Abstract
Grønn byggekstrakt (GB) ble undersøkt for mulig anti-kreft aktivitet ved å undersøke sin anti-proliferative og pro-apoptotiske egenskaper på humane leukemi /lymfom cellelinjer. Våre resultater tyder på at NO utviser selektiv anti-proliferativ aktivitet på et panel av leukemi /lymfom-celler sammenlignet med ikke-kreftceller. Nærmere bestemt, GB forstyrret celle-syklusprogresjon i BJAB-celler, som manifestert ved G2 /M fase rest og DNA-fragmentering, og induserte apoptose, som gjenspeiles av fosfatidylserin (PS) translokasjon til den ytre cytoplasmiske membran i to B-linjen leukemi /lymfom cellelinjer. Den pro-apoptotiske virkning av NO ble funnet å være uavhengig av mitokondriell depolarisering, således impliserer ytre celledødsveier for å utøve dets cytotoksisitet. Faktisk, GB fremkalte en økning av TNF-α produksjon, caspase-8 og kaspase-3 aktivering, og PARP-1-spaltningssetet i løpet av pre-B-akutt lymfatisk leukemi NALM-6-celler. Videre caspase-8 og kaspase-3 aktivering og PARP-1-spaltningssetet var sterkt hemmet /blokkert ved tilsetningen av de spesifikke kaspaseinhibitorer Z-VAD-FMK og Ac-DEVD-CHO. Videre analyser intracellulær signalisering bestemt at behandling GB forbedret konstitutiv aktivering av Lek- og Src-tyrosinkinaser i NALM-6-celler. Samlet utgjør disse funnene tyder på at GB indusert fortrinnsrett anti-proliferative og pro-apoptotiske signaler innenfor B-avstamning leukemi /lymfom celler, som bestemmes av følgende biokjemiske kjennetegn på apoptose: PS eksternalise, økt frigjøring av TNF-α, caspase-8 og caspase-3-aktivering, PARP-1 cleavage og DNA-fragmentering Våre observasjoner viser at GB har potensial som en anti-leukemi /lymfom middel alene eller i kombinasjon med standard kreft behandlinger og dermed warrants videre evaluerings
in vivo
til støtter disse funnene
Citation. Robles-Escajeda E, Lerma D, Nyakeriga AM, Ross JA, Kirken RA, Aguilera RJ, et al. (2013) Søke i naturen for Anti-Cancer aktivitet: Anti-proliferativ og Pro-apoptotiske Effect fremkalt av Grønn Barley på leukemi /lymfom celler. PLoS ONE 8 (9): e73508. doi: 10,1371 /journal.pone.0073508
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 1 april 2013; Godkjent: 22 juli 2013; Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Robles-Escajeda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Midler til dette arbeidet ble gitt av NIGMS SCORE Grant 1SC3GM103713-01 til RJA; Edward N. og Margaret G. Marsh Foundation, Lizanell, og Colbert Coldwell Foundation til RAK; Tilskudd 8G12MD007592 til Border Biomedical Research Center (BBRC) og P20MD002287-06 til spanske helseforskjeller Research Center (HHDRC) fra National Institutes på minoritetshelse og helseforskjeller (NIMHD), en komponent av National Institutes of Health (NIH) . ER-E og DL ble støttet av RISE Scholars Program ved utep gjennom NIGMS Grant No. R25GM069621-08 og REU-NSF Grant No. DBI-0851881, henholdsvis. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
På verdensbasis er bygg regnes som en ikke-giftig plante [1] som produserer et korn som fungerer som en base malt i bryggeribransjen. Det er også en sunn del av ulike matvarer og drikkevarer (brød, supper, stuinger, øl, etc.) og som store dyr grovfôr. Uavhengig av dens korn, 10- til 12 tommer lange unge byggblader, også referert til som grønn bygg, er inntatt som en infusjon, og er også fremstilt for konsum som tørket pulver. Unge bygg bladene er anbefalt som et kosttilskudd på grunn av deres vitamin og mineral-innhold [2].
