Abstract
kreft stamceller (cscs), en sjelden befolkning i alle typer kreft, inkludert tykktarmskreft, er tumorigen. Det har vært antatt at cscs er ansvarlig for kreft tilbakefall, metastaser, og stoffet motstand. Isolere cscs i tykktarm kreft er utfordrende, og dermed den molekylære mekanismen som regulerer selvfornyende og differensiering av cscs fortsatt ukjent. Vi dyrket DLD-1-celler, en av typer av celler avledet fra tykktarm kreft, i serumfritt medium for å oppnå sfæroide celler. Disse cellene besatt egenskapene cscs, med uttrykk av CD133, CD166, Lgr5, og ALDH1, høyere kapasiteter på cellegift-motstand, migrasjon, invasjon, og tumorgenisiteten
in vitro Hotell og
in vivo
enn heft DLD-1 celler. Krüppel-lignende faktor 4 (KLF4) er avgjørende faktor for å opprettholde selvfornyelse av voksne og embryonale stamceller. Det har blitt brukt til å indusere pluripotente stamceller (IPS) fra somatiske celler. Siden KLF4 er uttrykt i tykktarmskreftceller, undersøkte vi dens rolle i sfæroide celler isolert fra DLD-1-celler og fant at KLF4 ble overuttrykt bare i sfæroide celler og reduserer ekspresjon av KLF4 ved kort-hårnål RNA signifikant redusert kapasiteten til disse cellene å motstå kjemikalier, migrerer, invadere, og generere svulster
in vitro Hotell og
in vivo
. De sfæroide celler med redusert KLF4 uttrykk hadde også redusert uttrykk for cscs markører og mesenchymale markører. Tatt sammen, dyrking av DLD-1-celler i serumfritt medium beriker cscs og ekspresjon av KLF4 er viktig for egenskapene til cscs i DLD-1; dermed KLF4 kan være en potensiell terapeutisk mål for behandling av tykktarmskreft
Citation. Leng Z, Tao K, Xia Q, Tan J, Yue Z, Chen J et al. (2013) Krüppel-Like Factor 4 Fungerer som et onkogen i Colon Cancer Stem Cell-Beriket spheroid Cells. PLoS ONE 8 (2): e56082. doi: 10,1371 /journal.pone.0056082
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 07.12.2012; Godkjent: 03.01.2013; Publisert: 13. februar 2013
Copyright: © 2013 Leng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av staten Foundation for naturvitenskap i Folkerepublikken Kina 81071541 /H1504 (til HZ) [https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm]. Den Funder hadde ingen rolle i studien design, dato innsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er den vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden [1], [2]. Nåværende behandlingsformer, inkludert kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, ble rettet mot alle kreftceller. Suksessen til disse behandlinger er sterkt hemmet hovedsakelig på grunn av eksistensen av terapi-resistente tumorceller som er i stand til å utvikle seg til hele tykktarmskreft etter terapi [3]. Det har vært antatt at disse cellene er kreft stamceller (cscs), som har evnen til å fornye seg selv og differensiere til alle typer celler i tykktarmskreft [4]. Cscs eksisterer i forskjellige typer kreft. De er sjelden i kreft, men veldig tumorigent og også ansvarlig for kreft progresjon. Når transplantert i immunsvikt mus, cscs viser høy tumorigenecity. Det er også blitt vist at cscs er celler som er ansvarlige for kreft tilbakefall, metastase, og medikamentresistens [5], [6]. Derfor er en effektiv terapi for å behandle en cancer krever det for effektivt å målrette cscs i kreft [7].
cscs i ulike typer av kreft har spesifikke overflatemarkører som tillater forskere til å isolere dem. I tykktarmskreft, cscs er positive for CD133 +, CD44 +, CD166, Lgr5, ALDH1, og ESA. Colon cscs har også muligheten til å utvise Hoechst 33342 fargestoff [8] – [19]. Men cscs er svært sjeldne, og i mange tilfeller kan de ikke bli oppdaget. Dermed blir isolering av cscs i tykktarm kreft basert på deres overflatemarkører ekstremt vanskelig [20].
