Abstract
Formål
microRNAs har dukket opp som viktige regulatorer av genuttrykk, og deres endrede uttrykket har vært forbundet med tumorigenesis og tumor progresjon. Dermed microRNAs har potensial som både kreft biomarkører og /eller potensielle nye terapeutiske mål. Selv akkumulere bevis tyder på rollen som avvikende mikroRNA uttrykk i livmorkreftutvikling, er det fortsatt begrensede data tilgjengelig om den prognostiske betydningen av microRNAs i livmorkreft. Målet med denne studien er å undersøke den prognostiske verdien av utvalgte nøkkel microRNAs i livmorkreft ved analyse av arkivformalinfiksert parafin-embedded vev.
Experimental Design
Total RNA ble ekstrahert fra 48 paret normale og endometrial vevsprøver ved hjelp Trizol basert tilnærming. Uttrykket av MIR-26a, la 7g, MIR-21, MIR-181b, MIR-200c, MIR-192, MIR-215, MIR-200c, og MIR-205 ble kvantifisert ved sanntid QRT-PCR uttrykk analyse. Mål av forskjellig uttrykt mirnas ble kvantifisert ved hjelp av immunhistokjemi. Statistisk analyse ble utført av GraphPad Prism 5.0
Resultater
uttrykk nivåer av MIR-200c (P 0,0001). Og MIR-205 (P 0,0001) var signifikant økt i endometrial svulster sammen til normale vev. Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse viste at høye nivåer av MIR-205 ekspresjon var assosiert med dårlig pasient total overlevelse (risikoforhold, 0,377; Logrank test, p = 0,028). Videre redusert uttrykk for en MIR-205 mål PTEN ble oppdaget i endometriekreft vev sammenlignet med normalt vev.
Konklusjon
MIR-205 har en unik potensial som en prognostisk biomarkør i livmorkreft.
Citation: Karaayvaz M, Zhang C, Liang S, Shroyer KR, Ju J (2012) Prognostic Betydningen av MIR-205 i livmorkreft. PLoS ONE 7 (4): e35158. doi: 10,1371 /journal.pone.0035158
Redaktør: J. Christopher stater, University of Louisville, USA
mottatt: 21 november 2011; Godkjent: 13 mars 2012; Publisert: 13 april 2012
Copyright: © 2012 Karaayvaz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Stony Brook University Translasjonell Research Laboratory Oppstart fondet (Dr. Ju), R01CA155019 (Dr. Ju) og R33CA147966 (Dr. Ju). Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den vanligste kreftformen av det kvinnelige kjønnsorgan i USA [1]. Den samlede fem års overlevelse for livmorkreft er ca 80% blant alle ledd. Selv om det har en relativt lav dødelighet sammenlignet med andre gynekologiske kreftformer, enkelte histologiske typer er meget inngripende, ofte metastatisk og har dårlig overlevelse. Den mest dominerende subtype, endometrioid livmorkreft (EØF) står for ca 80% av tilfellene. Kirurgi er typisk kurativ med de fleste av disse tilfeller diagnostisert på et tidlig stadium. I motsetning til pasienter med avansert stadium eller nonendometrioid livmorkreft har en tendens til å vise mer aggressive egenskaper og har en mye dårligere prognose [2]. Selv om morfologiske endringer reflektere viktig innsikt i livmorkreft, det er et presserende behov for svært sensitive og spesifikke molekylære prognostiske biomarkører for å bedre forutsi utfallet av livmorkreft, særlig i mer enn 25% av de endometrioid endometrial svulster med høy risiko for å utvikle mer aggressive sykdommer.
Nylig har molekylære studier identifisert mikro ustabilitet og mutasjoner i PTEN, K-ras, beta-catenin, p53, HER-2 /neu, p16 og E-cadherin gener i tilfeller av livmorkreft [ ,,,0],3]. Særlig har forekomsten av PTEN mutasjoner blitt rapportert å være den høyeste blant andre genetiske endringer som finnes i 34-55% av livmorkreft [4] – [6]. PTEN er en viktig tumor suppressor i endometrial cancer, og identifikasjonen av disse molekylære omleiringer kan hjelpe til bedre forståelse av endometrial cancer biologi og kan også føre til oppdagelse av nye molekylære mål for deteksjon, prognose og behandling. Selv om disse genetiske endringer har blitt beskrevet som viktig, de er ikke universelt stede i alle tilfeller som tyder på at epigenetiske mekanismer (for eksempel microRNAs) kan også være involvert.
microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA-molekyler fra 19-25 nukleotider som regulerer genekspresjon post-transkripsjonelt gjennom binding til den 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av mål-mRNA, forårsaker mRNA spalting, translasjonell undertrykkelse, eller mRNA degradering [3], [7] har mirnas blitt funnet å regulere mange kritiske cellulære prosesser, inkludert apoptose [8] – [11], differensiering [12] – [14], og celleproliferasjon [8], [13], [15], [16]. Avvikende ekspresjon av mirnas er observert i de fleste tumortyper, noe som indikerer en rolle i karsinogenese og et potensial som prognostiske /diagnostiske biomarkører i kreft [17], [18]. Vi grunn at mirnas kan anvendes som en bedre klasse av biomarkører på grunn av deres brede regulatoriske funksjoner. I tillegg er den overlegne stabiliteten av mirnas i formalinfikserte parafininnstøpte (FFPE) vev og forskjellige kroppsvæsker (f.eks, plasma, serum) ytterligere forenkler den kliniske nytten av mirnas.
En rekke nyere studier har rapportert uttrykket profiler av mirnas i livmorkreft [19] – [26]. I denne studien ønsket vi å undersøke den prognostiske verdien av miRNAs bruker arkiv FFPE- prøver av livmorkreftpasienter. Vi kvantifisert systematisk uttrykk for kandidat mirnas involvert i kritiske cellulære prosesser som cellesykluskontroll, chemoresistance, celledød og EMT overgang (MIR-26a, la 7g, MIR-21, MIR-181b, MIR-192, MIR-215 , MIR-200c, og MIR-205) ved hjelp av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse. Disse mirnas ble valgt basert på deres kritiske målgener som er forstyrret i løpet av livmorkreftutvikling (f.eks p53, K-ras, PTEN) [27] – [32]. Våre resultater viser at uttrykket nivåer av MIR-200c og MIR-205 var betydelig overuttrykt i endometrial cancer. Men bare uttrykk for MIR-205 ble signifikant assosiert med pasientens overlevelse. Tidligere studier har identifisert PTEN som en av de direkte mål av MIR-205 [33], [34]. Tatt i betraktning betydningen av PTEN i livmorkreft biologi, hypotese vi at MIR-205 mediert PTEN hemming mekanisme kan ha en
in vivo
fysiologisk relevans i livmorkreft. Faktisk har våre resultater viste at uttrykket nivåer av MIR-205 ble signifikant negativt korrelert med uttrykket nivåer av PTEN. Som et resultat av våre funn tyder på at Mir-205 kan holde et unikt potensial som en biomarkør for prognosen for livmorkreft.
Resultater
Uttrykk av miRNAs i human livmorkreft og evaluering av deres prognostiske verdier
de clinicopathologic parametere av de 48 endometrial kreftpasienter brukt i denne studien er beskrevet i Tabell 1. Halvparten av pasientene hadde endometrioid karsinom, og de gjenværende pasientene ble diagnostisert med nonendometrioid histologi (13 serøs karsinom, 5 klarcellet karsinom, 5 ondartet blandet Mullerian svulst (MMMT), og en udifferensiert karsinom). Av disse pasientene 26 tilfellene hadde trinn I (54%), fire tilfellene hadde trinn II (8%), 6 tilfeller hadde stadium III (13%), og 12 tilfellene hadde stadium IV (25%) av sykdommen. For å undersøke den kliniske betydningen av de valgte miRNAs i disse livmorkreftpasienter, vi tallfestet sine uttrykk nivåer fra 48 parede arkiv svulst og prøver normale FFPE- vev ved hjelp av sanntids QRT-PCR-analyse. Av de mirnas testet, var det ingen signifikant forskjell i uttrykket nivåer av MIR-26a, la 7g, MIR-21, MIR-181b, MIR-192, og MIR-215 mellom tumorvev og tilsvarende normale prøver (p = 0,742 ; P = 0,91; P = 0,641; P = 0,313; P = 0,106; P = 0,336, henholdsvis) (figur 1A-F). I motsetning til ekspresjonen av både MIR-200c (P 0,0001, figur 1G) og MIR-205 (P 0,0001, figur 1 H) var signifikant oppregulert i endometriekreft prøvene i forhold til tilstøtende normale vev. For ytterligere å analysere betydningen av MIR-200c og MIR-205 i form av klinisk prognose, ble Kaplan-Meier overlevelsesanalyse utført ved hjelp av pasientens total overlevelse (figur 2). Våre resultater indikerer at uttrykk nivåer av MIR-205 var signifikant assosiert med pasientens overlevelse. Pasienter med lave nivåer (cut-off 15-fold av MIR-205) hadde en tendens til å ha bedre overlevelse enn pasienter med høye nivåer av Mir-205 (hazar ratio, 0,377, Logrank test, P = 0,028) (figur 2B). Dette underbygger at forhøyede nivåer av MIR-205 i tumorvev kan føre til verre overlevelse i livmorkreftpasienter. Men uttrykket nivåer av MIR-200c ble ikke assosiert med pasientens overlevelse (P = 0,576; figur 2A).
