Abstract
Svulster inneholde en liten bestand av kreft stamceller (CSC) er foreslått å være ansvarlig for svulst vedlikehold og tilbakefall. Aldehyd-dehydrogenase 1 (ALDH1) aktivitet har blitt brukt som en funksjonell stamcelle markør for å isolere cscs i forskjellige krefttyper. Denne studien brukte Aldefluor® analysen og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse for å isolere ALDH1
høye celler fra fem menneskelige sarkom cellelinjer og en primær chordoma cellelinje. ALDH1
høye celler varierer fra 0,3% (MUG-Chor1) til 4,1% (SW-1353) av gated celler. Immunhistokjemisk farging, analyse av klone formasjon effektivitet, og xCELLigence mikrosensorteknologi avdekket at ALDH1
høye celler fra alle sarkom cellelinjer har økt spredning hastighet i forhold til ALDH1
lave celler. Ved å undersøke viktige regulatorer av stamcellebiologi, real-time RT-PCR data viste en økt uttrykk av c-myc, β-catenin, og SOX-2 i ALDH1
høy befolkning og en betydelig høyere nivå av ABCG2. Statistisk analyse av data viste at ALDH1
høye celler av SW-982 og SW-1353 viste høyere motstand mot brukte kjemoterapeutika som doxorubicin, epirubicin og cisplatin enn ALDH1
lave celler. Denne studien viser at på forskjellige sarkom cellelinjer, kan høy ALDH1 aktivitet brukes til å identifisere en subpopulasjon av celler som er kjennetegnet ved en betydelig høyere spredningshastighet, økt kolonidannende, økt ekspresjon av ABC-transportør gener og stemness markørene sammenlignet med kontrollceller. I tillegg ble forbedret resistens demonstrert
Citation. Lohberger B, Rinner B, Stuendl N, Absenger M, Liegl-Atzwanger B, Walzer SM, et al. (2012) aldehyd dehydrogenase 1, en potensiell markør for kreftstamceller i Human Sarkom. PLoS ONE 7 (8): e43664. doi: 10,1371 /journal.pone.0043664
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 19 april 2012; Godkjent: 23 juli 2012; Publisert: 23 august 2012
Copyright: © Lohberger et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ved Medical University of Graz (START tilskudd), er OENB stipend (# 14356) og «EccoCell» gi stor hjelp. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
cellepopulasjon av de fleste tumorer er heterogen med hensyn til dens spredning kapasitet og evne til å initiere tumordannelse i immun-manglende mus. En kreft stamcelle (CSC) er definert som en celle i en svulst som besitter evnen til å fornye seg selv og for å generere de heterogene linjer av kreftceller som omfatter svulsten [1], [2]. Tallrike undersøkelser har gitt bevis for at cscs eksistere i en rekke humane tumorer så som hematopoietiske maligniteter, hjernetumorer, brystkreft, kreft og gastroenterologisk- [3], [4], [5], [6].
cytosoliske aldehyd-dehydrogenase (ALDHs) er en gruppe enzymer som er involvert i å oksydere en rekke intracellulære aldehyder til de tilsvarende karboksylsyrer [7]. Blant teser enzymer, er ALDH1 trodde å ha en viktig rolle i oksidasjon av alkohol og vitamin A og i cyklofosfamid chemoresistance. Ginestier et al. [8] viste at ALDH1 var en markør av normale og maligne humane bryst stamceller og en prediktor for dårlig klinisk resultat av brystkreftpasienter. Høy ALDH1 aktivitet har blitt brukt til å definere stamcellepopulasjoner i mange krefttyper, inkludert human multippel myelom, akutt myeloid leukemi [8], bukspyttkjertelkreft [9], og brystkreft [10]. Derfor kan ALDH1 aktivitet være brukbare som en felles markør for maligne stamcellepopulasjoner [11]. Svikt i kreftkjemoterapi kan skje gjennom økt utstrømning av kjemoterapeutiske midler, noe som fører til reduksjon av intracellulære nivåer av legemiddel og påfølgende medikament ufølsomhet. ABC transportører har kapasitet til å eksportere mange cytotoksiske medikamenter og nyere bevis tyder på at kreft stamcelle-fenotypen er assosiert med ekspresjon på høyt nivå av den ABCG2 transportøren [12], [13], [14].