Tidligere studier har indikert at ekstrakter fra hele bygg kjerner utviser antioksidant og anti-proliferative effekter på human kolorektal kreft Caco -2-celler [3]. Likevel er den anti-proliferativ aktivitet i løpet av grønne bygg bladene til å bli belyst. Grønne bygg produkter ha anti-inflammatoriske egenskaper, og kan modulere tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) produksjon /release på humane monocytter THP-1-celler [4]. Tilsvarende annen studie rapporterte at et sammensatt isolert fra grønne bygg blader besatt anti-oksiderende egenskaper [5]. Videre er små molekyler (mindre enn 1 kDa) renset fra grønn byggekstrakt (GB) hemmet TNF-α frigivelse fra mononukleære celler oppnådd fra revmatoid artritt (RA), noe som tyder på at NO kan være et naturlig medikament med anti-oksidant og anti- inflammatorisk aktivitet som lindrer symptomene på pasienter som lider av RA [6]. Rensing ble utført ved bruk avanserte metoder for å karakterisere de spesifikke forbindelser som er ansvarlig for de observerte biologiske aktiviteter av GB. Markham og Mitchell viste at flavone-c-glykosider, saponarin og lutonarin, fra unge grønne bygg bladene var ansvarlig for anti-oksiderende egenskaper [7]. Tilsvarende biomasser fra grønne byggplanter besitte større mengder av anti-oksiderende enzymer katalase og superoksyd-dismutase, så vel som den ikke-enzymatiske anti-oksidanter vitaminene C og E [8,9]. I samsvar med disse observasjonene,
in vivo
studier med 36 deltakere antydet at daglig tilskudd av bygg blader i kombinasjon med anti-oksiderende vitaminer (C og E) reduserte low-density lipoprotein (LDL) -Vitamin E innhold og hemmet små tette LDL oksidasjon, og dermed redusere noen av de viktigste risikofaktorer for aterosklerose og beskytte type 2 diabetikere mot vaskulære sykdommer [10]. Videre ble en blanding av saponarin /lutonarin (4,5 /1 proporsjon) isolert fra unge byggblader funnet å ha anti-oksiderende effekt som var sammenlignbare med dem som ble oppnådd fra α-tokoferol og butylhydroksytoluen [11].
det er blitt foreslått at den anti-oksiderende og anti-kreft aktivitet i frukt og grønnsaker tilordnes som additiv eller synergistisk som følge av deres komplekse blanding av fenoliske komponenter [12]. Videre er den totale polyfenol fraksjonen innenfor tyttebær oppviste mer effektiv anti-proliferativ aktivitet sammenlignet med de individuelle komponenter, noe som tyder på en kombinert additiv eller synergistisk innflytelse [13]. I tillegg har flere studier vist at planteprodukter kan fungere som cellesyklus undertrykkende midler, avbryte igangsettes eller progresjon faser av kreftutvikling [14-17]. Videre har det blitt bemerket at kreftpasienter ofte innta planteprodukter i tillegg til sine foreskrevne medisiner [18] basert på en antakelse om at anlegget produkter har ufarlige bivirkninger og er et godt studert terapeutisk valg.
til tross for bevis av GB potensial som en anti-inflammatorisk mediator, er det magre bevis på sin direkte antiproliferativ og /eller cytotoksisk aktivitet på normale eller transformerte celler. I denne studien, søkte vi å undersøke de anti-proliferative og cytotoksiske aktivitet av GB på forskjellige leukemi /lymfom cellelinjer. Våre data viser at NO har selektiv anti-proliferativ effekt på flere leukemi /lymfom-celler, med liten eller ingen på ikke-kreftceller. Av fire kreftcellelinjer, pre-B (NALM-6) og moden-B (BJAB-celler) var mest følsomme overfor GB anti-proliferativ aktivitet. For første gang, vår studie viste at GB førte til apoptotisk celledød gjennom TNF-α frigivelse, caspase-8 og caspase-3 aktivitet, PARP-1-spaltningssetet, PS translokasjon, cellesyklus-stans-assosiert DNA-fragmentering. Disse studiene gir støtte for den potensielle nytten av GB mot leukemi /lymfom og garanterer videre etterforskning i dyremodellsystemer.
