, Madison, WI). Transformerte bakterier DH5a ble dyrket over natten, og plasmid-DNA ble isolert ved anvendelse av et kit (Qiagen). Minst 10 forskjellige kloner ble valgt for sekvensanalyse.
Comet assay
Kometen Analysen ble utført som beskrevet tidligere [24]. I korte trekk, ble mattslipt mikroskopiske objektglass dekket med 0,5% normalt smeltende agarose ved 60 ° C. Omtrent 10
5 5-aza-CDR behandlede eller ubehandlede celler i PBS ble blandet med en lik mengde på 1% lavtsmeltende agarose for å danne en cellesuspensjon. Etter elektroforese, ble lysbilder undersøkt på 600 × forstørrelse og bildene ble tatt med en fluorescens mikroskop (TCS, Leica, Manheim, Tyskland).
Analyse av utelukkelse av inkorporert [
3H] -5-aza- CDR fra DNA
radioaktivt merkede nukleosid-analog inkorporering assay ble utført som beskrevet tidligere med modifikasjoner [32]. [
3H] -5-aza-CDR ble kjøpt fra Moravek Biochemicals (MT1676, 1 mCi /ml, Brea, California). H719 og A549-celler ble behandlet med [
3H] -5-aza-CDR ved 1 pM i 48 timer med eller uten depsipeptide ved 0,1 uM for de siste 6 timer (fra 42 til 48 timer), og cellene ble deretter vasket med kald PBS. Cellene ble deretter byttet ut i [
3H] -5-aza-CDR fritt medium og inkubert i 6, 12 eller 24 timer. Kald trikloreddiksyre (TCA, 50%) ble deretter tilsatt til celleløsning og den TCA-uoppløselig DNA ble plassert på et glassmikrofiberfilter (Whatman, Maidstone, England). Dette glassfilter med TCA-uoppløselig DNA ble plassert i en ampulle for å telle radioaktiviteten med en Beckman LS 5000 væskescintillasjonsteller.
Etablering av cellelinjen med en stabil DNMT1-manglende klon
pCMVneo -DNMT1 anti plasmid ble vennlig levert av Dr. SB Baylin [33]. Vektoren ble transfektert inn i H719-celler ved anvendelse av Qiagen Effectene Transfeksjon kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Tjuefire timer etter den første transfeksjon, ble en andre transfeksjon utført for å forsterke effektiviteten av RNAi, og deretter 800 pg /ml G418 ble tilsatt for å velge stabile celler med DNMT1 antisens.
RNA forstyrre DNMT3A , DNMT3B
RNAi målrettet oligonukleotidsekvenser er som følger: CAT CCA CTG TGA ATG ATA ATT (DNMT3A) og GAT CAA GCT CGC GAC TCT C (DNMT3B) (kjøpt fra Shanghai GeneChem Company). De oligonukleotider for DNMT3A og DNMT3B siRNA ble transfektert inn i cellene ved hjelp lipofektamin 2000 for 48 timer.
Resultater
5-aza-2′-deoxycytidine samarbeider med HDACI å indusere hemming av celleproliferasjon ved en metylering uavhengig mekanisme
Det er blitt rapportert at 5-aza-CDR virker sammen med HDAC-inhibitorer for å synergistisk indusere celledød eller inhibering av celleproliferasjon [7] – [10]. For å undersøke om rollen til 5-aza-CDR involvert i denne synergis hemming av celleproliferasjon når den kombineres med HDACI er epigenetisk, to doble slå ned (DKD) kloner (DKD av DNMT1 /DNMT3A og DKD av DNMT1 /DNMT3B) ble etablert. For å unngå å indusere en forskjell i effektiviteten av transfeksjon når cellene ble transfektert med to vektorer, eller to RNAi oligonukleotider, ble en DNMT1 mangelfull stabil klon først etablert ved transfeksjon av en vektor med antisense DNMT1 cDNA inn i H719-celler og utvalgt med G418. Som vist på fig. 1A, er DNMT1 protein godt slått ned i denne stabil H719 cellelinje. Deretter DKD av DNMT1 /DNMT3A, eller DNMT1 /DNMT3B ble utført ved transfeksjon av DNMT3A eller DNMT3B RNA oligonukleotider inn i DNMT1 knockdown stabile celler. Figur 1B-C viser tydelig at DNMT3A og DNMT3B proteinnivåer ble betydelig redusert etter disse RNAi behandlinger. For å vurdere hvorvidt disse DKDs av DNMTs var effektive for demethylating DNA, metylering status for