cscs i noen cancercellelinjer, inkludert kolon kreft, kan isoleres ved dyrking av cellene i serumfritt medium for å danne kuler. I denne tilstanden, sfæroide celler som uttrykker «stemness» relaterte gener og har høy kapasitet til å migrere, invadere, og generere tumorer [20], [21], [22], [23]. I serumfritt medium, kan mange humane koloncancercellelinjer, inkludert HCT116, HT29, LoVo, SW480 og DLD-1-cellelinje, danne kuler [22].
mekanismer som cscs fra forskjellige typer av kreft opprettholde sin «stemness» har blitt grundig studert. Kapasiteten til selvfornyelse er dreibar for cscs opprettholde og for kreft tilbakefall [12], [23], [24], [25], [26], [27] KLF4 er viktig å opprettholde det karakteristisk for cscs og som kreves for evnen til å migrere og invadere i brystkreft [28]. Mange grupper rapportert at KLF4 uttrykkes og fungerer som en tumor suppressor i tykktarmskreft [29], [30], [31], [32]. Imidlertid, som rapportert, bulk celler av tumoren er i stand til å generere nye celler. Mens cscs kan regenerere alle celletypene i tumoren gjennom deres stamcelle-lignende oppførsel og føre til tilbakefall av kreft [6]. Således cscs og hoveddelen av kreftceller er meget heterogen. Disse studiene ikke skille kolon cscs fra bulk kreftceller.
KLF4 er en sink finger transkripsjonsfaktor. Det har blitt demonstrert at KLF4 regulerer proliferasjon, differensiering, apoptose, og metabolisme av thymocyto og tykktarm slimcelle, henholdsvis [33], [34]. I muse, er KLF4 viktig for selvfornyelse av embryonale stamceller [35]. KLF4 også brukes til å omprogrammere musefibroblaster til pluripotente stamceller, noe som tyder rolle KLF4 på å opprettholde egenskapene til stamceller [36]. Viktigere, de normale stamcellene demonstrere felles kjennetegn til kreft stamceller, vil det også være viktig å bestemme hvorvidt tilsvarende regulering skjer i stamceller og kreft stamceller. Så om vi KLF4 er uttrykt i tykktarm cscs og dens funksjoner av KLF4 i tykktarmskreft må tas opp.
I denne studien har vi utforsket potensielle roller KLF4 i cscs-beriket sfæroide celler. Vi først dyrkede DLD-1 celler i serumfritt medium for å få sfæroide celler som innehar egenskapene til cscs, og da vi spurte om KLF4 ble overuttrykt i sfæroide cellene og om redusert KLF4 uttrykk i sfæroide cellene ville forstyrre deres egenskaper.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk ved Universitetet i Huazhong University of Science and Technology (Permit Number: S255). Alle operasjoner ble utført under en blanding av ketamin og klorpromazin anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cellelinjer
Menneskelige tykktarmskreft cellelinjer DLD-en, SW480, SW620, Løvø og human colon normal epitel FHC-cellelinjen var kommersielle kilder, og mediet for hver cellelinje ble bestemt i henhold til American Type Culture Collection (ATCC) eller til den publiserte referanse. DLD-1, SW620 og SW480 celler ble dyrket i RPMI1640 (Hyclone) komplett medium [37]. Andre tykktarmskreft cellelinjer, HCT116 og HT29 ble vennlig levert av Dr LIU og ble dyrket i McCoys 5A (Sigma) komplett medium [38]. Humant kolon normal epitel FHC-celler ble dyrket i DMEM /F12 (Hyclone) komplett medium. Løvø celler ble dyrket i DMEM (Hyclone) komplett medium [39].