Materialer og Metoder
Grønn byggekstrakter (GB) forberedelse
grønne bygg pulver fra unge bladene av
Hordeum vulgare
L., som selges kommersielt som en urte supplement som en proaktiv kilde til vitaminer og mineraler (vitamin verden; www.vitaminworld.com), ble benyttet. Dehydrerte GB pulver ble resuspendert med fosfatbufret saltvann (PBS; Life Technologies, Grand Island, NY) ved en konsentrasjon på 10% vekt /volum. De rehydratiserte pulversuspensjoner ble deretter utsatt for tre på hverandre følgende fryse /tine-sykluser ved -80 ° C /romtemperatur, henholdsvis. Deretter ble prøvene gjentatte ganger ultralydbehandlet (Vibra Cell, Sonics and Materials Inc., Newtown, CT) ved maksimal amplitude 40%, ~ 14 watt, ved hjelp av en ¼ «mikrotip, ved en 20 sek sonication puls etterfulgt av 30-sec resten intervaller for syv påfølgende sykluser. Rørene inneholdende suspensjonen blandingene ble holdt på forhånd avkjølt i et is-vann-bad i løpet av prosedyren for å unngå oppvarming. Etter sentrifugering ved 15.000 x
g
i 30 minutter, ble supernatantene samlet opp og aseptisk filtrert først gjennom 0,45 um-membranporene, fulgt av en andre filtrering gjennom 0,22 um-membranporene (Cole-Parmer, Chicago, IL). Prøver av steril PBS uten GB ble anvendt som kontroller. I tillegg ble den tørre vekt av GB løselig materiale måles for å bestemme konsentrasjonen av plantetørrvekt, i mg /ml, anvendt i hver behandling. Tre prøver med 1 ml fra begge GB prøver fremstilt i PBS ble frysetørket (Labconco 4,5 L frysetørker, Stanford, California) over natten. I tillegg aliquoter av 1 ml PBS alene ble anvendt for å subtrahere PBS oppløsningsmidlet bidraget, og tørrvekten ble beregnet. Typiske volumer brukt i denne studien og deres tørre vekt ekvivalenter av GB er avbildet i tabell S1
Cellelinjer og kulturforhold
Fire menneskelig leukemi /lymfom cellelinjer ble benyttet. YT Natural draps som [19], moden-T akutt lymfatisk leukemi Jurkat [20], pre-B akutt lymfatisk leukemi NALM6-[21], og moden-B Burkitt lymfom BJAB [22]. For sammenligningsformål, en cellelinje fra ikke-kreft opprinnelse, human dermal neonatal forhud-fibroblaster (Hs27 Hs27; ATCC, Manassas, VA), ble også inkludert. Kulturen media for leukemi /lymfom (YT, Jurkat, NALM6-og BJAB) og fibroblast (Hs27) celler var RPMI og DMEM (HyClone, Logan UT), henholdsvis. Begge disse kulturmedia ble supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Hyclone), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 0,25 ug /ml amfotericin B (Lonza, Walkersville, MD). Eksponensielt voksende celler, ved ca. 60-75% konfluens, ble tellet og sådd ut på 24-brønners plater. Inkuberings betingelser var cellene 37
° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. For å sikre høy levedyktighet, ble cellene behandlet som tidligere beskrevet [23].
Anti-proliferative assay
leukemi /lymfom og ikke-kreftceller ble utsådd i en 24-brønners plateformat på 1×10
5-celler /brønn og 1.25×10
4 celler /brønn i 1 ml medium, henholdsvis. Etter at cellene ble utsatt for 50 ul /ml av NO i 96 timer, ble det absolutte celle-antallet per milliliter kvantifisert ved anvendelse av et invertert mikroskop og et Neubauer kammer (hemocytometer), for å estimere anti-proliferativ aktivitet sammenlignet med ubehandlede negative kontroller. Cellene vokser i suspensjonen ble homogenisert direkte, og en prøve ble applisert på et hemocytometer og telles. For adherente Hs27 celler, ble supernatanten inneholdende de flytende celler (hovedsakelig døde) fra hver brønn samlet opp i et rør, mens de adherente celler ble løsnet ved trypsinering som tidligere beskrevet [24]. Flytende og adherente celler ble homogenisert og telt, som angitt ovenfor. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittet av kvadruplikate kulturer. De PBS-behandlede kontroller, fortynningsmiddel av GB, ble normalisert til 100% og brukes som en referanse for å beregne prosentandelen av GB-behandlede celle-proliferasjon.