p21
Waf1 /Cip1
promoter ble valgt for testing med bisulfite sekvense fordi
p21
Waf1 /Cip1
promoter er høyt metylert i H719 celler [31]. Fig. 1D viser et skjematisk diagram som viser promoter-regionen i
p21
Waf1 /Cip1
og fragmentet utpekt for bisulfitt sekvensering. Som vist på fig. 1E,
p21
Waf1 /Cip1
promoter i H719-celler ble svært metylert (51,25% av CGS i
p21
Waf1 /Cip1
promoter ble metylert i 10 utvalgte kloner ). Men denaturert CGS ble redusert til 23,75%, 21,5% og 12,5% når DNMT1, DNMT1 /DNMT3A og DNMT1 /DNMT3B ble utsatt for doble slå ned med 10 utvalgte kloner (Fig. 1E), noe som indikerer at knockdown av DNMT1 og DNMT3B sammen var den mest effektive for DNA demetylering. Denne reduksjonen i metylering av
p21
Waf1 /Cip1
promoter var tydelig forbundet med uttrykk av p21 som målt med RT-PCR (Fig. 1F).
(A) Representant Western blot indikerer at DNMT1 proteinnivået i H719-celler ble signifikant redusert i DNMT1-manglende stabil klon i forhold til den ikke-spesifikke oligonukleotid-behandlet kontrollgruppe. (B) og (C) Representative Western blot viser også at DNMT3A eller DNMT3B proteinnivå var signifikant redusert etter behandling RNAi i DKD av DNMT1 /DNMT3A celler eller DKD av DNMT1 /DNMT3B celler, respektivt. β-aktin er vist som en lasting kontroll i det nedre panel. (D) En prinsippskisse som viser
p21
Waf1 /Cip1
promoter, med den svarte regionen indikerer fragment som gjennomgikk bisulfite sekvensering (-233-2 i forhold til transkripsjon start stedet). (E) Med bisulfite sekvensering, 10 kloner ble tilfeldig valgt og metylering status for
p21
Waf1 /Cip1
promoter ble bestemt i ubehandlede H719 celler eller i H719 celler behandlet med knockdown av DNMT1, DKD av DNMT1 /DNMT3A eller DKD av DNMT1 /DNMT3B. (F) RNA ble ekstrahert fra H719-celler behandlet med DKD av DNMT1 /DNMT3B, og RT-PCR ble utført for å påvise ekspresjon av p21 mRNA. β-aktin er vist som en lasting kontroll for RT-PCR-analyse.
Et uventet funn var at vi ikke observere en forskjell i celleproliferasjon når H719 celler med DKDs eller TKDs (knockdown av DNMT1 /3A /3B) ble behandlet med eller uten depsipeptide og analysert med MTT (fig. 2A). I motsetning til dette ble celleproliferasjon signifikant redusert i begge A549 og H719-celler som ble behandlet med 5-aza-CDR og HDACI depsipeptide /TSA, selv om 5-aza-CDR alene og depsipeptide /TSA alene hadde liten effekt på inhibering av celleproliferasjon hos doser brukt (fig. 2B-C). Imidlertid, 5-aza-CDR-indusert hemming av celleproliferasjon ble cellelinje avhengig. For eksempel, viste 5-aza-CDR en tydelig virkning ved hemming av proliferasjonen av A549-celler (fig. 2C), men hadde ingen effekt i H719-celler (Fig. 2B). Disse forskjeller i 5-aza-CDR-indusert effekt på celleproliferasjon mellom A549 og H719-celler resulterte fra den p53 status for de behandlede celler [24]. A549 celler har en villtype p53, mens H719 celle p53 er mutert [31]. I tillegg, selv prokain har blitt rapportert å være en demethylating middel [34], synergistisk inhibering av celleproliferasjon ble ikke observert når H719-celler ble behandlet med prokain (0,5 mM i 72 timer) og depsipeptide (0,1 uM i 6 timer ved 66- 72 timer) eller TSA (1 uM i 6 timer ved 66-72 timer) (fig. 2D). Disse dataene tyder på at rollen av 5-aza-CDR og dens synergistisk effekt med HDACI i indusering av inhibering av celleproliferasjon ikke kan resultere fra dets demethylating funksjon.