sfære kultur ble utført som beskrevet tidligere [22]. Kort beskrevet, ble hver linje av tykktarmskreftceller dyrket ved en tetthet på 2 x 10
6 celler /ml i serumfritt DMEM /F12 medium inneholdende 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF, Peprotech) 10 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, Peprotech), 5 ug /ml insulin (Sigma), 0,4% bovint serumalbumin (Amresco), og 2% B27 (Invitrogen). Å passasje kuler, samlet vi dem ved å sentrifugere dem på 73 g i 5 minutter. Sfærer ble dissosiert til enkeltceller ved hjelp av trypsin fordøyelse. Enkelt sfæroide celler ble dyrket som beskrevet ovenfor. Alle celler ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
Isolering av CD133 + og CD133- Celler
CD133 + og CD133- celler ble isolert fra cellekultur av magnetiske kuler sortering ved hjelp av MACS-systemet (Miltenyi Biotech) eller ved hjelp av FACS [12], [40]. For begge separasjoner ble celler inkubert med de monoklonale CD133 /2-PE (Miltenyi Biotech) i 15 minutter ved 4 ° C. For magnetisk separasjon, ble cellene valgt av MS kolonner (Miltenyi Biotech), som beholdt positive celler koblet av perler. For FACS-separasjon, ble CD133 /2-PE fargede celler sortert med BD FACSCanto II Flowcytometer instrument (BD Bioscience), og isotype IgG2b (Miltenyi Biotech) ble anvendt som kontroll.
Lentiviral Infeksjon av sfæroid celler
lentiviral vektorer som bærer KLF4 shRNA (NM004235.3, 1582-1610) eller en egge non-target shRNA ble kjøpt fra Shanghai GeneChem Co., Ltd de sfæroide celler ble infisert i henhold til produsentens instruksjoner.
real-time PCR
Totalt mRNA ble ekstrahert fra cellene og deretter omvendt transkribert til cDNA med PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Å måle mRNA-nivåer av gener i hver prøve, ble intercalator-baserte real-time PCR anvendt. Glyseraldehyd-3-phpsphate-dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll. The real-time PCR ble utført med SYBR Grønn Master Mix (Takara, Japan) i StepOnePlus ™ Real-time PCR system (Applied Biosystems, USA). PCR-amplifisering av genene ble utført under de betingelser: denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 60 s, og forlenget ved 95 ° C i 5 s; Reaksjonene ble utført i 45 sykluser. For hver prøve ble reaksjoner duplisert og gjennomsnittlig mRNA nivået for hvert gen ble bestemt ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Primerene for å måle nivået av hvert gen er oppført i tabell S1.
immunfluorescens Farging
Uttrykk for CD133, KLF4, E-cadherin og vimentin i monolagcellene og kuler var også analysert med immunfluorescens teknikk. For å utføre immunofluorescens-analyse ble celler dyrket i passende medium på glassdekk i 16 timer før fiksert med 2% paraformaldehyd ved 37 ° C i 15 min. Fikserte celler ble deretter permeablized med 0,1% Triton X-100 ved romtemperatur i 15 minutter, fulgt av inkubering ved 4 ° C over natten med følgende primære antistoffer: CD133 /2 (Miltenyi Biotec), E-cadherine (Santa Cruz Biotec), vimentin (Cell Signaling Technology), og KLF4 (Santa Cruz Biotec), henholdsvis. På neste dag ble cellene deretter inkubert med PE- eller FITC-konjugert sekundært antistoff (BOOSTER) ved romtemperatur i 1 time. Disse lysbildene ble deretter montert med Forleng Gold med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, Invitrogen). Fluorescent bildene ble tatt med Olympus IX71 epifluorescence (Olympus, Japan).
Western Blot analyse
Protein ekstrakter ble separert ved elektroforese på ulike konsentrasjoner av SDS-polyakrylamidgeler avhengig forventede størrelser av målt proteiner og overført til PVDF-membraner (Millipore, USA). Etter blokkert med 5% fettfri melk og 0,1% Tween 20 i TBS i 1 time, ble membranen deretter inkubert ved 4 ° C over natten sammen med de primære antistoffer etterfulgt av inkubasjon med geite-anti-kanin sekundære antistoffer. Primære antistoffer som benyttes i denne analyse er: kanin anti-E-cadherin, kanin anti-vimentin, kanin anti-ZO-1, og kanin-anti-sneglen (Cell Signaling Technology); kanin anti-KLF4 og kanin anti-Lgr5 (Santa Cruz Biotec).