Cytotoksisitet overvåkes av vitale fargestoff propidiumjodid utelukkelse assay
for kvantifisering av cytotoksisitet, ble celleprøver samlet inn, farget med membran-impermeant fargestoff propidiumjodid (PI) og overvåket i levende celler modus
via
flowcytometri (Cytomics FC500, Beckman Coulter, Miami , FL). Denne analyse identifiserer én PI-positive celler med oppbrutte plasmamembraner som anses som døde celler. Omtrent 10 000 hendelser ble samlet for hver prøve, og dataene ble analysert som tidligere rapportert [25]. Som positive anti-proliferative /cytotoksiske kontroller, ble cellene eksponert for 1 mg /ml G418, en proteinsynteseinhibitor. I tillegg, som negative kontroller ble celler behandlet med ekvivalente mengder GB fortynningsmiddel alene, ble PBS og ubehandlede celler er inkludert i parallelle kulturer. Datainnsamlings- og analyse ble utført ved anvendelse av CXP programvare (Beckman Coulter).
cellesyklusanalyse ved å måle cellulært DNA-innhold
Analyse av det cellulære DNA-innhold og cellesyklusfordelingen ble utført ved PI flekker og overvåke sin fluorescens
via
flowcytometri. Påvirkningen av NO som en mulig cellesyklus disruptor ble undersøkt på asynkron BJAB-cellelinjen etter 96 timers inkubering. Celler ble sådd på en 24-brønners plate, dyrket som beskrevet ovenfor, og høstet som tidligere beskrevet [24]. Cellekjerner ble fremstilt ved bruk av DNA-Prep Coulter reagenser kit (Beckman Coulter) etter produsentens anvisninger. I korthet ble cellene høstet og sentrifugert ved 262xg i 5 minutter. Supernatanten ble kastet, og deretter cellepelletene ble forsiktig resuspendert ved lav hastighet vortex ved anvendelse av 100 ul DNA-Prep lysis og en permeabiliseringen reagens (vaskemiddel), etterfulgt av tilsetning av 400 ul DNA-Prep flekk reagens (50 ug /ml PI og 4 kU /ml RNase). Deretter ble prøvene inkubert ved romtemperatur i mørket i 60 min, etterfulgt av strømningscytometri-analyse (LSRII; BD Biosciences, San Jose, CA). Som en positiv kontroll for cellesyklus-stans, ble to uavhengige eksperimenter utført hvori celler ble eksponert for 1 mg /ml G418 og 80 nM etoposid (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) i 96 timer. Som en kontroll for ikke-spesifikke effekter, fortynningsmidlet fra GB, PBS (10 og 50 ul), som inneholdes i de eksperimentelle prøver, ble inkludert. Ubehandlede celler ble brukt som kontroller. Prosentene av celler med ulike DNA innhold fordelinger ble bestemt fra histogram med porter for sub-G0 /G1, hypodiploid; G0 /G1, diploid; S, hyperdiploid; og G2 /M, tetraploid. Gating ble brukt for å utelukke dubletter. S-fasen populasjonen ble definert som prosentandelen av celler med et DNA-innhold mellom G0 /G1 (diploid) og G2 /M (tetraploid). I tillegg ble denne type analyser som brukes for dens evne til å detektere en apoptose-assosierte DNA-fragmentering mønster på celle-nivået, som manifestert ved en økning i sub-G0 /G1 celle subpopulasjon [26]. Å deconvolute DNA innhold histogrammer, ble FACS Diva (BD Biosciences) eller FlowJo (Tre Star, Ashland, Oregon) programvare utnyttes.
Analyse av fosfatidylserin (PS) fordeling i cellemembraner
Å undersøke om forstyrrelse av cellemembranen PS asymmetri er involvert som en mekanisme for celledød indusert av GB, celler ble overvåket
via
flowcytometri etter dual farging med annexin V-FITC og PI. Celler ble sådd ut i 24-brønners plater t ved en tetthet på 100.000 celler per brønn i 1 ml kulturmedium. Etter inkubering over natten, ble cellene behandlet med 50 ul GB eller PBS kontroll for ytterligere 48 h og 96 h, for NALM-6 og BJAB-celler, respektivt. Cellene ble høstet, vasket med kald PBS og behandlet i henhold til produsentens instruksjoner (Beckman Coulter). I korthet ble cellene farget med en oppløsning inneholdende en blanding av annexin V-FITC og PI i 100 ul bindingsbuffer, inkubert på is i mørket i 15 min, etterfulgt av tilsetning av 400 ul iskald bindingsbuffer og umiddelbart analysert
via
flowcytometri (Cytomics FC 500; Beckman Coulter). Den totale andelen av apoptotiske celler ble definert som summen av både tidlige og sene faser av apoptose (Annexin V-FITC positiv), øvre og nedre høyre kvadrant i en strømningscytometriske dot plots, respektivt. For hver prøve ble 10.000 hendelser samlet og analysert utnytte CXP programvare (Beckman Coulter). Hvert forsøk og kontroller ble vurdert i quadruplicates.