Relativ kvantifisering av miRNAs ble uttrykt som normalisert med en intern kontroll RNU6B genet. (A) MIR-26a uttrykk (P = 0,742). (B) la-7g uttrykk (p = 0,91). (C) MIR-21 uttrykk (P = 0,641). (D) MIR-181b uttrykk (P = 0,313). (E) MIR-192 uttrykk (P = 0,106). (F) MIR-215 uttrykk (P = 0,336). (G) MIR-200c uttrykk (P 0,0001). (H) MIR-205 uttrykk (P 0,0001). Statistisk signifikans ble beregnet ved en sammenkoblet t-test.
. Kaplan-Meier generelle overlevelseskurver ble plottet basert på miRNA uttrykk. (A) speil 200c uttrykket (P = 0,576, Logrank test). (B) MIR-205 uttrykk (P = 0,028, Logrank test).
Korrelasjonen av MIR-205 og PTEN uttrykk i livmorkreftpasienter
Det har blitt rapportert at MIR-205 er rettet mot en kritisk tumorsuppressorgen PTEN [33], [34], som er hyppig mutert eller slettes i livmorkreft [4] – [6]. Imidlertid kan genetiske forandringer ikke gjøre rede for alle PTEN proteintap observert i endometrial carcinoma, sterkt antyder involvering av en post-transcriptional regulering i PTEN uttrykk [35], [36]. Siden uttrykket nivåer av MIR-205 ble forhøyet i tumorvev, begrunnet vi at økt hemming av PTEN av MIR-205 kan være en fysiologisk relevant mekanisme under livmorkreftutvikling. For å undersøke en
in vivo
forholdet mellom MIR-205 og PTEN protein uttrykk, bygget vi microarray (TMA) fra arkiv FFPE- vevsprøver og utført immunhistokjemi med PTEN 6H2.1 antistoff på seksjonert TMA. Våre resultater tyder på at PTEN-protein-ekspresjon ble redusert i endometrial cancer i forhold til normal endometrium. Figur 3A viser at median uttrykk for PTEN var betydelig lavere i tumorvev (median scorer 85) sammenlignet med normalt vev (median scorer 132) (P = 0,0058). Figur 3 (B-E) viser eksempler på PTEN flekker i normal endometrium (3B), endometrioid karsinom (3C), serøs karsinom (3D), og klar cell carcinoma (3E).
(A) Spredeplottingen av farging score for PTEN i normal endometrium og livmorkreft beregnes ved å kvantifisere fargeintensitet ved hjelp ImageJ programvare. Barer representerer median for hver kategori (normal median = 85, tumor median = 132). (B-E) PTEN protein uttrykk er oppdaget i normal endometrium (B), endometrioid karsinom (C), serøs karsinom (D), og klar cell carcinoma (E) som oppdages ved immunhistokjemi.
For ytterligere å bekrefte den inverse forholdet mellom MIR-205 og PTEN uttrykk, utførte vi en ikke-parametrisk Spearman korrelasjonsanalyse ved hjelp av de sakene som har både MIR-205 og PTEN protein kvantifisering data. Våre resultater tyder på tilstedeværelsen av en invers korrelasjon i 69% av tilfellene (Spear korrelasjonskoeffisient = -0,502, P = 0,034) (figur 4A). Figur 4B og 4C viser eksempler på PTEN flekker ledsaget av Mir-205 uttrykk nivåer i enkeltsaker. Figur 4B viser en udifferensiert karsinom med høy PTEN flekker og bare en liten oppregulering i MIR-205 uttrykk mellom svulst og tilstøtende normalt vev (~1.25 fold). Figur 4C viser en klar cellekreft med svært lav PTEN farging og ~350 fold up-regulering i MIR-205 uttrykk mellom svulst og tilstøtende normalt vev.