I denne studien brukte vi Aldefluor® analysen og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse for å isolere ALDH1
høye celler fra fem menneskelige sarkom cellelinjer og en nylig etablert chordoma cellelinje. Vi analyserte ALDH1
høye celler
in vitro
for deres repopulation kapasitet, clonogenicity, celleproliferasjonsprosesser egenskaper, uttrykk for stamcellemarkører og ABC transportører, og deres multiresistens kapasiteter.
Materialer og metoder
Cell Culture
Alle menneskelige sarkom cellelinjer (SW-684, SW-872, SW-982, SW-1353, og TE-671 ble hentet fra CLS ( Eppelheim, Tyskland) og dyrket i Dulbecco’s-modifiserte Eagles medium (DMEM-F12) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 0,25 ug amfotericin B. MUG-Chor1-celler ble dyrket i IMDM /RPMI 1649 (04:01) (PAA, Pasching, Østerrike) supplementert med 1% L-glutamin og 1% ITS (PAA). Alle celle inkubering ble utført ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO2 og kulturer blir jevnlig sjekket for mycoplasma. Kultur medium og kosttilskudd ble kjøpt fra GIBCO®, Invitrogen (Darmstadt, Tyskland).
fluorescens versus frem scatter ble vist i en tetthet blot fra (A ) DEAB kontrollceller og (B) ALDH1-uttrykke celler (kalt ALDH1
høy). (C) ALDH1 uttrykk i% av gated celler. Den høyeste andelen av ALDH1
høy-celler er representert ved SW-684-celler (1,77 ± 0,9%, n = 12), SW-982-celler (2,23 ± 1,0%, n = 11), og SW-1353 celler (2,69 ± 1,3%, n = 8). (D) Etter to uker dyrket den ALDH1
høy befolknings generert en betydelig høyere redegjørelse for ALDH1
høye celler. (E) Den forbedrede ALDH aktivitet ble også demonstrert av western blot.
Aldefluor® analysen og Separasjon av ALDH1
+ cellepopulasjonen ved FACS Analyse
aldehyd dehydrogenase (ALDH) enzymaktivitet i levende celler ble bestemt ved hjelp av et fluorogent fargestoff basert Aldefluor® analysen (Stem Cell Technologies, Grenoble, Frankrike) i henhold til produsentens instruksjoner. 1 x 10
6 /ml celler ble suspendert i Aldefluor® analysebuffer inneholdende ALDH substrat (BODIPY-aminoacetaldehyd) og inkubert i 45 minutter ved 37 ° C. Som en referanse kontroll, ble cellene suspendert i buffer inneholdende Aldefluor® substrat i nærvær av diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en spesifikk ALDH1 enzyminhibitor. De lyst fluorescerende ALDH1-uttrykke celler (ALDH1
høy) ble påvist i grønn fluorescens kanal (520-540 nm) av FACSAria (BD Biosciences, San Diego, California) og dataene ble analysert ved hjelp av FACS DIVA programvare (BD Biosciences ). For å utelukke ikke-levedyktige celler propidiumjodid. (PI; Sigma Aldrich, Wien, Østerrike) ble tilsatt ved en sluttkonsentrasjon på 2 ug /ml
immunhistokjemisk analyse ved anvendelse av anti-Ki-67 proliferasjon markør viste en redusert spredning nivå av (A) SW-1353 ALDH1
lave celler og i forhold til (B) SW-1353 ALDH1
høye celler. (C-E) Dynamiske spredning kurver for ALDH1
høy og ALDH1
lave celler seeded på 10.000 celler per brønn målt med xCELLigence system.
repopulation analysen
å sammenligne repopulation evne sarkom ALDH1
høye celler med ALDH1
lave celler
in vitro
, fersk sorterte cellene ble dyrket separat under samme kultur tilstand. Etter 2 uker ble cellene på nytt farget med den Aldefluor® analysen og analyseres på nytt via FACSAria (BD Biosciences).