Live-celle påvisning av intracellulære caspase-3-aktivering
cystein-asparaginsyre proteaser (caspase) -3 aktivering i NALM6-GB-behandlede celler ble målt ved hjelp av et fluorogent NucView 488 Caspase-3 kit for levende celler (Biotium, Hayward, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene viser en grønn fluorescens signal ble overvåket
via
flowcytometri (Cytomics FC500). Cellene ble sådd på en 24-brønners plateformat som beskrevet ovenfor og eksponert i 6 timer og 8 timer til 50 ul GB ekstrakt. Flere kontroller ble inkludert i denne serie forsøk: Cellene ble behandlet i 8 timer med GB ekstrakt ble eksponert for 10 uM Ac-DEVD-CHO (DEVD, N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aldehyd), er en potent, spesifikk og irreversibel inhibitor av kaspase-3 [27], før tilsetningen av NucView substrat; celler behandlet i 8 timer med 2 mg /ml camptothecin, en velkjent induserer apoptose
via
caspase-3-aktivering [26], som en positiv kontroll; og ubehandlede celler ble anvendt som en negativ kontroll. Datainnsamling og analyse av caspase-3-positive celler ble utført ved anvendelse CXP programvare.
Western blot-analyse av PARP-1-spaltningssetet
Spaltningen av poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) ble vurdert ved Western blotting som beskrevet tidligere [28]. I korte trekk ble 50 pl eller 100 pl GB tilsatt til 1×10
5 NALM-6-celler i 1 ml medium og ble inkubert i 24 timer. Som en positiv kontroll av PARP-1-spaltningssetet induksjon, ble 2 ug /ml camptothecin anvendes. Et potent inhibitor av kaspase-3, Ac-DEVD-CHO (20 uM) ble tilsatt til cellene samtidig med N for å bestemme bidraget av caspase-3 i PARP-1-spaltningssetet. Like mengder av celleekstrakter, 100 ug protein pr kjørefelt i Laemmli-reduserende buffer, ble separert ved anvendelse av en 10% mini-gel (Bio-Rad, Hercules, CA) for SDS-PAGE. Proteinkonsentrasjoner av celleekstrakter ble kvantifisert med den bicinchoninic syre proteinanalysesett (Pierce, Rockford, IL). Etter elektroforese ble proteinene overført fra gelen til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) som tidligere beskrevet [29]. Deretter ble PVDF-membran blots blokkert med 5% (vekt /volum) skummet melk pulver i TBST i 1 time. De følgende primære antistoffer ble brukt: kanin-anti-PARP-1 (Cell Signaling, Danvers, MA) og kanin-anti-β-aktin (Sigma, St. Louis, MO), fortynnet 1: 1000 og 1: 3000 med blokkeringsløsning. Anti-PARP-1 reagens detekterer full lengde PARP-1 (116 kDa), så vel som dens store fragmentet (89 kDa). Deretter ble immunoblottet proteiner merket med primært antistoff hybridisert med HRP-konjugert geite-anti-kanin (1: 3000 fortynning, Sigma). Mobiliteten av molekylvektmarkører er spesifisert. Blottene ble behandlet med forbedret chemiluminescence reagens (Millipore, Billerica, MA) og utsatt for x-ray filmer (Phenix, Candler, NC) for proteinbånd visualisering. Fotografier fra de utviklede filmene ble tatt med en gel dokumentasjonssystem (Alpha Innotech, San Leandro, CA).