(A) Korrelasjonen av MIR-205 og PTEN uttrykk ble analysert etter to-tailed Spearman nonparametric korrelasjon test (P = 0,034, Spearman korrelasjonskoeffisient = -0,502). PTEN protein uttrykk ledsaget av Mir-205 uttrykk (i tre eksemplarer) er illustrert i enkeltsaker; udifferensiert karsinom (B), og klar cell carcinoma (C).
Til slutt, for å støtte vår hypotese om at redusert PTEN protein uttrykk er formidlet av en post-transcriptional kontroll, vi kvantifisert PTEN mRNA nivåer ved hjelp av real -Tid QRT-PCR. Våre resultater tyder på at PTEN mRNA-ekspresjonsnivåer i endometriekreft prøver viste ingen forskjell i forhold til tilstøtende normale vev (figur 5). Disse resultatene tyder på at mangelen på korrelasjon av PTEN mRNA med tap av PTEN protein i livmorkreft var sannsynligvis på grunn av en post-transkripsjonelt regulert mekanisme.
Relativ kvantifisering av PTEN mRNA ble uttrykt som normalisert med en intern kontroll β-aktin-genet (p = 0,31). Statistisk signifikans ble beregnet ved en sammenkoblet t-test.
Diskusjoner
I denne studien har vi identifisert betydelig over uttrykt MIR-200c og MIR-205 i livmorkreft sammenlignet med normal endometrievev (figur 1). Dette funnet er i samsvar med mange andre studier rapporterer forhøyede nivåer av disse to mirnas i forskjellige typer av livmorkreft [19] – [24], [26]. Derfor foreslår vi at over uttrykk signatur av disse miRNAs i livmorkreft er ikke spesifikke for histologisk type. Chung
mfl.
Rapporterte at avvikende uttrykk for MIR-205 ble korrelert med avansert stadium i livmorkreft [22]. Men våre resultater viste at Mir-205 uttrykk ikke var relatert til scenen sykdom eller tumor type (Figur S1). Vi oppdaget at Mir-205 uttrykk var signifikant assosiert med pasientene, overlevelse, slik at pasienter med høyere nivåer av MIR-205 har en tendens til å ha en lavere overlevelse fenotype (figur 2). Våre resultater støtter en forestilling om at MIR-205 kan ha potensial som en biomarkør for den negative prognosen for livmorkreft og terapeutiske tilnærminger rettet mot forhøyede nivåer av MIR-205 bør utforskes som en ny tilnærming for å forbedre kliniske resultater.
Mir-200 familie og MIR-205 har også blitt rapportert å være dysregulerte i andre typer kreft. MIR-200-familien har blitt rapportert å være oppregulert i eggstokkreft og kolangiokarsinom [37] – [39], men nedregulert i leverkreft, brystkreft og nyrecellekarsinom [40] – [42]. I motsetning til dette har MIR-205 blitt rapportert å være oppregulert i ovarie, blære, og brystkarsinomer [37], [43], [44], men nedregulert i prostata og esophageal-kreft [45], [46] . Disse forskjellige uttrykk mønstre i noen typer kreft kan gjenspeile tilstedeværelsen av tumortypespesifikke mekanismer som er mediert av regulatoriske mirnas. Den mest kjente funksjonen til MIR-200 familie og MIR-205 er deres evne til å regulere uttrykket av E-cadherin transkripsjons repressors ZEB1 (også kjent som δEF1) og SIP1 (også kjent som ZEB2), faktorer som er viktige for epitelial mesenchymale overgang (EMT) og tumormetastase [32]. Men MIR-200 familie og MIR-205 funksjon som tumor suppressors gjennom hemming av EMT. Siden uttrykket av disse miRNAs er økt i tumorprøver, begrunnet vi at andre proteiner målrettet av disse miRNAs kan være involvert i livmorkreft. En av de rapporterte målene for MIR-205 er en kritisk tumorsuppressorgen, PTEN [33], [34].
