Abstract
Vi har tidligere beskrevet en roman selvmord (eller «celle skjebne kontroll » ) genterapi enzym /prodrug system basert på en konstruert variant av human tymidylat kinase (TMPK) som potenserer azidothymidin (AZT) aktivering. Levering av en selvmords gensekvens i svulster ved lentiviral transduksjon bærer en kreft genterapi som kan ansette tilskuer celle drapet som en mekanisme kjører betydelig tumorregresjon
in vivo
. Her presenterer vi bevis for en betydelig tilskuer celledrepende
in vitro Hotell og
in vivo
mediert av TMPK /AZT selvmord genet akse som er avhengige av dannelsen av funksjonelle gap-junctional interkommunikasjon ( GJICs). Potensering av AZT aktivering av den manipulerte TMPK uttrykt i den humane prostatacancercellelinje, PC-3, resulterte i effektiv bystander dreping av PC-3-celler som mangler ekspresjon TMPK – en effekt som kan bli blokkert av den GJIC inhibitor, carbenoxolone. Selv GJICs er hovedsakelig dannet av connexins, har en ny familie av GJIC molekyler utpekte pannexins nylig blitt identifisert. PC-3-celler som uttrykte både connexin43 (Cx43) og Pannexin1 (Panx1), men Panx1 ekspresjon dominerende på plasmamembranen, mens Cx43 ekspresjon var primært lokalisert til cytosol. Bidraget av bystander effekter til reduksjon av solide tumor-xenografter som er fastsatt av PC-3-cellelinjen ble undersøkt i en dyremodell. Vi viser bidraget fra tilskuer celledreping til tumor regresjon i en xenograft modell stole på levering av uttrykk for TMPK selvmord genet i svulstene via direkte intratumoral injeksjon av rekombinant terapeutisk lentivirus. Tatt sammen, våre data understreker at TMPK /AZT enzym-prodrug-aksen kan effektivt benyttes i selvmordsgen behandling av faste tumorer, karakterisert betydelig tumorregresjon kan oppnås via bystander virkninger som medieres av GJICs
Citation:. Sato T, Neschadim A, Lavie A, Yanagisawa T, Medin JA (2013) The Engineered tymidylatkinase kinase (TMPK) /AZT Enzyme-Prodrog Axis tilbyr effektive Bystander Cell Killing for Suicide Gene Therapy of Cancer. PLoS ONE 8 (10): e78711. doi: 10,1371 /journal.pone.0078711
Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn
mottatt: 03.06.2013; Godkjent: 16 september 2013; Publisert: 23 oktober 2013
Copyright: © 2013 Sato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert delvis av Grant-i bistand for Scientific Research (C) (20590533) til TS fra Japan Society for Promotion of Science (JSP) og ved forskningsstipend fra Saito Takknemlighet Foundation til T.S .. E. N. ble finansiert av den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) Training Program i Regenerative Medicine. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Genterapi nærmer anvendelse av rekombinante oncoretroviral eller lentivirale vektorer for å levere gener som forsterker forskjellige farmakologiske terapier direkte inn i faste tumorer være lovende i behandlingen av faste ondartede sykdommer som er vanskelige å fjerne kirurgisk, slik som kreft afflicting hjernen [1]. Selvmord genterapi av kreft (SGTC), også kalt gen styrt enzym-prodrug terapi (GDEPT), avhengig vanligvis på intratumoral levering av selvmordsgener som letter selektiv og lokalisert aktivering av spesifikke forløpere i sine cytotoksiske effektor derivater. Transcriptional- og pseudobasert målretting av viruspartikler til kreftceller utvider de potensielle bruksområder for å inkludere metastatiske lesjoner og utvide leveringsmåte til systemisk administrasjon [2,3]. De betydelige utfordringer knyttet til å levere selvmordet gen inn i hver eneste ondartet celle blir ofte overvunnet ved å stole på tilskuer celledreping, eller Tilskuereffekten, som skaper en lokalisert kill sone rundt vellykket transduserte tumorceller som funksjonelt uttrykker selvmords genet, og dermed forsterke den generelle SGTC effekt [4].