Polykromatisk analyse av mitokondriemembranen potensial (
Δ
Ψm)
NALM-6-celler ble behandlet med 50 ul GB og inkubert i 4 timer som beskrevet ovenfor. Deretter ble cellene farget med 2 mikrometer av fluoroforen 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid (JC-1) etter produsentens instruksjoner (Life Technologies, Grand Island , New York). Avbrudd av mitokondrie
ΔΨm
er dokumentert av en betydelig forskyvning av fl uorescence signal fra rødt til grønt. JC-1 tilslag eller monomerer, emitting rødt eller grønt signal, ble identifisert
via
flyt cytometri (Cytomics FC500) med FL2 eller FL1 detektorer, henholdsvis. Som en positiv kontroll en proton ionofor som avleder den mitokondrielle
ΔΨm
, karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP, 50 uM) ble anvendt. Celler behandlet med GB fortynningsmiddel (PBS) og ubehandlede celler ble anvendt som kontroller. Datainnsamling og analyse ble utført ved anvendelse av CXP programvare.
Luminex multipleks analyse
NALM-6-celler utsådd i en multi-brønn plate ble eksponert for 25 og 50 ul /ml av NO for tre h før cellepelletene og vekstmedium supernatanter ble samlet opp ved sentrifugering. Cellekultursupernatanter fra hver prøve ble deretter analysert for å kvantifisere tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og løselig Fas ligand (SFAS-L) cytokiner nivåer, etter produsentens anbefaling (Millipore, Billerica, MA). I tillegg ble cellepelletene vasket med PBS og lysert med Milliplex MAP-celle signalisering lyseringsbuffer inneholdende proteaseinhibitorer (Millipore, Billerica, Massachusetts). Protein quantifications ble utført ved hjelp av BCA reagens (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL). Den MILLIPLEX MAP human Src-familie-kinase-sett (Millipore, Billerica, MA) ble benyttet for å detektere fosforylert Lek (Tyr394), Src (Tyr419), Fyn (Tyr420), Blk (Tyr389) og FGR (Tyr412), på 25 ug av total cellelysat i overensstemmelse med fabrikantens foreslåtte protokoll. Target proteiner ble analysert ved hjelp av kulebaserte Xmap (multianalyte profilering) teknologi på Luminex 200 plattformen (FlexMAP 3D system, Millipore, Billerica, MA) kombinert med Xponent 3.1 programvare (Luminex, Austin, TX) i henhold til fabrikantens foreslåtte protokoll (Millipore ). Hvert eksperimentelt punkt og kontroller ble utført i triplikater.
Sanntids påvisning av intracellulær caspase-8-aktivering
caspase-8-aktivering i NALM-6-celler, ble bestemt ved anvendelse av cellepermeable og irreversibelt bindende caspase-8 inhibitor merket med fluorescein, FITC-IETD-FMK, og overvåkes
via
flowcytometri [30]. Celler i en 24-brønners plateformat, sådd ut ved en tetthet på 100.000 celler per brønn i 1 ml vekstkulturmedium, ble utsatt for 10 og 50 ul /ml av NO i 4 timer og deretter inkubert med FITC-IETD-FMK reagens for flekker formål, etter produsentens protokoll (Abcam, Cambridge, MA). Følgende kontroller ble anvendt: 50 pl GB ekstrakt samtidig tilsatt pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK (Abcam) ved 20 uM, som blokkerer bindingen av FITC-IETD-FMK; 2 mM av H
2o
2, som en positiv kontroll for caspase-8-aktivering; 50 ul av PBS som oppløsningsmiddel kontroll; og ubehandlede celler som en negativ kontroll. Cellefordelinger med grønn fluorescens-signalet ble analysert ved hjelp av FL-en detektor. Datainnsamling og analyse av kaspase-8-positive celler ble utført ved hjelp CXP programvare (Beckman Coulter).