PTEN ekspresjon har blitt rapportert å være redusert i endometriet [4], slik at det har en kritisk rolle i endometrial cancer biologi [35], [36], [47], [48]. Men mutasjoner /sletting av PTEN er ikke den eneste årsaken til redusert PTEN uttrykk. Snarere epigenetiske mekanismer, som for eksempel promoteren metylering, økt PTEN proteindegradering eller regulering gjennom mirnas er også viktig [49]. Med dette i tankene, vi analysert uttrykket nivåer av PTEN mRNA og protein i livmorkreftpasienter. Vi har vist at, selv om det ikke var noen endring i ekspresjonen av mRNA PTEN, ble ekspresjon av PTEN protein ble redusert i tumorvev sammenlignet med tilstøtende normale vev. Dette støtter hypotesen om at en post-transcriptional regulering av PTEN, muligens mediert av mirnas, er gyldig. Sammen med rapportene som PTEN er direkte mål av MIR-205, våre resultater støtter den potensielle rolle MIR-205 i regulering PTEN i livmorkreft.
Generelt, en nedgang i PTEN uttrykket er assosiert med endometriod karsinom og kan være et nyttig biomarkør for å skille endometrioid karsinom fra serøs karsinom [4]. Imidlertid har andre studier rapporterte ingen signifikant forskjell i PTEN ekspresjon, noe som tyder på at PTEN kanskje ikke alltid være hensiktsmessig å skille disse tumor subtypene [50], [51]. Derfor forblir den kliniske nytten av PTEN som en biomarkør som skal bestemmes. Vi grunn at MIR-205 kan være en overlegen biomarkør enn PTEN grunn av sin brede innflytelse på flere mål og veier.
I sammendraget, våre resultater tyder på at uttrykket av MIR-205 og PTEN er omvendt korrelert i livmor kreftpasienter, noe som tyder på den fysiologiske betydningen av MIR-205 mediert PTEN hemming mekanisme i livmorkreft biologi. Enda viktigere er det uttrykk for MIR-205 i forbindelse med livmorkreft pasient overlevelse. Dermed grunn vi at MIR-205 kan regulere PTEN og andre protein uttrykk i patogenesen av livmorkreft. Fremtidige studier er åpenbart nødvendig å fullt validere den kliniske nytten av MIR-205 som prognostisk biomarkør med multisenter store livmorkreftpasient kohorter.
Materialer og Metoder
Etikk
Klinisk prøve kohort brukt i denne studien ble godkjent av Institution Review Board of Stony Brook University Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra alle deltakerne i studien.
Pasienter og Prøver
Godkjenning fra Institution Review Board ble oppnådd for både innsamling av vev og bruk av arkivformalinfiksert parafin innebygd (FFPE) vevsblokker. For RNA ekstraksjon, tumorprøver og de tilstøtende normale vev ble oppnådd fra 48 endometriekreft pasienter som gjennomgikk hysterektomi ved Stony Brook University Hospital, Stony Brook, NY. Karakteristikkene for disse pasientene er vist i tabell 1. For immunhistokjemi, ble tumorvev oppnådd fra 47 endometrielle kreftpasienter og ikke-patologiske endometriale vev som normale kontroller ble oppnådd fra fem ikke-endometrial kreftpasienter. Parafinblokker inneholder formalinfikserte prøver av vev (FFPE) ble kjøpt fra arkiv samlinger av Avdeling for patologi og brukes for senere analyser. Prøvene ble valgt 1995-2010 med opp til 15 års klinisk oppfølging informasjon.
microarray (TMA)
Tissue microarrays ble fremstilt fra FFPE- blokker hysterektomi prøver. Hematoxylin og eosin farget seksjoner fra alle tilfellene ble nøye gjennomgått. For hvert tilfelle, ble deler av livmorkreft og normal endometrium utpekt. Ved hjelp av Advanced Tissue Arrayer (modell: ATA-100, Millipore, Billerica, MA, USA), med en nål diameter på 1,5 mm, tre kjerner ble tatt ut fra området av tumor og tre kjerner ble fjernet fra godartet endometriet for hvert enkelt tilfelle. Kjernene ble innebygd i en parafin vev microarray blokk i forhåndsbestemte posisjoner, med opptil 60 kjerner i hver vev microarray og to ekstra kjerner plassert for å utpeke orienteringen av blokken.