Kjemoterapi Følsomhet og Resistance analysen
Følsomheten for tykktarmskreftceller til 5-FU ble analysert ved hjelp av CCK-8 assay kit (DOJINDO, molekylær technolonies, Inc, Japan) i henhold til produsentens anvisninger. I korthet ble 2000-celler sådd i hver brønn i 96-brønners plater inneholdende vekstmedium supplert med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU (Sigma) og inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktig tilstand i 48 timer. Absorpsjonen av hver brønn ble avlest ved 450 nm på en plateleser. Overlevelsesgraden av cellene ble beregnet som følger:. Absorpsjon av eksperiment /absorpsjon av kontroll x 100%
Annexin V-APC /PI dobbeltmerking
Cell ble oppsamlet, vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og farget med Annexin V-APC (Keygen, Kina) og PI (Sigma) både i 30 minutter ved romtemperatur i mørke i henhold til produsentens instruksjoner. Alle fargede cellene ble deretter undersøkt ved hjelp av BD FACSCanto II Flowcytometer instrument (BD Biovitenskap).
Soft Agar analysen
Soft agar-analysen ble utført for sfæroide celler som tidligere beskrevet [41]. Kort beskrevet, ble hver brønn av en 6-brønns plate lastet med 2 ml 0,5% agar (vekt /volum) i RPMI1640 supplementert med 10% FBS som base. Etter polymeriseringen av basen agar, 1 x 10
4 celler blandet i 2 ml 0,375% agar (vekt /volum) i RPMI 1640 supplert med 10% FBS ble tilsatt. Kulturer ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 i 2 uker før koloniene ble tellet og fotografert.
Colony Forming Assay
kolonidannelse assay ble utført i adherente DLD-1-celler som tidligere beskrevet [27]. I korte trekk ble enkelt celler (2.000 celler pr brønn) sådd ut i 6-brønns plater og dyrket i 2 uker. Etter farget med fiolett, ble cellene fotografert og analysert for deres proliferasjon og kolonidannelse effektivitet. Alle forsøkene ble utført minst tre ganger.
Cell migrasjon og invasjon analysen
Migrasjon og invasjon analysen ble utført som beskrevet tidligere [42]. Kort sagt ble 10
6-celler sådd ut på cellekultur innsatser med 8 um mikroporøse filtere (BD Bioscience) belagt med (invasjon) eller uten (migrasjon) matrigel (Sigma) og inkubert i 20 timer, henholdsvis. De migrerte eller invaderte celler ble farget med 0,1% krystallfiolett og tellet i fem tilfeldige felt. Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
In vivo
tumorigenesis
Celler ble oppnådd ved trypsinert høstet kuler. Ulike mengder av celler (1 x 10
4, 5 × 10
4, 1 × 10
5, 5 × 10
5 eller 1 × 10
6 celler) i 200 mL PBS ble subkutant transplantert inn i 4- til 6-uker gamle atymiske hunn Balb /c-nu /nu-mus (Beijing HFK Bioscience). Tumorstørrelsen ble målt hver 4. dag ved hjelp av et skyvelære. Volumet av hver tumor ble bestemt ved hjelp av formelen: lengde x bredde
2 × 0,5. Alle dyr arbeidet hadde blitt utført i henhold til guidline av Etisk Commission of Huazhong University of Science and Technology (S255). Mus ble plassert i et bestemt patogen-fri, miljøkontrollert anlegg. Mus ble ofret med pentobarbitalnatrium intraperitoneal injeksjon, og implantatene ble fjernet når tumorene nådde en lengde på 2,0 cm, eller 60 dager etter injeksjon, når det var først [41]. Høstet svulster var forberedt på histopatologiske analyse.
Histopatologisk analyse
Svulster ble høstet og fiksert i 4% formalin i 24 timer før innebygd i parafiner. Seksjoner (2,5 mikrometer) ble innhentet og farget med H E. Bilder ble tatt med Olympus IX71 (Olympus, Japan).
Statistical Analysis
Hver eksperiment ble utført minst tre uavhengige forsøk. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en student
t
-test, der
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Generering av spheroid Cells fra Colon Cancer Cell Lines
Tidligere studier viste HCT116 og HT29 kolon kreftceller danne kuler når de dyrkes i serumfritt medium, og de sfæroide celler besitter egenskapene til cscs [22], [43], [44]. Vi spurte om HCT116, kan HT29, SW620, SW480, LoVo, og DLD-1-celler dannes kuler når de dyrkes i serumfritt medium, respektivt. Celler fra hver cellelinje ble dyrket i en tetthet på 2 x 10
6 /ml i serumfritt medium. På dag tre, kunne vi se sfære formasjon fra HCT116, HT29, SW620, Løvø, og DLD-en, men ikke fra SW480 (figur 1 og data ikke vist). Kulene økt i størrelse langs tiden. Videre kan de sfæroide cellene i kulene skal passeres i mer enn 25 ganger uten tap av egenskaper testet under, noe som indikerer at de kan ha kapasitet til å fornye seg selv. Fordi DLD-1 cellene danner kuler lettere enn andre tykktarmskreft linjer testet ovenfor, brukte vi kun fokusert på DLD-1 celler i følgende eksperimenter. For vår praktiske beskrivelse, utpekte vi sfæroide celler fra DLD-en som DLD-S.
