Abstract
Bakgrunn
Flere tidligere studier har identifisert en sterk sammenheng mellom T-celle infiltrasjon og klinisk utfall i eggstokkreft. Rollen som B-celler er fortsatt kontroversielt, men.
Metoder
førtini parafininnstøpte omentfaktorene prøvene stammer fra pasienter med høy grad av epitelial eggstokkreft ble vurdert. Immunhistokjemiske analyser ble utført for å karakterisere ekspresjon av CD19
+ B-celler og pSTAT3 så høy (mer enn 50% positiv farging av cellene [pscs]) eller lave ( 50% pscs). Kaplan-Meier metoden med log-rank test ble benyttet for å bestemme sammenhengen mellom clinicopathologic parametere og total overlevelse (OS). En multi-varians Cox regresjonsanalyse inkludert natur debulking (primær
vs
sekundær), histologi, svulst klasse, mottak av tidligere kjemoterapi, ble B-celle infiltrasjon og pSTAT3 uttrykk utført.
Resultater
Median OS var 160,6 måneder hos pasienter med lav B-celle uttrykk
vs
47,3 måneder i de med høy B-celle uttrykk (P = 0,0015). Tilsvarende ble median OS forbedret hos pasienter med lav pSTAT3 uttrykk (160,6
vs
47.9 måneder, p = 0,02). I en multi modell for å forutsi overlevelse, ble bare graden av B-celleinfiltrasjon og klinisk stadium beholdt. pSTAT3 uttrykk gikk ikke inn den endelige modellen, muligens skyldes en høy positiv korrelasjon med B-celle infiltrasjon (r = 0,82, P 0,0001).
Konklusjoner
Økt B-celle infiltrasjon og pSTAT3 uttrykk i omentvev er assosiert med dårligere overlevelse
Citation. Yang C, Lee H, Jove V, Deng J, Zhang W, Liu X, et al. (2013) Prognostic Betydningen av B-celler og pSTAT3 hos pasienter med eggstokkreft. PLoS ONE 8 (1): e54029. doi: 10,1371 /journal.pone.0054029
Redaktør: Goli Samimi, Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, Australia
mottatt: 01.10.2012; Godkjent: 07.12.2012; Publisert: 10 januar 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dr. Pal innsats er støttet av National Institutes of Health K12 2K12CA001727-16A1. Dr. Yu arbeidet støttes av NIH U54 CA163117, NIH R01 CA122976-01, NIH P50 CA107399 og Markel fondet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en amassing mengde litteratur støtter rollen av immunceller i eggstokkreft spredning. I 2003, Zhang
et al
rapporterte en banebrytende studie der vev fra 186 pasienter ble vurdert for graden av CD3
+ tumor-infiltrerende T-celler. [1] Tilstedeværelsen av disse cellene ble funnet å forutsi uavhengig forsinket tilbakefall og forlenget overlevelse, med et stort omfang av effekt. Flere andre studier har gitt samme konklusjon, oppsummert nylig i en meta-analyse av Hwang
et al. Product: [2] Med en kumulativ erfaring med 1815 pasienter over 10 studier ble det vist at mangel på tumor- infiltrere lymfocytter (Tīlss) var assosiert med dårligere overlevelse (hazard ratio [HR] 2,24; 95% KI 1,71 til 2,91). I disse studiene, ble Tīlss karakterisert ved ekspresjon av CD3 og /eller CD8. [1], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] Den observerte korrelasjoner mellom T-celleinfiltrasjon og klinisk utfall er en biologisk plausibel en -. spesifikt CD8
+ T-celler kan forårsake en direkte cytolytisk antitumor effekt
med en større forståelse av T-cellebiologi, har det blitt klart at visse undergrupper av T- celler kan faktisk ha en procancer effekt. Spesielt Barnett
m.fl.