Immunohistochemistry (IHC) Analyse av PTEN Expression
TMA ble seksjonert på 5 um, og delene ble varme immobilisert på objektglass ved 60 ° C natten over. Etter deparaffinization, ble antigen gjenfinning utført i en citrat-buffer [20 mmol /L (pH = 6)] ved 120 ° C i 10 minutter etterfulgt av 3% hydrogenperoksid i fem minutter. Farging ble påført FFPE vev ved å bruke et avidin-biotin (ABC) metoden (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Seksjoner ble inkubert i en time med en mus monoklonalt PTEN antistoff, PTEN 6H2.1 (Cascade biovitenskap, Winchester, MA) ved en fortynning på 1:300. Monoklonalt muse IgG (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ble anvendt som en isotype-negativ kontroll. PTEN farging ble visualisert ved hjelp av tre, 3′-diaminobenzidin (Dako, Carpinteria, CA), og seksjonene ble kontra med fortynnet hematoxylin, dehydrert, og coverslipped for lyse felt mikroskopi. Farging for IHC ble kvantifisert ved gjennomsnitt intensitet fra tre kjerner i hver sak (ImageJ programvare (https://rsb.info.nih.gov/ij/)).
RNA Isolation
Bruk arkiverings FFPE-vev, separate områder av tumor og normal endometrium ble identifisert ved hjelp av de tilsvarende Hematoxylin og Eosin farget seksjoner og kjerner som måler 1,5 mm i diameter og 2 mm i lengde (ca. 0.005 g) ble ekstrahert. Deretter ble prøvene deparaffinized, hydrert, fordøyd med proteinase K, og til slutt, totalt RNA ble isolert ved hjelp TRIZOL reagens (Invitrogen, Carlsbad CA, USA).
Sanntids QRT-PCR analyse av miRNA Expression
den MIR-26a, la 7g, MIR-21, MIR-181b, MIR-192, MIR-215, MIR-200c, og MIR-205 spesifikke primere og internkontrollen RNU6B genet ble kjøpt fra Ambion ( Applied Biosystems, CA, USA). cDNA syntese ble utført av High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, CA, USA) med miRNA spesifikke primere. Real-time kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) ble utført på et Applied Biosystems 7500 Real-time system (ABI 7500HT instrument) med miRNA spesifikke primere med TaqMan Gene Expression analysen.
Sanntids QRT-PCR analyse av PTEN mRNA
for å kunne detektere mRNA fra FFPE- vev, ble cDNA syntese utført av High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, CA, USA) med tilfeldige primere. For QRT-PCR-analyse, tilpasset designet sanntid PCR primere og prober for PTEN og intern kontroll-genet β-aktin ble brukt (Applied Biosystems CA, USA). Primerne ble utformet for å oppnå så små amplikonene som mulig på grunn av bekymring for nedbrytning av mRNA i FFPE-vev [52]. Sekvensene av disse primere /prober er oppført i tabell 2. QRT-PCR ble utført på en ABI 7500HT instrument med mRNA spesifikke primere med TaqMan Gene Expression analyse under følgende betingelser: 50 ° C, 2 min av revers transkripsjon; 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 15 s; 60 ° C, 1 min opptil 40 sykluser (n = 3). Uttrykk av PTEN mRNA ble normalisert etter intern β-actin kontroll, og de relative uttrykk verdiene ble plottet.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism programvare 5.0 . Genuttrykk ΔCt verdier av mirnas fra hver prøve ble beregnet ved å normalisere i henhold til intern kontroll RNU6B uttrykk, og relativ kvantifisering verdier ble plottet. Forskjellene mellom tumor og normalt vev ble analysert ved hjelp av en paret t-test. Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert for å evaluere uttrykket nivåer av MIR-200c og MIR-205 med overlevelse. Uparet t-test ble anvendt for å analysere forskjellen i PTEN farging mellom tumor og normalt vev. Statistisk signifikans ble satt opp til P 0,05 i hver test
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
Forholdet mellom Mir-205 uttrykk og ulike stadier av livmorkreft. MIR-205 uttrykk ble uttrykt som normalisert med en intern kontroll RNU6B genet. (A) Enveis ANOVA test ble brukt til å analysere sammenslutningen av MIR-205 uttrykk i fase I, fase II, stadium III og stadium IV av livmorkreft. (B) Uparet t-test ble brukt til å analysere sammenslutningen av MIR-205 uttrykk i fase I II
vs
stadium III IV
doi:. 10,1371 /journal.pone.0035158.s001 product: (TIF)
takk
forfatterne ønsker å takke Haiyan Zhai, Stephanie Burke, Saira Mehmood, og Penelope GEORGAKOPOULOS for teknisk assistanse og nyttige kommentarer. Vi takker Dr. Xiao Xu (biostatistikk Kjerne for fordøyelsessykdommer Forskning vev anskaffelser Facility fra Stony Brook University) for hans hjelp på den statistiske analysen. Vi setter pris på kritisk gjennomgang fra Frøken Sonya Lorrain og forslag fra våre lesere.