HT29, HCT116, SW620, LoVo, og DLD-1 celler kan danne store runde, fristilt flytende colonsphere på 50-100 um når dyrket i SFM (som vist i DLD-1 gruppe). Mens SW480 kunne ikke.
Karakterisering av spheroid Cells
Vi først spurt om DLD-S uttrykte overflatemarkører cscs av tykktarmskreft og stamcellekjernegener. Vi fant at uttrykket av stamcellekjerne gener som Oct4 /3, Sox2 og Nanog og markørgener kolon cscs, for eksempel CD133, CD166, Lgr5, og ALDH1 ble økt i DLD-S-celler sammenlignet med deres uttrykk nivåer i DLD-en (figur 2A), noe som tyder på at sfæroide celler kan ha høy andel av cscs.
(A) uttrykk for CD133, CD166, Lgr5, ALDH1 og stamcellekjernegener Oct4 /3, Sox2 og Nanog i sfæroide celler var oppregulert i forhold til DLD-1 heftende celler. (B) Andre sfæroide celler ble åpenbart observert sammenlignet med foreldre DLD-1-celler, analysert ved hjelp av transwell migrering og invasjon assay, respektivt. (C) Som bestemt ved mykagar assay og kolonidannelsesbestemmelsen, de sfæroide cellene utviser høyere kapasitet for kolonidannelse. (D) Som bestemt ved den CCK8 analysen, er overlevelsen av sfæroide celler øket sammenlignet med adherente celler i forskjellige konsentrasjoner av 5-FU. (E) som vurderes av mus xenograft modell, de sfæroide cellene hadde høyere tumorigent evne enn sine foreldre DLD-1 celler. * P. 0,05
Vi undersøkte ondartet profilen til DLD-S-celler, inkludert deres evne til å migrere og invadere, for å danne kolonier, for å svare på 5-FU, og å generere svulster i immunsvikt mus. Ved hjelp av transwell migrasjon /invasjon analysen, fant vi at DLD-S-celler hadde betydelig høyere kapasitet til å migrere og invadere Matrigel-belagte innsatser enn sine foreldre celler, DLD-en, gjorde (figur 2B).
Ved hjelp av soft agar analysen og kolonidannelse analysen, fant vi at DLD-S hadde betydelig høyere kolonidannelse kapasitet enn sine foreldre celler, DLD-en (figur 2C).
for å teste følsomhet for DLD-S til kjemoterapi, vi behandlet celler med 5-FU ved forskjellige konsentrasjoner. Overlevelse av DLD-S og DLD-en i vekstmedium med samme konsentrasjon av 5-FU ble sammenlignet, og vi fant ut at DLD-S hadde signifikant høyere overlevelse i testede konsentrasjoner av 5-FU enn sine foreldre celler, DLD- 1 celler gjorde, noe som indikerer at DLD-S var mer resistent mot kjemoterapi (figur 2D).
til slutt, vi undersøkt tumorigent evne til DLD-S-celler
in vivo
. Ulike mengde DLD-S eller DLD-en (1 × 10
4, 5 × 10
4, 1 × 10
5, 5 × 10
5 eller 1 × 10
6 celler) ble injisert subkutant i Balb /c-nu /nu-mus og mus med tumordannelse ble tellet ved 60 dager etter celletransplantasjon. Vi fant ut at DLD-S-celler hadde høyere tumorigent evne enn sine foreldre celler, DLD-1 (tabell S2). En mus transplantert med 1 × 10
5DLD-S eller DLD-1 celler på 60 dager ble vist i figur 2E.