har vurdert omfanget av regulatoriske T-celle (treg) infiltrasjon i en serie på 232 primær serøse eggstokkreft prøver. [12] I denne serien av omfanget av treg infiltrering var assosiert med høyere grad kreft og avansert klinisk stadium. Bekreftende disse dataene, perifert blod vurderinger fra pasienter med eggstokkreft foreslå og økende antall sirkulerende Tregs tilhørende sykdomsprogresjon. [13]
Rollen som B-celler i eggstokkreft er mer utfordrende å skjelne. [14] I tidlige studier med murine modeller av B-celle-mangel, ble det foreslått at B-celler faktisk kan hemme antitumoreffekt av tumor infiltrerende T-celler. [15], [16] Som en potensiell mekanisme, B-celler har blitt vist å inhibere primingen virkningen av CD4
+ T-celler på CD8
+ T-celler. [17] Til tross for disse observasjonene, kliniske bevis peker mot en sammenheng mellom CD20
+ tumor infiltrerer B-celler og et positivt resultat i innstillingen av eggstokkreft. Spesielt Milne
et al
undersøkte vev microarray (TMA) data fra 199 pasienter med høy grad av serøs epitelial eggstokkreft (EOC). [18] I denne rapporten nærvær av intraepitelial CD20 + celler som var forbundet med en forbedring i sykdomsspesifikk overlevelse (DSS). Det er imidlertid viktig å merke seg at denne rapporten ble ledsaget av andre paradoksale observasjoner – for eksempel nærvær av foxp3
+ regulatoriske T-celler (Tregs) var også forbundet med en gunstig DSS. Dette funnet motsier overvekt av bevis som tyder på at tregs kan ha en pro-kreft effekt.
Det er klart at forholdet mellom B-celler og kliniske utfall garanterer videre vurdering. I dagens manuskriptet, vurdere vi graden av B-celle-infiltrasjon i omental vev avledet fra pasienter med kreft i eggstokkene, og forsøk på å korrelere graden av infiltrering med total overlevelse (OS). Vi har tidligere vist at fosforylert signal transduser og aktivator av transkripsjon-3 (pSTAT3) spiller en avgjørende rolle i kreftrelatert inflammasjon og tumorprogresjon ved rekruttering av myeloide celler og Tregs. [19], [20] I den senere tid har vi vist en kritisk rolle i å fremme STAT3 B-celle mediert tumor angiogenese i musemodeller (upubliserte data). For å oppnå dette, har vi ytterligere utforsket sammenhengen mellom pSTAT3 og B-celle infiltrasjon.
Metoder
Etikk erklæringen
Kliniske og patologisk data vurderes i denne studien ble anonymisert, og forskning på kliniske prøver ble godkjent av City of Hope IRB (COH IRB 10072).
Studiepopulasjon
The City of Hope Biospecimen Repository (COHBR) huser vev avledet fra alle kirurgiske prosedyrer utført ved institusjonen. Gjennom en IRB-godkjent protokoll, fikk vi parafin-embedded deler av oment vev fra pasienter som besatt en diagnose av høyverdig EOC (dvs. grad 2 eller 3) og hadde primær eller sekundær debulking utført ved institusjonen. Prøvene ble avledet fra debulking prosedyrer utført mellom januar 2000 og desember 2009, og tilstrekkelig prøven måtte være tilgjengelig for å generere totalt 12 ufargede lysbilder (4 mikrometer tykkelse). For pasienter som får primær debulking, bruk eller uten bruk av tidligere (dvs. neoadjuvant) kjemoterapi ble karakterisert. For pasienter som får sekundær debulking, bruk av tidligere kjemoterapi inkluderte adjuvant kjemoterapi gjengitt etter primær debulking. Overlevelse ble preget fra diagnosetidspunktet med eggstokkreft (viktigst, ikke fra tidspunktet for primær eller sekundær debulking kirurgi).