(A) kvantifisering av klonet formasjonseffektiviteten fra SW-684, SW-982, og SW -1353 celler. Data fra fem uavhengige eksperimenter representerer gjennomsnittlig kimtall /brønn etter 14 dager. (B) Representative kolonidannende enheter fra alle tre cellelinjer.
Western Blot analyse
For totalprotein-analyse, ble cellene resuspendert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCL pH 7,4, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM EDTA, 10% NP-40, 1% Triton-X og proteasehemmere), inkubert på is i 10 minutter og sentrifugert ved 15 000 rpm i 15 min. Aliquoter av proteinekstrakter (20 pg) ble separert på 12% SDS-PAGE og elektro-blottet på Hybond 0,45 um nitrocellulosemembran ECL (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Membranen ble blokkert med 3% melk blokkeringsbuffer i 1 time og deretter inkubert med primære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur. Som det primære antistoff, kanin polyklonale ALDH1 /2 antistoff (# sc50385, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ble brukt. Den store lever isoform ALDH1 lokalisert til cytosolic plass, mens ALDH2 lokalisert til mitokondriene. Blottene ble utviklet ved hjelp av pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer (Dako, Wien, Østerrike) ved romtemperatur i 1 time og SuperSignal® West Pico Chemoluminescent substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL), i samsvar med produsentens protokoll.
uttrykket nivået ble normalisert (A C
t) til uttrykk av mRNA for GAPDH, ACTB, og hprt-n som en intern kontroll og sammenlignet med den tilsvarende A C
t (ΔΔC
t) i kontroller. De normaliserte uttrykk nivåer fra (A) c-myc, (B) β-catenin, og (C) SOX-2 ble vist. (D) ABCG2 ble mer høyt uttrykt i ALDH1
høy enn i ALDH1
lave celler, mens p-verdiene for (E) ABCA2 ikke var signifikant. (F) ALDH1
høye SW-1353 celler viste også en signifikant høyere uttrykk av ABCB1.
Immunohistochemistry
Hver 1 × 10
4 ALDH
høy og ALDH
lave celler ble sådd i polystyren kultur lysbilder (BD Biosciences), fast med 4% formalin /PBS-løsning, og dehydrert i en stigende rekke av alkohol. Immunhistokjemiske (IHC) studier ved hjelp av streptavidin-biotin peroksidase kompleks metode ble utført ansette antistoff mot anti-Ki-67 (klon 30-9) kanin monoklonalt primært antistoff (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) ved hjelp av referanse Ultra instrument ( Ventana Medical Systems). Celler ble fotografert ved hjelp av et Olympus BX51 mikroskop med Olympus DP71 mikroskop digitalkamera. De fargede objektglass ble digitalt skannet og positive og negative celler ble kvantifisert ved hjelp av ImageScope programvare (ImageScope Virtual Slide, versjon 6.25, Aperio Technol., Vista, CA). Den positivitet = N positive celler /N totale celler.
Begge subopulations ble behandlet med 0 til 5,0 mikrometer doxorubicin, 0 til 5,0 mikrometer epirubicin, 1-100 mikrometer cisplatin, og målt etter 48 timer. Middelverdi ± SD av alle målinger ble montert i henhold til Hill ligningen. Vesentlige forskjeller på de enkelte konsentrasjoner ble innlemmet i svingene.
xCELLigence System
xCELLigence DP-enheten fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland) kan brukes til å kvantitativt og dynamisk overvåke celle spredning i sanntid [15]. Henholdsvis 1 x 10
4 ferskt sortert ALDH1
høy og ALDH1
lave celler ble sådd i elektroniske mikrotiterplater (E-Plate ™; Roche Diagnostic) og målt i 72 timer med xCELLigence system i henhold til instruksjonene i brukerhåndboken. Anvendelse av en lav spenning (mindre enn 20 mV) AC-signalet fører til generering av et elektrisk felt som virker sammen med det ioniske miljø inne i brønnene på E-Plater og differensielt modulert av antallet celler i brønnen, idet den morfologien til cellene, og styrken av cellefesting. Celle tetthetsmålinger ble utført i fire eksemplarer med en programmert signaldeteksjon hver 20 min og ble normalisert til 6 timer tidspunkt. Datainnsamling og analyse ble utført med RTCA programvaren (versjon 1.2, Roche Diagnostics).