Statistisk analyse
Hvert datapunkt ble utført for et minimum tre ganger. For å indikere eksperimentell variabilitet ble data uttrykt som gjennomsnitt med tilsvarende standardavvik. Tosidige paret Student
t
-UNDERSØKELSER ble utført for å etablere statistisk signifikans av forskjeller mellom eksperimentelle prøver og tilhørende kontroller. Å betegne om sammenligninger av to behandlinger har statistisk betydning, en verdi på
P
0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
GB redusert spredning av leukemi /lymfom celler
I utgangspunktet undersøkte vi potensialet anti-proliferativ aktivitet av GB på kreft og ikke- kreft opprinnelse celler ved kvantifisering av det totale antall celler etter 96 timer. GB-behandlede leukemi /lymfom celler viste en statistisk signifikant reduksjon i sine totale antall (
P
0,05, figur 1). Etter normalisering av de PBS-behandlede kontroller til 100%, ble prosentandelen av proliferasjon av GB-behandlede celler beregnes. GB utøves en gradient av inhibering av proliferasjon på leukemi /lymfom-celler og forårsaker reduksjon i celleformering på 73% på NALM-6, 40% på BJAB, 34,5% på YT og 24,7% på Jurkat-celler (figur 1A-D). Interessant, denne anti-proliferativ aktivitet ikke påvirke spredning av Hs27 ikke-kreftceller (figur 1E). I tillegg B-avstamning NALM6-og BJAB var de mest berørte cellene (Figur 1A-B). Således ble disse cellelinjene anvendt i ytterligere eksperimenter for å utforske den mekanisme som ligger til grunn GB cellulær toksisitet. Så langt våre funn tyder på at GB besitter en fortrinnsrett undertrykkelse aktivitet av leukemi /lymfom celleproliferasjon.
Det totale antall celler per milliliter (
y
-aksen) ble kvantifisert ved hjelp av en hemocytometer etter 96 h behandling: (A) NALM-6, (B) BJAB, (C) YT NK-lignende, (D) og Jurkat (E) Hs27 celler. Som en positiv kontroll av en anti-proliferativ effekt, 1 mg /ml G418 ble inkludert. Ubehandlede celler ble anvendt som en indikator på cellelevedyktigheten under alle rugetidsperioder. Flere kontroller av fortynningsmiddel av ekstraktene, PBS, ble også undersøkt. Hver søyle representerer gjennomsnittet av fire gjentak og feilfelt representerer standardavvik. Celleproliferasjon, kommentert av toppen av 50 ul GB behandlede celler, er vist som en prosentandel av celleproliferasjon av PBS-behandlede celler, som er ansett som 100% av vekst. Femti pl GB i PBS tilsvarer 1,5 ± 0,048 mg /ml lyofilisert pulver.
GB induserer cytotoksisitet på pre-B akutt leukemi /lymfom NALM6-celler
Samtidig med kvantifisering av det totale antall celler, bestemt vi hvorvidt GB indusert cytotoksisitet. Overraskende nok ble det observert cytotoksisitet kun i NALM-6-celler, men ikke i BJAB, YT, eller Jurkat-celler (figur 2A-D), noe som tyder på at den observerte anti-proliferativ aktivitet ble ikke nødvendigvis er forbundet med cytotoksisitet. Med unntak av NALM-6, levedyktigheten av leukemi /lymfom cellelinjer gjennomgående lignet verdiene av PBS-behandlede eller ubehandlede kontroller (figur 2). Tilsvarende er en mangel på cytotoksisiteten ble også observert i normale ikke-cancer-avledede celler (figur 2E)
Etter 96 timers inkubering, toksisitet ble observert på (A) NALM-6-celler.; mens (B) BJAB, (C) YT, (D) Jurkat og (e) ikke-cancer Hs27 celler var resistente mot denne toksisk effekt. Cellene ble farget med PI og andelen av cytotoksisitet (
y
-aksen) ble overvåket ved hjelp av en flowcytometrisk metode. Som en positiv kontroll av cytotoksisk aktivitet, ble 1 mg /ml G418 utnyttet. Ubehandlede celler ble anvendt som en indikator på cellelevedyktigheten i løpet av inkubasjonsperioden. Fortynningsmidlet av GB ekstrakt, PBS, ble også analysert. Hver søyle representerer gjennomsnittet av fire gjentak og feilfelt representerer standardavvik. 1 x 10
4 hendelser per prøve ble kjøpt og ble analysert ved hjelp CXP programvare (Beckman Coulter). Femti pl GB i PBS tilsvarer 1,5 ± 0,048 mg /ml lyofilisert pulver.