Tissue Analyser
Parafin vev skred ble de-paraffinized i xylen, re-hydrert gjennom gradert alkoholer, og deretter autoklaveres i Antigen avsløre Solution (Vector Laboratories). For IF farging ble vevssnitt inkubert med primært antistoff i en fortynning på 1:50. Platene ble deretter inkubert i fluorofor-konjugert sekundært antistoff. Bilder ble tatt av konfokalmikroskopi hjelp CLSM 510 Meta konfokal mikroskop (Zeiss). For IHC-farging, ble vevssnitt behandlet med 1% E
2o
2 i metanol i 10 minutter ved romtemperatur, og deretter inkubert i en time i PBS inneholdende 10% geiteserum (Sigma). Seksjoner ble inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff. Etter inkubasjon med biotinylerte sekundære antistoffer, ble ABC /DAB deteksjonsmetode utført i henhold til produsentens instruksjoner (Vector Laboratories). Vevssnitt ble deretter motfarget med hematoksylin i 30 sek. Uttrykket nivået av primær antistoff i tumorvev ble visualisert ved en Nikon ECLIPSE TE2000-U mikroskop (4 × objektiv forstørrelse) og avbildes med SPOT programvare. De primære antistoffer som brukes er anti-pY705-STAT3 (Cell Signaling) og anti-CD19, en markør for humane B-celler (Abd Serotec). I alle tilfeller ble ti mikroskopiske felt med minst 1000 celler telles per hvert lysbilde for scoring. Scoring resultat fra IHC-farget vevssnitt ble ytterligere bekreftet ved IF flekker i en sammenhengende avsnitt.
Statistical Analysis
En semi-kvantitativ skala ble benyttet for å vurdere omfanget av CD19 og pSTAT3 farging. Spesielt ble de prøver med 50% av celler med positiv farging (eller høyere) regnes som «høy», og disse prøvene med mindre ble betraktet som «lav». Disse scorene ble tildelt av uavhengig av to etterforskere (C.Y. og H.L.), og avvikende score ble deretter voldgift for å gi en jevn oppdrag. Kaplan-Meier metoden ble brukt til å sammenligne overlevelse i kohorter definert av (1) primær eller sekundær debulking, (2) B-cellefarging (høy
vs
lav), (3) pSTAT3 farging (høy
vs
lav), og en kombinasjon av disse parametrene. En multi-varians Cox regresjonsanalyse ble utført for å undersøke om B-celler eller pSTAT3 flekker gir ekstra prediktiv kraft i overlevelse utover natur debulking (primær
vs
sekundær), histologi (serøs, mucinous, eller endometrioid
vs
klart celle eller udifferensiert), tumor Karakter (2
vs
3), eller tidligere kjemoterapi (ja
vs
nei). Alle statistiske analyser utført ved hjelp av R-programvare (tilgjengelig på https://www.r-project.org/).
Resultater
Pasient Kjennetegn
Fra COHBR, totalt 110 patologiske prøver overgitt fra debulking operasjoner fra eggstokkreft ble identifisert. Av disse totalt 29 prøver representert histologier ikke relevante for denne studien (dvs. lave potensielle svulster, carcinosarcomas, eller bakterie celle svulster ondartet). Av de resterende 81 tilfeller, 17 eksemplarer representert klasse 1 svulster, og 15 eksemplarer ikke har tilstrekkelig omentvev for de foreslåtte analysene ga totalt 49 prøver for den aktuelle studien. Median alder for pasientene er representert med den nåværende kullet var 61 år (range, 41-87), og de fleste pasientene ble karakterisert som å ha serøs, endometroide eller mucinous histologi (47 av 49, eller 96%). Atten pasienter (37%) hadde grad 2 og karsykdommer, mens 31 pasienter (63%) hadde grad 3 sykdom. De fleste av prøvene ble avledet fra primære debulking operasjoner (30 av 49, eller 61%), og resten av sekundær debulking. De fleste pasienter som hadde gjennomgått primær debulking hadde fått noen tidligere systemisk behandling (3%), mens flertallet av pasienter som hadde gjennomgått videregående debulking hadde fått kjemoterapi (89%). Tabell 1 viser kliniske og patologiske egenskaper inndelt graden av B-celle-ekspresjon. Ingen signifikante forskjeller ble sett blant grupper med unntak av omfanget av pSTAT3 flekker – spesielt overvekt av pasienter med høyt B-cellefarging viste også høy pSTAT3 farging, mens de med lav B-cellefarging viste lav pSTAT3 farging (P 0,0001). Eksempler på lav og høy B-celleinfiltrasjon og pSTAT3 ekspresjon er vist i figur 1A. Dessuten, ble B-celler og pSTAT3-positive celler som finnes i det samme området av pasient omental vev (figur 1B).