(A) H719-celler med mangelfull DNMT1, DKD av DNMT1 /DNMT3A, DKD av DNMT1 /DNMT3B, eller TKD (trippel knockdown) av DNMT1 /DNMT3A /DNMT3B ble behandlet med eller uten depsipeptide på 0,1 mikrometer i 6 timer, og celleproliferasjon ble testet med MTT analysen. (B) og (C) 5-aza-CDR (1 uM i 72 timer) samvirker med HDAC-inhibitor depsipeptide (0,1 uM for de siste 6 timer) eller TSA (1 uM for de siste 6 timer) for å synergistisk induserer inhibering av celle spredning i H719 (B) eller A549-celler (C). (D) H719-celler ble behandlet med prokain (0,5 mM) i 72 timer, og depsipeptide (0,1 uM for de siste 6 timer) eller TSA (1 uM for de siste 6 timer) ble deretter tilsatt til de behandlede celler. Alle data er resultatet av to separate eksperimenter.
5-aza-CDR induserer cytotoksisitet ved inkorporering i DNA som en nukleosid analog
Det er vel kjent at 5-aza-CDR fosforyleres til trifosfatformen sin i cellene, og deretter inkorporert i DNA i løpet av replikasjonen [18]. For å undersøke graden av 5-aza-CDR-inkorporering i celler, [
3H] -5-aza-CDR ble tilsatt til A549 eller H719-celler i 24 timer, og DNA ble deretter ekstrahert med TCA utfelling. Radioaktivitet per pg DNA ble målt. Som vist på fig. 3A-B, inkorporering av [
3H] -5-aza-CDR i DNA var konsentrasjonsavhengig i begge cellelinjer. Innlemmet radioaktivitet per mikrogram DNA på 0,1 mikrometer og 1fiM av [
3H] -5-aza-CDR økt ~2- og ~12 ganger i henholdsvis H719 celler, og ~10- og ~110 ganger i henholdsvis A549 celler når sammenlignet med radioaktiviteten på 0,01 uM [
3H] -5-aza-CDR i begge cellelinjer.
(A) H719 eller (B) A549 celler ble inkubert med [
3 H ] -5-aza-CDR i 24 timer ved forskjellige konsentrasjoner og deretter vasket med kald PBS. Cellene ble inkubert i friskt medium i ytterligere 24 timer, og DNA ble deretter felt ut med kald TCA. Radioaktivitet ble målt og relativ radioaktivitet pr ug ble tellet. Samme mengde DNA ble applisert og kjørt ved 1% agarosegel ved 100 V i 5 minutter som lastekontroll, som er vist ved øvre panel på fig. 3A og fig. 3B, respektivt. Resultatene som presenteres er fra to separate forsøk (gjennomsnitt ± SD) DNA-skade indusert av 5-aza-CDR i H719-celler ble bestemt ved komet analysen. (C) Ubehandlet kontroll, (D) 5-aza-CDR ved 0,1 uM i 72 timer, og (E) 5-aza-CDR ved 1 pM i 72 timer.
Det var et forhold mellom innlemmet 5-aza-CDR og DNA-skade som bestemmes med kometen analysen. Figur 3C-E viser at 5-aza-CDR oppviste en doseavhengig kapasitet for DNA-skade i A549-celler, noe som ble demonstrert ved nærvær av en DNA-hale. Større DNA hale området og lenger DNA hale lengde representerer større DNA-skader. Tabell 1 viser en statistisk analyse av komet analyse som sammenligner 5-aza-CDR behandlede prøvene til en ubehandlet kontroll. Disse data paralleller innlemmet mengde 5-aza-CDR, og antyder at 5-aza-CDR spiller en rolle i cytotoksisitet ved inkorporering i DNA.