Colony Forming analyse
For å bestemme klone dannelsen effektivitet (CFE) av sorterte celler
in vitro
, ALDH1
høy, ALDH1
lave celler og ufargede celler (kontroll) ble talt og 200 celler per brønn ble sådd i seks brønners plater. Triplikatbrønner ble benyttet for hver gruppe. Celler ble dyrket i DMEM-F12 med tilskudd i 14 dager, fiksert i methanol i 10 minutter og farget med krystall-fiolett (Sigma Aldrich, Hamburg, Tyskland). Klonen nummer som besto av mer enn 50 celler ble tellet. CFE ble beregnet i henhold til formelen:. (Klone nummer /belagt celle nummer) × 100
Real-Time RT-PCR
Real-time RT-PCR ble utført i henhold til MIQE kriterier [16] for å bestemme den relative ekspresjon av ABC-transportør gener ABCG2 /BCRP1, ABCA2, og ABCB1 /MDR1 og stemness markører c-myc, β-catenin, og SOX-2. Total RNA ble isolert med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens anbefalte protokollen. DNA ble kuttet med en U DNase (Fermentas, St.Leon-Rot, Tyskland) per mikrogram RNA. 1 mikrogram RNA ble revers transcripted hjelp RevertAid cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Real-time PCR reaksjoner ble utført i tre paralleller ved hjelp av Platinum SYBR Grønn Super Mix med ROX (Invitrogen) på AB7900HT (Applied Biosystems, Invitrogen). Housekeeping gener glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), β-aktin (ACTB) og hypoxantin phosphoribosyltransferase (hprt-n) fungerte som en intern kontroll på grunn av deres stabile uttrykk i ulike vev. Tabell 1 viser primere som brukes for real-time PCR. Uttrykket nivåer ble beregnet basert på 2
-ΔΔCT metoden [17].
Drug Følsomhet analysen
Sortert celler ble justert til en tetthet på 5 × 10
3 celler /100 ul og inkubert i 96-brønners mikroplater. Cellene ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av kjemoterapeutiske legemidler (doksorubicinhydroklorid, epirubicin hydroklorid, og
cis
-diammineplatinum (II) klorid (cisplatin); Sigma Aldrich) i 48 timer. Kjemoterapeutisk stoff følsomhet ble bestemt av MTS analysen (Promega, Mannheim, Tyskland) etter produsentens instruksjoner i quatruplicates ved hjelp av et fotometer (Spektramax;. BMG Labtech, Offenburg, Tyskland) ved bølgelengde på 490 nm. IC
50 verdier ble bestemt fra veksthemming data.
Statistical Analysis
utfallsvariabler ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Elevens uparet
t
-test og den nøyaktige Wilcoxon test ble brukt til å evaluere forskjeller mellom grupper med PASW statistikk 18 software (IBM Corporation, Somers, New York). Tosidig
P
-verdier under 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. IC
50 kurver ble montert i henhold til Hill ligningen (sigmoid, 3 parametre). Grafiske data var forberedt med SigmaPlot® (Systat Software Inc., San Jose, California).
Resultater
Sarkom cellelinjer Vise en Distinctive brøkdel av ALDH1
høye Cells
Aldefluor® analysesystem er utviklet for å oppdage aktiviteten i ALDH1 isoformen. Vi brukte denne analysen fulgt av FACS analyse for å vurdere tilstedeværelse og mengde ALDH1
høye cellepopulasjoner i fem menneskelige sarkom cellelinjer og en chordoma cellelinje [18].