(A) Immunofluorescent farging etterfulgt av konfokal mikroskopi som viser eksempler på representative prøver fra en pasient med lavt B-celle infiltrasjon og lav pSTAT3 uttrykk (øverst til venstre og høyre), og en egen pasient med høy B-celle infiltrasjon og høy pSTAT3 uttrykk (nederst til venstre og høyre); skala barer, 20 mikrometer. (B) IHC-bilder som viser B-celler og pSTAT3-positive celler i samme område av omentfaktorene vev; skala barer, 200 mikrometer
B-celle /pSTAT3 Expression og klinisk utfall:. Univariat analyse
Gitt blandet befolkning av pasienter undersøkt i denne studien (dvs. pasienter som gjennomgår primær og sekundær debulking prosedyrer), OS var rektor endepunkt undersøkt. Median OS var 160,6 måneder hos pasienter med lav B-celle uttrykk sammenlignet med 47,3 måneder i de med høy B-celle uttrykk (P = 0,0015, figur 2A). Tilsvarende ble median OS forbedret hos pasienter med lav pSTAT3 uttrykk i forhold til høy pSTAT3 uttrykk (160,6
vs
47.9 måneder, p = 0,02; Figur 2B). Selv om det var en forbedret median OS hos pasienter med stadium I /II sykdom
vs
stadium III /IV sykdom (P = 0,001), natur debulking kirurgi (primær
vs
sekundær; P = 0,56) og tumor klasse (dvs. 2
vs
3;. P = 0,16) ikke synes å ha en innvirkning på klinisk utfall (tabell 2)
Kaplan-Meier kurve som illustrerer varigheten av overlevelse hos pasienter med eggstokkreft basert på (A) grad av B-celleinfiltrasjon (P = 0,0015), (B) grad pSTAT3 uttrykket (P = 0,02), (C) histologiske staging system og (D) debulking status .
multivariat analyse
Ved hjelp av en multivariat Cox regresjonsanalyse som omfatter innledende klinisk stadium (I-II
vs
III-IV), natur av debulking (primær
vs
sekundær), histologi (serøs, mucinous, eller endometrioid
vs
klart celle eller udifferensiert), tumor Karakter (2
vs
3), kjemoterapi (ja
vs
nei), uttrykk B-celle (høy
vs
lav) og pSTAT3 uttrykk (høy
vs
lav), bare graden av B- celle infiltrasjon (hazard ratio, HR, 2,03, 95% KI 0,75 til 5,50) og scene (HR 5,16, 95% KI 1,36 til 19,60) ble beholdt i den multivariate modellen. Gitt denne observasjonen, vi utforsket sammenhengen mellom scene og B-celle infiltrasjon og fant en beskjeden korrelasjon (r = 0,38, P 0,001). pSTAT3 gikk ikke inn den endelige modellen, noe som kan muligens være på grunn av sin høye positiv korrelasjon med B-celle uttrykk (r = 0,82, P 0,0001). (tabell 2)
Diskusjoner
flere unike observasjoner dukke opp fra denne studien. En større grad av B-celle-infiltrasjon i omental vev synes å korrelere med dårligere overlevelsen. B-celleinfiltrasjon forbindes sterkt med pSTAT3 ekspresjon i omental vev, og faktisk økte pSTAT3 ekspresjon i omental vev er også forbundet med dårligere overlevelsen. På multivariat analyse, B-celle infiltrasjon inn i siste multivariate modellen sammen med klinisk stadium, og en sterk sammenheng ble registrert mellom pSTAT3 uttrykk og B-celle infiltrasjon.
Som allerede nevnt, virkningen av T-celle infiltrasjon er relativt godt dokumentert i innstillingen av eggstokkreft, nå oppsummert i en meta-analytisk datasett. [2] Disse trene seg studier har avvist arbeidet med å ansette adoptiv overføring av T-celler, både alene og i kombinasjon med kjemoterapi. [21], [22], [23] Effekten av relevante T-celle-undersett, slik som procancer virkningene av Tregs, er også blitt skjelnet. Rollen som B-celler forblir mer kontroversielt – selv om tradisjonelt antatt å ha en antagonistisk effekt på cytotoksiske T-celle responser, den tidligere nevnte datasettet fra Milne
et al
tyder på at tumor infiltrerende B-celler, kan være en positiv prognostisk markør. Det er imidlertid viktig å merke seg at vår studie benyttet en distinkt B-cellemarkør (CD19), og også vurdert en mer heterogen gruppe av pasienter (pasienter som har mottatt sekundær debulking og tidligere systemisk behandling). Med hensyn til den sistnevnte, har vi funnet ingen signifikant forskjell i utfall basert på disse kliniske egenskaper, og overraskende, fordelingen av biomarkører varierte ikke i disse pasienter. Vår studie vurderte også enkelte delene stammer fra parafininnstøpte prøvene; i motsetning til andre studier som evaluerte TMA, denne tilnærmingen er tillatt for vurdering av flere felt (10 per prøve) å gi en mer nøyaktig biomarkør vurdering.