Uttrykk av KLF4 i tykktarm kreft celler og cscs-beriket populasjoner
Vi prøvde først å bekrefte at de uttrykk for KLF4 i ulike tykktarmskreft cellelinjer var lavere enn vanlig kolon epiteliale cellelinjer som tidligere rapportert [45]. Uttrykket nivåer av KLF4 i SW620, HT29, SW480, HCT116, DLD-en, og Løvø menneskelige tykktarmskreft cellelinjer samt FHC, en normal kolon epitel cellelinje, ble analysert ved hjelp av real-time PCR og Western blotting-analyse. Som forventet, ble det KLF4 uttrykt i alle testede cellelinjene og mRNA-nivåer (figur 3A) og proteinnivåer (figur 3B og 3C) i disse kreftcellelinjer var betydelig lavere enn den FHC-cellelinjen.
(A) Som bestemt ved real-time PCR, ekspresjon av KLF4 i flere tykktarmskreftcellelinjer var betydelig lavere enn den normale tykktarms epitelcellelinje. (B og C) Som bestemt ved Western-blot, ekspresjonen av KLF4 i flere tykktarmskreftcellelinjer var betydelig lavere enn den normale tykktarms epitelcellelinje. (D) Uttrykket av KLF4 var signifikant høyere i sfæroide celler enn i DLD-en, HT29, HCT116 heftende celler som vurderes av Real-time PCR og Western-blot, henholdsvis (som vist i DLD-en gruppe). (E) som vurderes av Real-time PCR, uttrykk for KLF4 var signifikant høyere i CD133 + celler enn i CD133-celler fra DLD-en. * P. 0,05
Vi deretter sammenlignet uttrykket nivåer av KLF4 i sfæroide celler og heftende celler av DLD-en, HT29 og HCT116-celler, og fant at mRNA og proteinnivåer KLF4 var betydelig høyere i sfæroide celler enn i adherente celler (figur 3D og dato ikke vist). Vi videre sortert CD133 + og CD133- celler fra DLD-1 celler ved MACS separasjonsteknologi og målte mRNA nivåer i begge undergrupper av DLD-1 celler ved hjelp av real-time PCR. Vi har observert at mRNA nivået av KLF4 var signifikant høyere i CD133 + celler enn i CD133- celler (figur 3E). Uttrykk for CD133 og KLF4 i DLD-S-celler ble ytterligere bekreftet ved immunfluorescens farging (figur 4). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at KLF4 er mest sannsynlig uttrykt i CD133 + undergruppe og DLD-en-avledet sfæroide celler, som beriket cscs, utfordrende forrige konklusjon at KLF4 fungerer som en tumor suppressor i tykktarm kreft progresjon.
Immunofluorescensanalyse bekrefter tilstedeværelsen av CD133 og KLF4 på DLD-1 og DLD-S-celler, er kjernen farget med DAPI.
knockdown av Expression of KLF4 i spheroid Cells Altered deres Stemness
Vi spurte om KLF4 er viktig for selvfornyelse og /eller ondartet profilen til sfæroide celler fra DLD-en. For dette formål genererte vi DLD-S siKLF4 ved å infisere DLD-S-celler med KLF4-shRNA lentiviral vektoren og DLD-S SICON ved å infisere DLD-S-celler med ikke-target-shRNA lentiviral vektor. Vi først undersøkte apoptose av DLD-S SICON og DLD-S siKLF4 celler for å utelukke at den reduserte evnen til cellegift-motstand, migrasjon, invasjon og tumorgenisiteten av siKLF4 DLD-S-celler skyldes økt apoptose ved å banke ned KLF4 uttrykk og fant at overlevelsen var lik blant både DLD-S SICON og DLD-S siKLF4 celler (figur 5A). Deretter studerte vi mRNA og proteinnivåene av KLF4 i disse viral infeksjon DLD-S-celler og fant at både mRNA og proteinnivåene av KLF4 var signifikant lavere i DLD-S siKLF4 celler enn i DLD-S SICON celler (figur 5B), som tyder på at KLF4 genekspresjon ble vellykket slått ned.