Som apoptose kan også gi et positivt resultat i kometmetoden [35], høstet vi 5-aza-CDR behandlede celler og utført flowcytometri analyse for å finne ut om fem-aza-CDR-indusert DNA skade utløser apoptotisk celledød. Cellene med DNA-innhold mindre enn den for G
0 /G
1 (region av M1 i figur 4) anses å være apoptotiske celler. Som vist på fig. 4, 5-aza-CDR induserte ikke apoptose i A549-celler ved 0,1 um (fig. 4B) eller 1 uM i 72 timer (fig. 4C). I tillegg ble A549-celler ble behandlet med 5-aza-CDR ved 1 pM i 48 timer eller 72 hrsand protein ble ekstrahert for Western blotting ved anvendelse av anti-PARP (spalting av PARP er et kjennetegn på apoptose). Fig. 4D viser at 5-aza-CDR ikke indusere apoptotisk celledød på begrensede doser. Disse dataene indikerer at 5-aza-CDR alene på begrensede doser er ikke i stand til å indusere apoptose og dermed positivt resultat i kometanalyseresultatene hovedsakelig fra 5-aza-CDR indusert DNA skade.
(A-C ) for å finne ut om 5-aza-CDR-indusert DNA-skader induserer hemming av celleproliferasjon via apoptotisk celledød, ble en flowcytometri analyse utført. Ubehandlede A549-celler (A) eller A549-celler ble behandlet med 5-aza-CDR ved 0,1 um (B) eller ved en uM i 72 timer (C), og cellene ble deretter høstet for farging med propidium jodid (PI). DNA-innhold med mindre enn G
0 /G
1 ble betraktet som apoptotisk DNA (område av M1). (D) A549-celler ble behandlet med 5-aza-CDR 1 uM i 48 eller 72 timer, og proteinet ble ekstrahert for Western blotting ved anvendelse av anti-PARP å detektere PARP-spaltning i celler behandlet med 5-aza-CDR. En apoptotisk positiv kontroll ble vist på kjørefelt av til høyre, der det er to band som indikerer PARP (116 KD) og PARP cleavaged (85 KD).
Generelt DNA-skadelige stoffer indusere DNA enkelttrådsbrudd (SSB) eller dobbel tråd pauser (DSB). For å finne ut hvilken type DNA skader indusert av 5-aza-CDR, utførte vi Western blotting ved hjelp av anti-RPA (replikering protein A) eller γ-H2AX. De fleste DNA-ødeleggende midler indusere cellulære responser gjennom aktivering av ATR (ATM og Rad3-relatert) [36] – [40], og aktivering av ATR er i stor grad avhengig av en mellomliggende molekyl RPA [41], [42]. Chromatin ble hentet fra fem-aza-CDR behandlet H719 celler og kromatin-bundet RPA innholdet ble bestemt. Fig. 5A viser at kromatin-bundet RPA ble økt som følge av økt 5-aza-CDR, noe som indikerer at 5-aza-CDR indusert DNA skade kan være enkelt-strand pauser (SSB). På den annen side, er γ-H2AX anses å være et kjennetegn på DNA dobbel-tråd pauser (DSB) [43], og Western blotting ble derfor utført ved hjelp av maur-γ-H2AX å utelukke muligheten for 5-aza-CDR indusert DSB. Fig. 5B viser at 5-aza-CDR på en μ ikke indusere DSB. Imidlertid, 5-aza-CDR ved høyere konsentrasjon (mer enn 5 uM) induserte en doseavhengig DSB (data ikke vist). Disse data viser at 5-aza-CDR-induserte DNA-SSB eller DSB er doseavhengig. I denne studien ble 5-aza-CDR nesten alltid anvendes ved lavere doser (1 uM) og dermed den 5-aza-CDR-induserte DNA-skade er SSB.
(A-B) H719-celler ble behandlet med 5-aza-CDR (0,1-1 uM) i 48 timer, og cellulære ekstrakter, inkludert kromatin fraksjon (A, Chr) og oppløselige fraksjon (B, Sol) ble isolert for Western blotting for å detektere endringer i RPA70 og RPA32. Bandet intensiteten av ubehandlet prøve ble satt til 1. Den numeriske verdien av hver prøve representerer prosentandelen av båndet intensitet i forhold til den for ubehandlet prøve. (C) H719-celler ble også behandlet med 5-aza-CDR ved 1 uM til 24, 48 eller 72 timer, og protein ble deretter ekstrahert for Western blotting ved anvendelse av anti-γ-H2AX. Cellene ble behandlet med doksorubicin ved en mikrometer i 24 timer som en positiv kontroll (høyre kjørefelt).