Hvis du vil angi en markør for ALDH1
høye celler DEAB kontrollceller ble anvendt for å sikre nøyaktigheten av analysen. De representative SW-1353-celler ble behandlet i nærvær av det ALDH1 inhibitor DEAB (figur 1A) eller farget med Aldefluor® reagens, som er definert som ALDH1
høy-celler (figur 1B). Sorterings eksperimenter er blitt utført i minst fem ganger på hver cellelinje. Mengden av ALDH1
høy-celler gitt i gjennomsnitt ± SD 1,77 ± 0,9% for det fibrosarcom-cellelinjen SW-684 (n = 12), 0,77 ± 0,4% for det liposarkom cellelinje SW-872 (n = 5) , 2,23 ± 1,0% for synovial sarcom-cellelinjen SW-982 (n = 11) og 2,69 ± 1,3% for kondrosarkom cellelinje SW-1353 (n = 8) henholdsvis. Den chordoma cellelinje MUG-Chor 1 viste bare en liten andel av 1,11 ± 0,5% ALDH1
høy-celler (n = 9) (figur 1C). Vi fokuserte derfor på de tre sarkom cellelinjer SW-684, SW-982, og SW-1353 i følgende eksperimenter. I repopulation analysen den ALDH1
høy befolknings generert en statistisk signifikant høyere redegjørelse for 41,73 ± 18,5% (* p = 0,0039) ALDH1
høye celler i SW-684 celler, 52,5 ± 8,75% (* p = 4,39 E-07) i SW-982-cellelinjen, og 31,7 ± 11,1% (* p = 0,0025) (n = 5) i SW-1353 kondrosarkom celler (figur 1D). Andre våre observasjoner av økt ALDH1 uttrykket kan bli ytterligere underbygges av western blot analyse (figur 1E, tabell 2).
ALDH1
høye Cells Vis Høyere spredning og Clonogenicity
Bruke ImageScope software Ki-67 positive og negative celler ble kvantifisert etter immunhistokjemisk farging. ALDH1
høye celler fra alle tre cellelinjer har en økt nivå spredning i forhold til ALDH1
lave celler. Representant farging av SW-982 ALDH1
høy (figur 2A) og ALDH1
lave celler (figur 2B) er vist og oppsummert i tabell 2 (n = 5). Videre ALDH1
høy og ALDH1
lave celler signifikant forskjellig i logaritmisk veksthastigheten målt med xCELLigence-System (figur 2C-E).
Figur 3A viser klonogene aktiviteten ALDH1
høy og ALDH1
lave celler. Data fra fem uavhengige eksperimenter representerer gjennomsnittlig kimtall /brønn etter 14 dager, og alle verdier er oppført i tabell 2. klone formasjon effektivitet var vesentlig høyere i SW-1353 ALDH1
høye celler sammenlignet med tilsvarende ALDH1
lave celler ( * p = 0,0005). For de andre to cellelinjene disse effekten kan også bli demonstrert, men i en mindre grad. Jo høyere antall kolonier i SW-684, SW-982, og SW-1353 ALDH
høye celler er presentert (Figur 3B).
Den mRNA uttrykk av ABCG2, c-myc, β- catenin, og SOX-2 er oppregulert i ALDH1
høye Cells
Vi har undersøkt hvorvidt ALDH1
høye cellene er anriket for uttrykket av gener som har blitt postulert å spille viktige roller i stamcellebiologi, slik som c-Myc, β-catenin, og SOX-2 [19]. Kvantitativ RT-PCR viste økt uttrykk av c-myc i ALDH1
høy befolkning, mens usorterte kontrollceller (Ctrl) og ALDH1
lave cellene hadde bare minimal uttrykk (Figur 4A). Tilsvarende er en svak, men ikke signifikant økning i ekspresjonen av β-catenin, og SOX-2 i ALDH1
høy fraksjon kunne observeres (n = 6) (figur 4B-C).
relative uttrykk for de tre store legemiddeltransportører ABCG2 /BCRP1, ABCA2, og ABCB1 /MDR1 ble bestemt ved real-time RT-PCR (n = 5). Interessant ALDH1
høy populasjon av alle sarkom cellelinjer viste, med statistisk signifikans, økt ekspresjonsnivå av ABCG2 sammenlignet med kontroll eller ALDH1
lave celler (figur 4D), mens den p-verdi for ABCA2 var ikke signifikant (figur 4E). I tillegg kunne i ALDH1
høye SW-1353 celler en statistisk signifikant høyere uttrykk av ABCB1 (p = 0,0302) holdes (figur 4F). De 2
-ΔΔCT verdier og de tilsvarende p-verdiene er oppført i Tabell 2.