(A) overlevelses~~POS=TRUNC var lik blant både DLD-S SICON og DLD-S siKLF4 celler som vurderes av Annexin-V APC /PI Dobbel Merking analysen. (B) uttrykk for KLF4 ble effektivt banket ned i DLD-S-celler. (C) cytometriske analyser av CD133 + celler. Den CD133 + fraksjonen ble betydelig redusert etter banket ned KLF4 i DLD-S-celler. (D) uttrykk for CD133, CD166, Lgr5, og ALDH1 var betydelig lavere i DLD-S siKLF4 enn i DLD-S SICON. (E) Cultured i SFM, DLD-S siKLF4 celler dannes små kuler i et betydelig lavere frekvens enn DLD-S SICON celler gjorde. * P. 0,05
Vi spurte om knockdown av KLF4 uttrykk i DLD-S endret sin CSC-markør genuttrykk ved hjelp FACS analyse, real-time PCR og Western blotting-analyse. Vi har funnet at antall CD133 + celler er signifikant lavere i DLD-S siKLF4 celler enn i DLD-S SICON celler (figur 5C) og ekspresjon av alle CSC-markørgener, inkludert CD133, CD166, Lgr5, og ALDH1, betydelig lavere i DLD-S siKLF4 enn i DLD-S SICON (figur 5D). Til slutt spurte vi om knockdown av KLF4 påvirket selvfornyelse av DLD-S. Når dyrket i serumfritt medium, DLD-S siKLF4 celler dannes små kuler i en vesentlig lavere frekvens enn DLD-S SICON celler gjorde (figur 5E), noe som tyder på at KLF4 er avgjørende for den selvfornyelse av DLD-S-celler.
knockdown av Expression of KLF4 endret ondartet profil~~POS=HEADCOMP spheroid Celler av DLD-1 celler
Vi videre undersøkt om knockdown av KLF4 uttrykk i DLD-S ville endre sin ondartet profil ved å sammenligne evnen av DLD-S siKLF4 og DLD-S SICON til å migrere og invadere, for å danne kolonier, til å reagere med 5-FU, og for å generere tumorer i immundefekte mus. For det første, ved hjelp av transwell analysen, fant vi at DLD-S siKLF4 migrert og invaderte betydelig tregere enn DLD-S SICON celler (Figur 6A). Dernest, vi testet overlevelse av DLD-S siKLF4 celler i vekstmedium med 5-FU og funnet at DLD-S siKLF4 hadde betydelige lavere overlevelse enn DLD-S SICON celler (Figur 6b). For det tredje, ved hjelp av myk-agar assay og kolonidannelsesbestemmelsen, har vi funnet at DLD-S siKLF4 celler dannet signifikant lavere antall kolonier og mindre kolonier enn DLD-S SICON (figur 6C). Til slutt, vi brukte mus xenograft modell for å spørre om KLF4 kreves for
in vivo
tumorigenesis av CSC-beriket DLD-S-celler. En million DLD-S siKLF4 eller SICON celler ble subkutant injisert i hver Balb /c nu /nu mus, respektivt. Vi fant at tumorer ble dannet i mus transplantert med DLD-S SICON celler tidligere, og betydelig større enn i mus transplantert med DLD-S siKLF4 celler (figur 6D). For eksempel, på dag 56 etter celleinjeksjon, svulster hos mus som fikk DLD-S SICON vokste til et gjennomsnitt på 1256.52 mm
3 i volum, mens svulster hos mus som fikk DLD-S siKLF4 vokste bare å gjennomsnitt på 374.11 mm
3. Histologi av xenografttumorer ble undersøkt av HE farging. Det var ingen signifikant histologisk forskjell mellom DLD-S SICON og DLD-S siKLF4 grupper (figur 6E). Samlet utgjør disse resultatene antydet at knockdown av KLF4 uttrykk i DLD-S-celler ødelagt kapasiteten til disse cellene til å migrere, invadere, motstå 5-FU, og generere svulster.