Den nære tilknytningen mellom B-celler og pSTAT3 i denne studien støtter prekliniske data vi har tidligere rapportert opptegning rolle pSTAT3 i immunceller rekruttering. [24] De prekliniske data tyder også på at oppheving av STAT3 aktivitet kan ha en antitumoreffekt, i samsvar med den kliniske observasjon at høyere pSTAT3 kan være forbundet med dårligere klinisk resultat. [25], [26] I kombinasjon, hvis disse kliniske observasjoner er bekreftet i større serie, kan dette tjene som begrunnelse for å forfølge terapeutiske studier av Stat3 antagonister å målrette B-celler i eggstokkreft. Som ett eksempel, har vi utviklet en CpG-konjugert siRNA rettet mot STAT3 i myeloide celler og B-celler. [26] Selv om levering av siRNA-basert terapi har vært en formidabel utfordring, eggstokkreft kan være en ideell sykdom enhet å nærme seg med disse midlene. Intraperitoneal kjemoterapi har en veletablert overlevelsesgevinst i fase III-studier, og intraperitoneal levering av RNA-baserte legemiddelselskap kan omgå visse stabilitet og løselighet problemer. [27] I tillegg til direkte å antagonisere STAT3, en tilnærming rettet mot oppstrøms grupper, såsom JAK2 kunne bli vurdert. Flere JAK2 inhibitorer har blitt utviklet for behandling av myeloproliferative sykdommer som bærer aberrasjoner i dette proteinet; Det er blitt vist at en av disse små molekylene, AZD1480, har en antitumoreffekt i MDAH2774 ovarian cancer cellelinje. [28], [29].
Flere begrensninger bør bli anerkjent. For det første, vår prøvestørrelsen var forholdsvis liten i kontrast til andre publiserte rapporter. [1], [30] For det andre, det gjorde vi ikke vurdere T-celle populasjoner (dvs CD8
+ T-celler og foxp3
+ regulatoriske T-celler) for å bekrefte tidligere rapportert funn. [30] For det tredje er det fortsatt uklart hvilken effekt visse behandlings variabler (dvs. før kjemoterapi) kan ha hatt på den observerte B-celle eller pSTAT3 distribusjon – dette garanterer videre studier i en større serie. Endelig vår studie fokuserer utelukkende på vev-baserte markører. Selv vanlige blodprøver som CA-125 har falt i unåde etter siste potensielle vurderinger, er det et mangfold av nye serumbaserte analyser i horisonten. [31] For eksempel autoantistoff profilering studier har identifisert signaturer som skiller mellom eggstokkreft pasienter og friske kontroller. [32] Det vil være merkelig å se om en kombinasjon av biomarkører vi har foreslått her, med andre kan gi overlegne personlige prognostiske verktøy. Til tross for disse begrensningene, sier vår data til en svært begrenset mengde litteratur knyttet til effekten av B-celleinfiltrasjon på klinisk utfall ved avansert eggstokkreft, og gir en plausibel mekanisme for at dette skal skje (nemlig B-celle rekruttering via STAT3 avhengig trasé). Åpenbart vil større innsats være nødvendig for å validere observasjoner gjort her. Med en skygge kastet over tradisjonelle biomarkører som CA-125, immun markører holde enorme løftet i eggstokkreft. [33] På et voksende portefølje av JAK /STAT pathway hemmere, våre data linking pSTAT3 uttrykk og B-celle infiltrasjon til klinisk utfall kan til slutt støtte en roman terapeutisk avenue for denne sykdommen.
