Abstract
Selv om kreft er en genetisk sykdom, er epigenetiske forandringer involvert i initiering og progresjon. Tidligere studier har vist at omprogrammering av tykktarmskreftceller ved hjelp Oct3 /4, Sox2, Klf4, og cMyc reduserer kreft. Derfor kan omprogrammering kreft være et nyttig behandling for lekkasje fra kjemiske eller radioterapi-resistente kreftceller. Det ble også rapportert at innføringen av endogene små dimensjoner, ikke-kodende ribonukleotider som mikroRNA (MIR) 302s og MIR-369-3p eller -5p resulterte i induksjon av cellulær omprogrammering. Mirs er mindre enn genene til transkripsjonsfaktorer, noe som gjør dem muligens egnet for bruk i kliniske strategier. Derfor omprogrammeres vi kolon kreftceller ved hjelp av Mir-302s og MIR-369-3p eller -5p. Dette resulterte i inhibering av celleproliferasjon og invasjon og stimulering av mesenchymale-til-epitelial overgang fenotype i tykktarmskreftceller. Viktigere, innføring av ribonukleotider resulterte i epigenetisk omprogrammering av DNA demetylering og histone modifikasjon hendelser. Videre
in vivo
administrasjon av ribonukleotider hos mus fremkalte induksjon av kreft celle apoptose, som innebærer mitokondrie BCL2 protein familien. Denne studien viser at innføringen av MIR-302s og Mir-369s kan indusere celle omprogrammering og modulere ondartede fenotyper av menneskelige tykktarmskreft, noe som tyder på at riktig levering av funksjonelle små dimensjoner ribonukleotider kan åpne en ny vei for terapi mot menneskelige ondartede svulster .
Citation: Ogawa H, Wu X, Kawamoto K, Nishida N, Konno M, Koseki J et al. (2015) microRNAs Frem epigenetisk Omprogrammering og undertrykke Ondartede fenotyper av menneske Colon kreft celler. PLoS ONE 10 (5): e0127119. doi: 10,1371 /journal.pone.0127119
Academic Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA
mottatt: 19 januar 2015; Godkjent: 10 april 2015; Publisert: 13. mai 2015
Copyright: © 2015 Ogawa et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Institusjonell begavelser ble mottatt delvis fra Taiho Pharmaceutical Co., Ltd (https://www.taiho.co.jp/english/), Kunnskapsbasert Medical (EBM) Research Center (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd (https://www.chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd (https://www.yakult.co.jp/english/index.html), og Merck Co., Ltd (https://www.merck.co.jp/en/index .html). Dette arbeidet ble også støttet en Grant-in-Aid for Scientific Research fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (https://www.mext.go.jp/english/; # 23390199 # 25112708, # 25134711 # 30253420 # 26670604, MM, KM, HI); en Grant-in-Aid fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds (https://www.mhlw.go.jp/english/; # H23-003, M.M., H. I.); et stipend fra National Institute of Biomedical Innovation (https://www.nibio.go.jp/english/index.html; # 12-4, M.M., H. I.); og et stipend fra Osaka University Drug Discovery Funds (https://www.osaka-u.ac.jp/en/index.html; M.M., H. I.). Delvis støtter ble mottatt fra Takeda Science and Medical Research Foundation (https://www.takeda-sci.or.jp/index.html, MM, HI), Princess Takamatsu Cancer Research Fund (http: //www.ptcrf.or jp /engelsk, MM, HI), Suzuken Memorial Foundation (https://www.suzukenzaidan.or.jp, MK), Yasuda Medical Foundation (https://www.yasuda-mf.or.jp; NN), pancreas Research Foundation (https://www.jprf.or.jp/shoreisho.html, KK), Nakatani Foundation (https://www.nakatani-foundation.jp, HI) og Stiftelsen Nakatomi av Japan (https: //www.nakatomi.or.jp/en/index.html, MK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Institusjonell begavelser ble mottatt delvis fra Taiho Pharmaceutical Co., Ltd (http: //www.taiho.co.jp/english/), Evidence Based Medical (EBM) Research Center (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd (http: //www. chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd (https://www.yakult.co.jp/english/index.html), og Merck Co., Ltd ( https://www.merck.co.jp/en/index.html); Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Hver kreftcelle er i stor grad hentet fra stamceller eller stamceller av normal somatisk vev via genetiske og epigenetiske forandringer. Disse endringene inaktivere vekst-begrensning tumorsuppressorgener (TSGs) og aktivere vekstfremmende onkogener. Normale somatiske celler er utviklet fra en befruktet eggcelle gjennom en epigenetisk program. Spesielt, ektopisk innføring av definerte gener, OCT3 /4, SOX2, KLF4, og c-MYC (OSKM), eller OSK, som utelukkende er uttrykt i embryonale stamceller (ESCs), induserer fullt omprogrammering av differensierte somatiske celler tilbake til pluripotente stamceller. Vi viste tidligere at innføringen av OSKM i epiteliale kreftceller av gastrointestinale organer modulerer den maligne fenotype. Våre funn antydet at omprogrammering kan undertrykke kreft invasjon, medikamentresistens, og tumorgenisitet gjennom reaktivering av tumor suppressor p16INK4a vei ved demetylering av promotersekvensen [1]. Videre en fersk mus studie av transgene OSK faktorer viste at epigenetiske modifikasjoner er involvert i startfasen og utvikling
in vivo
. Denne studien viste også at, i kombinasjon med inaktivering av TSG signaler slik som mutant APC, kan modifikasjonene organisere epigenetiske forandringer av den polycomb gruppen komplekset til kjernemodulen av histon H3 lysin-27 [2]. Tatt sammen med tidligere funn [1-6], epigenetiske forandringer, uavhengig av årsakene eller resultatene av de genetiske endringer, bidrar til forekomst og utvikling av maligniteter og kan være attraktivt for oppdagelsen av nye terapeutiske mål mot kreft hos mennesker.
Terapeutiske programmer som utvider endogene signalveier bør ha minimal toksisitet
in vivo
. I denne forbindelse, medisiner fra endogene microRNAs (mirnas, MIR), små-sized kodende ribonukleotider (22 bp i gjennomsnitt), er potensielle kilder for innovative terapeutiske strategier [7,8]. Fordi syntetiserte modne Mirs ikke integrere i genomet, bør de utøver sine funksjoner uten uønskede genomisk integrering hendelser, og hvis det kombineres med et stoff levering system, kan Mirs utøve disse spesifikke effekter på terapeutiske mål [7,8].
Nyere Mir oppdagelse studier har identifisert kritiske klynger, inkludert MIR-302s, som forbedrer omprogrammering effekt i samarbeid med viral-mediert transkripsjonsfaktor transfer [9-12]. Det har vist seg at et sett av tre Mirs (MIR-302s, MIR-369s og MIR-200C) er valgt fra en rekke Mirs uttrykt utelukkende i induserte pluripotente stamceller (iPSCs) /ESCs, fremkalte omprogrammering [13]; en betydelig rolle for MIR-367 ble også vist [12]. Angivelig, innføring av MIR-302s indusert både cellesyklus arrest ved å forstyrre cyclin-avhengige kinaser (CDK) og global demetylering av DNA i leverkreft og føflekkreft
in vitro product: [4,5,14]. Her studerte vi effekten av MIR-302s og Mir-369s
in vitro Hotell og
in vivo
. Disse resultatene antydet at omprogrammering kreft ved hjelp av Mir-302s og Mir-369s kan være et effektivt behandlingsalternativ for kreftbehandling.