Flere selvmordsgener har blitt karakterisert og evaluert så langt med hensyn til deres verktøy for SGTC. Blant dem, herpes simplex virus-avledede tymidinkinase (HSV-tk) er en av de mest omfattende studert selvmordsgener for SGTC [5]. HSV-tk og en rekke katalytisk forbedrede mutanter av dette enzymet har blitt mye brukt som et selvmordsgen i kombinasjon med guanosin-analog, ganciclovir (GCV), for behandling av forskjellige cancere [1,6]. HSV-tk konverterer den ikke-toksisk GCV inn i GCV-monofosfat (GCV-MP), som videre er fosforylert av cellulære kinaser for å produsere toksiske metabolitten, GCV-trifosfat (GCV-TP), som hemmer vertscelle-DNA-replikasjon som fører til induksjon av apoptose [7]. Bystander effekter har blitt godt karakterisert i HSV-tk /GCV selvmord genterapi system, og er antatt å involvere diffusjon av aktivt GCV, enten mono- eller formere-fosforylerte former, fra HSV-tk-uttrykkende celler til bystander celler via gap-junctional interkommunikasjon (GJICs) som kobler cytosols av tilstøtende celler i mange solide svulster og tillater utveksling av små molekylvekt metabolitter ved diffusjon [8]. En rekke faktorer begrense den samlede effekten av HSV-tk for bruk i SGTC inkludert: dårlig aktivering av GCV av HSV-tk i sin cytotoksiske form, først og fremst knyttet til hastighetsbegrensende trinnet i GCV aktivering være fosforylering av GCV-MP til GCV -DP av det cellulære guanylat kinase (GMPK) [9]; begrenset cytotoksisitet av GCV, spesielt mot langsomt-voksende tumorer, gitt sin begrensede virkningsmekanisme som er utelukkende avhengig DNA-replikasjon [10]; og, til slutt, den dårlige lipofilisiteten av GCV noe som resulterer i reduserte bystander effekter og en dårlig evne til å krysse blod-hjerne-barrieren og dermed begrense anvendbarhet i hjerne-målrettede SGTC [11]. Tatt sammen, SGTC tilnærminger utnytte de HSV-tk /GCV akse er således begrenset av begrenset cytotoksisitet og problemer med effektiv dosering med GCV, som kan ha som skal benyttes ved konsentrasjoner som er systemisk myelosuppressive for å oppnå betydelig tumor ablasjon.
Vi har tidligere beskrevne alternative enzym prodrug-systemer for selvmord (eller «celle skjebne kontroll») genterapi [12,13], hvorav en anvender en katalytisk med forbedret variant av den humane tymidylat kinase (TMPK-F105Y) som er blitt aktivert for å forsterke rask aktivering av pro-drogen azidothymidin (AZT) [12]. Katalytisk, er villtype TMPK relativt langsom ved fosforylering av AZT-monofosfat, som er flaskehalsen trinnet i sin aktiveringsveien i pattedyrceller. Den F105Y-mutasjonen, vedtatt basert på sammenligning av en homolog region av gjær TMPK sekvens, resulterer i en variant enzym som er mye mer robust ved fosforylering av AZT-monofosfat og mindre aktiv på dens naturlige substrat, tymidylat-monofosfat [14]. Denne nye selvmord genterapi akse benytter et menneske-opprinnelses enzym med minimal grad kan forårsake uønskede immunresponser rettet mot transgenet, som er observert med HSV-tk-baserte metoder. Den benytter også et enzym som er katalytisk robust og virker på det hastighetsbegrensende trinn av AZT aktivering. Videre benytter det en prodrug som cytotoksiske skjemaet kan effektivt målrette både dele og ikke-delende celler på grunn av to forskjellige cytotoksiske mekanismer [12]. Endelig benytter den et prodrug som har bedre lipofilisitet profil og er sannsynligvis mer egnet for bruk i SGTC. Spesielt er AZT estimert til å være minst 30 ganger mer lipofil enn GCV [11], som predikerer bedre passiv diffusjon og økt egnethet av AZT prodrug for selvmord genterapi av faste tumorer, så vel som bedre levering av prodrogen til hjerne, for eksempel. På grunn av disse overlegne egenskapene til TMPK /AZT selvmord genterapi aksen, setter vi ut for å vurdere hensiktsmessigheten av dette systemet og omfanget av Tilskuereffekten det ville skape i SGTC.
I denne studien rapporterer vi den vedvarende ekspresjon av det katalytisk forbedret, AZT-aktiv TMPK variant, TMPK-F105Y, i den humane prostata carcinoma cancercellelinje, PC-3, ved transduksjon med lentivirale konstrukter sensitizes lett disse cellene til behandling med AZT og letter økt celledrepende via tilskuer~~POS=TRUNC både
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi viser at det bystander drepende effekt, observert etter AZT-behandling, er i stor grad avhengig av at det finnes funksjonelle GJICs og blir opphevet ved behandling med et gap junction-inhibitor. Videre viser vi Pannexin1, og ikke Connexin43, sannsynligvis danner funksjonelle gap veikryss mellom PC-3 celler. Disse resultatene markere nytten av lentivirus-mediert SGTC basert på modifisert TMPK /AZT system og garanterer den videre evalueringen
in vivo
i spesifikke modeller for kreft.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Animal eksperimentelle prosedyrer fulgt en protokoll godkjent av Animal Care komité University Health Network (Toronto, ON, Canada). Dyrene ble opprettholdt på (, Toronto ON, Canada) Animal Resource Centre på Princess Margaret Hospital.
Cell kultur
Menneskelig prostatahyperplasi adenokarsinom PC-tre cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og holdt i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) -1640 medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; PAA Laboratories GmbH, Pasching , Østerrike), 100 enheter /ml penicillin (Nakalai tesque, Inc., Kyoto, Japan), 100 ug /ml streptomycin (Nakalai tesque, Inc.), og 2