GB utløser DNA fragmentering og G2 /M arrest på BJAB celler
Cell sykkeldistribusjons Analysene ble utført å omsette i mer detalj mekanismen som GB bruker for å inhibere celleproliferasjon. For dette formål ble BJAB-celler eksponert for 10 og 50 ul N i 96 timer og deretter preparert for analyse av cellulært DNA-innhold
via
flowcytometri. Denne metoden er avhengig av fluorescerende prober som binder DNA, og dermed gjør det hele DNA-innhold pr kjerne som skal overvåkes med presisjon [31]. Relevante forskjeller i cellesyklusfordeling ble observert i celler behandlet med 50 ul GB, mens 10 pl N-behandlede celler ikke oppviser vesentlig endring i cellen frekvensen av alle cellesyklusfaser (3A-D). Celler med apoptotisk fragmentert DNA kan være preget av sin hypodiploid DNA innhold (sub-G0 /G1peak) under univariate cellulær DNA innholdsanalyse. De hypodiploid verdier ble øket til 11,8% i celler behandlet med 50 ul GB, mens det i prøver eksponert for 10 ul GB, PBS eller ubehandlede kontroller, er hypodiploid verdiene var mindre enn 1% (
P
= 0,01173, figur 3). Den 25,4% G0 /G1 verdi i GB-behandlede celler ble signifikant redusert (
P
0,04) sammenlignet med 40,1% og 39% for de PBS-behandlede og ubehandlede celler, respektivt. Forskjeller i frekvensen av celler i S-fasen var umerkelig. Prosentandelen av celler i G2 /M fase for N-behandlede celler var 43,7%, noe som var høyere sammenlignet med enten de cellene som var behandlet med PBS, 37,5%, eller de ubehandlede kontroller, 37.1% (
P
= 0,01945 og
P
= 0,02426, henholdsvis).
Etter 96 h GB indusert apoptotisk DNA fragmentering og G2 /M fase arrest i en doseavhengig modalitet. Cellene ble høstet, permeabilized og farget og analysert
via
flowcytometri. Hver søyle representerer gjennomsnittet av tre uavhengige replikater, og de feilfelt representerer tilsvarende standardavvik. (A-D) Andelen celle frekvens tegnes langs
y
-aksen, og de ulike behandlingene er plottet langs
x
-aksen. (E-I) Representative enkle parameterhistogrammer hvor fire porter er kommentert som viser prosentdelen av celle frekvens i hver fase av cellesyklusen. Gates fra venstre til høyre: sub-G0 /G1 (hypodiploid, regnes som en apoptotisk undergruppe), G0 /G1 (diploide), S (hyperdiploid) og G2 /M (tetraploid). Denne serien av eksperimenter omfattet flere kontroller: to forbindelser vekkende cellesyklus-endring, (G) 80 nM etoposid (ETO) og (H) 1 mg /ml G418; (F) GB fortynningsmiddel, PBS, som inneholdes i de eksperimentelle prøver; og (I) ubehandlede (unt) celler, som en negativ kontroll. Signifikansen av forskjellene mellom 50 ul N-behandlede celler sammenlignet med 50 ul PBS-behandlede celler, og også, med ubehandlede celler, er av
P
0,03 (*) og
P
0,04 (‡), henholdsvis. NO 10 mikroliter = 0,3 ± 0,009 mg /ml, og GB 50 ul = 1,5 ± 0,048 mg /ml lyofilisert pulver.
GB fremkaller phosphatidylserine eksternalisering på B-avstamning cellelinjer
to B-avstamning cellelinjene ble utsatt for GB å skjelne dets potensial induksjon av fosfatidylserin (PS) eksternalisering. Dette ble overvåket
via
annexin V-FITC /PI analyse og flowcytometri. For å avgjøre om GB cytotoksisitet utøves på NALM6-celler også omfattet PS trans, ble eksperimenter utført etter 48 timers inkubasjon med 50 pl GB. På dette tidspunkt, 37,2% av cellene apoptotiske og 24,9% av, og cellene ble nekrotisk (figur 4A). Celler ble behandlet med 50 ul PBS og ubehandlede celler viste ikke en vesentlig økning i enten apoptotiske eller nekrotiske verdier (Figur 4C-D). I tillegg vil økningen av apoptotiske DNA-fragmenteringen som observeres med GB-behandlede BJAB-celler ble ytterligere undersøkt under de samme forhold som ble anvendt for cellesyklus-analyse. GB-behandlede celler var 26,3% annexin V-FITC positiv, i motsetning til 15,1 og 3,4% for PBS-behandlede eller ubehandlede celler, respektivt;