Depsipeptide hemmer spesifikt fjerning av innlemmet 5-aza-CDR og forbedrer nukleosid analog indusert cytotoksisitet
Fordi DNA-skade indusert ved lav dose av 5-aza-CDR er reversibel, er det spesielt viktig å forstå hvordan HDAC-inhibitor forbedrer 5-aza-CDR-indusert toksisitet. I tillegg, som sekvensiell behandling av 5-aza-CDR og HDAC hemmer er mer effektive i å indusere celledød [44], ble vi ledet til å vurdere om HDACI øker opptaket av 5-aza-CDR i DNA eller reduserer fjerning av innarbeidet 5- aza-CDR fra DNA, og dermed forsterke 5-aza-CDR-indusert cytotoksisitet. Først depsipeptide (0,1 uM) og [
3H] -5-aza-CDR (1 uM) ble lagt sammen til A549-celler for en første 6 timer, og cellene ble deretter kontinuerlig dyrket i medium med [
3H] -5-aza-CDR alene i ytterligere 42 timer. Radioaktivitet ble tellet i 0-24 timer etter at cellene ble inkubert i en radioaktivitet fritt medium. Ved å sammenligne prøvene som er behandlet med [
3H] -5-aza-CDR alene til prøvene behandlet med [
3H] -5-aza-CDR pluss depsipeptide, ble observert noen forskjell i radioaktivitet, noe som indikerer at depsipeptide ikke fremmer inkorporering av [
3H] -5-aza-CDR i DNA (fig. 6A). For å teste om depsipeptide påvirker fjerning av innlemmet 5-aza-CDR, et forfall analyse av inkorporert [
3H] -5-aza-CDR ble utført i A549 celler. Celler ble behandlet med [
3H] -5-aza-CDR ved 1 uM i 48 timer, med og uten depsipeptide på 0,1 pM for de siste 6 timer av behandlingen, og cellene ble deretter vasket og erstattet i friskt medium ( uten eksperimentelle tester) for 6, 12 og 24 timer. Figur 6A viser at innlemmet [
3H] -5-aza-CDR redusert gradvis under inkubasjon i [
3H] -5-aza-CDR fritt medium. Radioaktivitet per pg DNA ved 6, 12 og 24 timer i celler behandlet med [
3H] -5-aza-CDR alene, for eksempel, ble redusert til 78,44 ± 7,08%, 57,5 ± 3,88% og 36,05 ± 1,79%, respektivt , sammenlignet med radioaktiviteten i begynnelsen av inkubasjonen. Dette gjenspeiler fjerning av [
3H] -5-aza-CDR fra DNA. Men tilsetning av depsipeptide betydelig grad utsatt fjerning av [
3H] -5-aza-CDR fra DNA, og radioaktiviteten per pg DNA ved 6, 12 og 24 timer var 80,3 ± 13,21%, 78,71 ± 12,72% og 82,5 ± 20,47%, respektivt, sammenlignet med radioaktiviteten i begynnelsen av inkubasjonen. Denne reduksjonen depsipeptide indusert i fjerning av [
3H] -5-aza-CDR var også avhengig av depsipeptide konsentrasjon. For eksempel, radioaktiviteten av celler behandlet med [
3H] -5-aza-CDR og depsipeptide ved 0,05 uM, 0,1 uM og 0,2 uM viste 1.8-, 2.7- og 3,25-doble økninger henholdsvis enn den for celler behandlet med [
3H] -5-aza-CDR alene (fig. 6B). I tillegg har 5-aza-CDR-induserte DNA-skade også gradvis gjenopprettet når cellene ble dyrket i en 5-aza-CDR fritt medium. Lengden og tverrsnittet av DNA halen indusert av 5-aza-CDR var kortere og mindre når cellene ble dyrket i 5-aza-CDR fritt medium i 12 timer sammenlignet med de celler uten medikamentfritt inkubering (Fig. 6C-E ). Denne prosessen med utvinning fra 5-aza-CDR-induserte DNA-skade ble signifikant undertrykt av depsipeptide, slik at lengden og arealet av haler i komet analysen var lenger og større når cellene ble behandlet med 5-aza-CDR og depsipeptide sammen ( fig. 6F-H). Den depsipeptide-indusert undertrykkelse av utvinning fra 5-aza-CDR-induserte DNA-skade er oppsummert i tabell 2. Disse data antyder at HDAC-inhibitor kan undertrykke utvinning fra 5-aza-CDR-induserte DNA-skade og synergistisk induserer inhibering av celleproliferasjon.