ALDH1
høye cellene vise Forbedret Drug Resistance
kreft stamcelle hypotese foreslår at uoverensstemmelse mellom behandlingsrespons og pasient overlevelse bemerket i de fleste krefttyper reflekterer en iboende motstand av kreft stamceller til kjemoterapi. For å undersøke mulige forskjeller i legemiddelresistens ALDH1
høye og ALDH1
lav sortert SW-982 og SW-1353 celler ble behandlet med økende doser av tre brukte cytostatika etter en to ukers restitusjonsfasen. ALDH1
høye SW-982 celler behandlet i 48 timer med 1,0 mikrometer (p = 0,016) og 5,0 mikrometer (p = 0,001) doxorubicin ble betydelig økt sammenlignet med ALDH1
lave celler (figur 5A). Behandling med 1,0 uM epirubicin (p = 0,045) induserte en forbedret medikamentresistens (figur 5B). SW-1353 ALDH1
høy-celler viste en tilsvarende signifikant effekt etter behandling med 5,0 uM doksorubicin (p = 2.77E-05) (figur 5D) og 0,5 uM epirubicin (p = 0,039) og 1,0 uM epirubicin (p = 0,021 ) (figur 5E). Behandlingen med cisplatin forårsaket bare små forskjeller mellom ALDH1
høye og ALDH1
lav SW-982 og SW-1353 celler (figur 5C og 5E). I fibrosarcom-cellelinjen SW-684 ingen signifikant forskjell kunne påvises. Middelverdi ± SD av alle forsøkene ble montert i henhold til Hill ligningen. Den tilsvarende beregnet IC
50 verdiene er oppført i tabell 2.
Diskusjoner
Basert på dagens kreftstamcelle (CSC) hypotese, bare en liten undergruppe innen heterogen tumor befolkningen er stand til å initiere og re-initiere tumorer. Begrepet cscs var basert på observasjon at når kreftceller i mange forskjellige typer ble analysert for deres proliferativ potensial i ulike analyser
in vitro Hotell og
in vivo
, bare et mindretall av celler viste omfattende spredning [20]. Cscs har blitt identifisert i en rekke forskjellige maligniteter [21], [22], [23]. Én widly akseptert metode for å identifisere cscs er basert på den enzymatiske aktiviteten til aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1), en avgiftende enzym ansvarlig for oksidasjon av intracellulære aldehyder [8], [21]. Det finnes forskjellige isoformer av ALDH. Den Aldefluor® analysesystem har blitt utviklet for å påvise aktiviteten av ALDH1 isoformen. ALDH1 aktivitet viste økes i cscs og har blitt brukt for å isolere cscs i forskjellige krefttyper [24], [25], [26]. Derfor ALDH1
høye celler vise flere funksjoner vanligvis sett i cscs, inkludert muligheten for selvfornyelse, generering av differensiert avkom, og økt uttrykk av stamcellemarkørgener. Studiet av CSC biologi forutsetter evne til å vurdere CSC representasjon nøyaktig innenfor kreftcellepopulasjoner. Som foreslått av flere nylige funn CSC representasjon kan være en funksjon av den celletype opprinnelse, stromal mikromiljøet, akkumulert somatiske mutasjoner og fasen av ondartet progresjon nås med en tumor [27], [28].