(A) DLD-S siKLF4 migrert og invaderte betydelig tregere enn DLD-S SICON celler, vurderes av transwell analysen. (B) som vurderes av CCK8 analysen DLD-S siKLF4 hadde betydelige lavere overlevelse enn DLD-S SICON celler i ulike konsentrasjoner av 5-FU. (C) DLD-S siKLF4 celler dannet signifikant lavere antall kolonier og mindre kolonier enn DLD-S SICON. (D og E) DLD-S SICON celler dannes svulster tidligere og betydelig større enn i mus transplantert med DLD-S siKLF4 celler. Det var ingen signifikant histologisk forskjell mellom DLD-S SICON og DLD-S siKLF4 grupper. Originale forstørrelser × 200. * P. 0,05
Knocking Down KLF4 Expression Undertrykker Epitelial-mesenchymale overgang i spheroid Cells
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) prosessen er nært beslektet med metastatisk funksjon i kreftceller [46], [47]. Kreftceller engasjerende EMT prosessen uttrykke mesenchymale gener som vimentin, sneglen, og slug, mens uttrykk for epiteliale markørgener, for eksempel E-cadherin og ZO-1 er redusert. Disse cellene har også lignende ondartet profil som cscs eller kreftfrem initiere celler gjør. Vi først vist at, i motsetning til DLD-1 celler, DLD-S uttrykt et typisk epitel markør, E-cadherin og en typisk mesenchymale markør, vimentin ved immunfluorescens og Real-time PCR-analyse (figur 7A og 7B), noe som tyder på at DLD-S var i besittelse funksjonene i cellene som går gjennom EMT. Vi deretter sammenlignet uttrykket av epitelceller og mesenchymale markører blant DLD-S siKLF4 og DLD-S SICON celler og funnet at DLD-S siKLF4 celler hadde betydelige høyere proteinnivåer av ZO-1, men signifikant lavere proteinnivåer E-cadherin og vimentin enn DLD-S SICON (figur 7C). Interessant, uttrykket av sneglen var lik blant både DLD-S siKLF4 og DLD-S SICON. Disse resultatene tyder på at KLF4 er nødvendig for å fremme EMT prosess i tykktarm sfæroide celler.
(A) Immunofluorescensanalyse på DLD-S SICON og DLD-S siKLF4 celler for E-cadherin og vimentin, kjernen er farget med DAPI . (B) som vurderes av real-time PCR, DLD-S-celler hadde betydelige høyere mRNA nivåer av E-cadherin, vimentin og Snail. Ekspresjonen av ZO-1 ble redusert. (C) DLD-S siKLF4 celler hadde betydelige høyere proteinnivåer av ZO-1, men signifikant lavere protein nivåer av E-cadherin og vimentin enn DLD-S SICON. Uttrykket av sneglen var lik blant dem. * P. 0,05
Diskusjoner
I denne studien, var vi i stand til å berike cscs fra flere tykktarmskreft cellelinjer ved å dyrke dem i serumfritt medium. Kulene dannet i serumfritt medium inneholdt sfæroide celler, som er besatt kjennetegn ved kolon cscs: første, disse cellene hadde høy ekspresjon av markørgener kolon cscs og stamceller (figur 2A); andre, disse cellene var mer ondartet funksjoner enn foreldre DLD-1-celler (figur 2B, 2C og 2D); endelig, disse cellene viste økt tumordannelse når subkutant transplantert inn i immunodefekte mus (figur 2E). Andre har også brukt serumfritt medium system for å få cscs anriket kuler fra HCT116, HT29 kolon cancer-cellelinjer [22], [43], [44]. Det er verdt å påpeke at dette cscs berikende metoden er ikke egnet for alle tykktarmskreft cellelinjer. For eksempel, i vår studie, var vi ikke i stand til å berike kuler fra SW480 å bruke denne metoden.
Vi konkluderte også med at KLF4 var nødvendig for egenskapene til kolon cscs. Først KLF4 bare ble sterkt uttrykt i CSC-anrikede sfæroide celler av DLD-1, HCT116, HT29-celler og CD133 + celler isolert fra DLD-1 celler (figur 3D, 3E, og dato ikke vist). For det andre, banket ned KLF4 uttrykk i DLD-S-celler redusert antall CD133 + celler og redusert uttrykket nivåer av tykktarmskreft stamcellemarkørgener (figur 5C og 5D) og disse cellene kan ikke effektivt danne kuler i serumfritt medium ( Figur 5E). Tredje, DLD-S-celler med redusert KLF4 uttrykk viste forkrøplet kapasitet til å migrere, invadere, motstå til 5-FU, og generere svulster (Figur 6A, 6B, 6C, 6D, og 6E).