(A) H719 celler ble inkubert med [
3H] -5-aza-CDR for 48 timer, med tilstedeværelse eller fravær av depsipeptide 0.1 mikrometer for de første 6 timer (depsipeptide + [
3H] -5-aza-CDR) eller siste 6 timer ([
3H] -5-aza-CDR + depsipeptide) og deretter vasket med kald PBS. Cellene ble erstattet i friskt medium for ytterligere inkubasjon i forskjellige intervaller og DNA ble deretter ekstrahert med kald TCA. Relativ radioaktivitet i hver prøve ved forskjellige tidspunkter ble sammenlignet med radioaktiviteten i cellene ved begynnelsen av inkubasjonen. (B) H719-celler ble behandlet med [
3H] -5-aza-CDR i 48 timer, og depsipeptide ved 0,05, 0,1 og 0,2 uM ble deretter tilsatt til cellene for de siste 6 timer. Ved 24 timer etter inkubering ble cellene høstet og radioaktivitet ble tellet. Samme mengde DNA ble applisert og kjørt ved 1% agarosegel ved 100 V i 5 minutter som lastekontroll, som er vist ved øvre panel på fig. 6A og fig. 6B, respektivt. (C-E) Comet analyse viser at 5-aza-CDR-induserte DNA-skader gjenvinnes når de behandlede celler ble inkubert i 5-aza-CDR fritt medium i 12 timer. (C) Ubehandlet kontroll, (D) 5-aza-CDR på en mikrometer i 24 timer uten inkubasjon, og (E) 5-aza-CDR på en mikrometer i 24 timer, etterfulgt av vasking for ytterligere inkubasjon i et rusfritt medium i 12 timer. (F-H) Gjenvinning av DNA-skade indusert av 5-aza-CDR ble inhibert ved behandling depsipeptide (0,1 uM for de siste 6 timer). (F) Depsipeptide behandlede celler (0,1 mM) i 6 timer, (G) Celler ble behandlet med 5-aza-CDR (1 uM i 24 timer) og depsipeptide (0,1 uM for siste 6 timer) uten inkubering, eller (H) celler behandlet som ovenfor og videre inkubert i et rusfritt medium i 12 timer.
HDAC hemmer handlet selektivt med nukleotid analog å indusere hemming av celleproliferasjon
for å finne ut enten HDACI selektivt forsterker NA-indusert cytotoksisitet, ble H719-celler behandlet med Ara-C, et annet cytidin analog, og depsipeptide eller TSA ble deretter tilsatt til cellene for å observere forandringer i celleproliferasjon analysert med MTT. Det var interessant at både depsipeptide og TSA betydelig forbedret Ara-C-induserte inhibering av celleproliferasjon (fig. 7A-B). Men denne synergistisk inhibering av celleproliferasjon ble ikke observert i celler behandlet med depsipeptide og andre DNA-skade induktorer som γ-ray (fig. 7C), UV (Fig. 7D), cisplatin (fig. 7E) eller etoposid (Fig . 7F). Disse dataene tyder på at HDACI selektivt virker i samspill med NRS for å indusere inhibering av celleproliferasjon.
(A) H719-celler, eller (B) A549-celler ble behandlet med Ara-C ved 0,1 uM i 72 timer i nærvær eller fravær av HDACI (depsipeptide 0,1 uM eller TSA 2 uM for de siste 6 timer). Cellene ble deretter vasket og videre inkubert i 24 timer for MTT-assay. (C) Effekt av interaksjonen av HDACI og bestråling ved 2 Gy ble bestemt ved MTT-analyse. H719-celler ble bestrålt ved 2 Gy, eller behandlet med depsipeptide ved 0,1 uM, eller TSA ved 2 uM i 6 timer alene eller i kombinasjon. (D) H719-celler ble også behandlet med UV ved 128 J /m
2, med eller uten depsipeptide behandling.