Til dags dato , eksistensen av en slik stilk lignende cellepopulasjonen i menneskelig osteosarkom og Ewings sarkom cellelinjer har vært basert på uttrykk for stamcellemarkørgener samt deres evne til å danne kuler
in vitro product: [29], [30], [31]. Det har blitt foreslått at identifikasjon av den CSC kan ikke utelukkende stole på side populasjon (SP) sortering ved hjelp av effluks av Hoechst 33342 fargestoff. Men SP fenotype ikke er presentert i alle cscs og det kan eksistere andre defensive mekanismer for cscs å unngå medisinsk behandling som ikke kan identifiseres av Hoechst fargestoff flekker [32]. Derfor valgte vi markøren ALDH1. Våre resultater viser at alle fem sarkom cellelinjer inneholdt ulike prosentandel av ALDH1
høye celler, med den høyeste andelen i fibrosarkom, synovial sarkom, og chondrosarcoma cellelinjer. Den lille ALDH1 ekspresjon av ALDH
lave celler i Western blot-analyse kan forklares ved bruk av ALDH1 /2 primært antistoff. Utbredelsen hastighet og clonogenicity av SW-684, SW-982, og SW-1353 ALDH1
høye celler
in vitro
var betydelig høyere enn for ALDH1
lave celler, i samsvar med egenskapene til den høye ALDH1 aktivitet fenotype i andre kreftceller [33], [34], noe som kan tyde på at ALDH1
høye celler fra sarkom er delvis ansvarlig for tumormetastase og tilbakefall og bør være fokusert under kreftbehandling. Som c-myc har nylig blitt anerkjent som en viktig regulator av stamcellebiologi, kan det være et bindeledd koble kreft og «stemness» [35]. Innføring av c-myc med andre transkripsjonsfaktorer (inkludert SOX-2) genererer indusert pluripotent stamceller fra differensierte celler [36]. Wnt /β-catenin signalisering spiller en viktig rolle, ikke bare i kreft, men også i kreft stamceller [37]. Våre kvantitative RT-PCR data viste økt uttrykk av c-myc, β-catenin, og SOX-2 i ALDH1
høy befolkning, mens usorterte kontrollceller (Ctrl) og ALDH1
lave cellene hadde bare minimal uttrykk.
En foreslått mekanisme for kjemoterapi motstand av kreft stamceller er basert på den forbedrede ekspresjon av ATP-bindende kassett (ABC) transportproteiner, som er ansvarlig for medikament-utstrømning. Høyere ekspresjonen av ABC transportproteiner i stamceller sammenlignet med ikke-stamceller fører til relativ motstand av stamceller til de toksiske effektene av kjemoterapi narkotika [12], [13]. Vi analyserte mRNA uttrykk av tre store legemiddeltransportører (ABCG2 /BCRP1, ABCA2, ABCB1 /MDR1) av ABC transportør familien. I denne studien ble ABCG2 oppregulert i ALDH1
høye celler fra alle tre sarkom cellelinjer. Videre, en annen ABC transportør ABCB1 /MDR1 ble også funnet med høyere mRNA uttrykk nivå i SW-1353 ALDH1
høye celler sammenlignet med ALDH1
lave celler. Disse genene kan være ansvarlig for multi-legemiddelresistens av kreftceller, og bør være ideelle mål for klinisk kreftbehandling.
Tilleggs, ALDH1
høye celler viste økt motstand mot vanlig brukte cellegifter. ALDH1
høye celler av SW-982 og SW-1353 viste signifikant lavere følsomhet for både doksorubicin og epirubicin sammenlignet med ALDH1
lave celler. Den cisplatin behandling viste kun små forskjeller. Sammen har vi lyktes i å isolere ALDH1
høye celler fra forskjellige sarkom cellelinjer ved hjelp av Aldefluor® analysen. ALDH1
høye celler utstilt
in vitro
en betydelig høyere spredning rente, økt klone formasjon effektivitet, forhøyet uttrykk av ABC transportører og stemness markør, samt økt kjemoterapeutiske legemiddelresistens sammenlignet med ALDH1
lave celler .
som konklusjon, kunne nærværet av stilk-liknende celler med øket ALDH1 ekspresjon være en av de mulige bidragsytere til utviklingen av medikamentresistens i sarkomer. Videre studier vil være nødvendig å definere sarkom stamceller og mekanismene for resistens, men ALDH1
høy befolknings kan tjene som en
in vitro
modell for å søke etter nye terapeutiske behandlingsalternativer.
takk
forfatterne ønsker å takke Heike Kaltenegger og Alexandra Novak for utmerket teknisk assistanse.