Materialer og metoder
Cell kultur
tykktarmskreftcelle linjer HT29, DLD-1, SW480, HCT116, Caco2, Colo201, RKO, og LoVo-celler og teratocarcinom cellelinje NTERA (NTera 2 /cl.D1 [NT2 /D1]) ble oppnådd fra Riken (Tsukuba, Japan). Disse cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium (Nakalai Tesque, Kyoto, Japan) med 10% FBS (Gibco Life Technologies, Tokyo, Japan) og 500 ug /ml penicillin-streptomycin.
Transfeksjon
Spesifikke Mirs og negativ kontroll (NC) MIR brukes i
in vitro Hotell og
in vivo
analyse ble kjøpt (Gene design Inc., Osaka, Japan, S1 tabell). Cellene ble transfektert med spesifikke Mirs og NC Mir bruker lipofeksjon (LP) eller karbonat apatitt (CA). I LP ble cellene transfektert med Mirs bruker Lipofectamine iMax (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll.
Cell omprogrammering
HT29 celler og DLD-1 celler ble transfektert med 10 nM av hver MIR bruker CA. Celler ble inkubert i RPMI-1640 med 10% FBS i 24 timer og transfeksjon ble gjentatt annenhver dag i totalt tre ganger. Etter tredje transfeksjon ble cellene sådd ut på Matrigel-belagte og mitomycin C-behandlede mus embryonale fibroblaster (MEF). Celler ble dyrket i embryonal stamcelle kulturmedium inneholdende DMEM /F12 (Gibco Life Technologies, Tokyo, Japan), supplert med 2 mM Glutamax, 20% knockout serum erstatning (Gibco Life Technologies), 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA, Gibco liv Technologies), 10 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, Wako, Tokyo, Japan), 55 uM 2-merkaptoetanol (Gibco Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin, og kjemiske inhibitorer, inkludert 0,5 pM A83-01 (Stemgent , Cambridge, MA), 3 uM CHIR99021 (Stemgent), og 0,5 uM PD0325901 (Stemgent), ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Mediet ble skiftet hver annen dag og cellene ble opprettholdt ved 37 ° C i en 21% CO
2 inkubator i ytterligere 21 dager. I løpet av denne perioden, ble disse kreftceller overvåkes med hensyn til dannelsen av ES-kolonier som. Disse ble plukket for videre analyse med alkalisk fosfatase (AP) Levende Stain (500 ×) (Invitrogen) ved hjelp av en alt-i-ett fluorescens mikroskop (BZ-9000, Keyence, Osaka, Japan) med digital fotografisk mulighet for valg i henhold til produsentens instruksjoner. Å studere Mirs transfeksjon effektivitet, ble DLD-1 celler transfektert med BLOCK-iT Alexa Fluorescent Control (Invitrogen) med CA eller LP. I korte trekk, ble utsådd DLD-1-celler i en 6-brønns plate transfektert med blokk-iT Alexa Fluorescent Kontroll og fotografert etter transfeksjon ved bruk av en Keyence BZ-8000 mikroskop. Fluorescensintensiteten av transfekterte celler observert ved hjelp av et FACS BD FACSAria III cellesorterer.
Luciferase-analyse
3 «utranslatert region (3′-UTR) av CDK2 ble amplifisert ved RT-PCR ved bruk av primerne 5»-CTAGCTAGCTAGCCTTCTTGAAGCCCCCA-3 «og 5′-CTAGCTAGCGAGCTACAAACTAAATTACA-3». Primere ble subklonet, ligert inn i pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target-ekspresjonsvektor (Promega) ved anvendelse av Nhel, og bekreftet ved direkte sekvensering. Luciferase analyser ble utført ved anvendelse av 5 x 10
3 DLD-1-celler sådd ut i en 96-brønns plate. -Celler ble transfektert ved bruk av Lipofectamine 3000 (Invitrogen) i OptiMem redusert serummedium (Gibco) med 200 ng av tom vektor eller Luciferase-CDK2 3’UTR vektor og enten NC MIR eller MIR-302s (sluttkonsentrasjon, 25 nmol /L). Luciferase-aktiviteten ble målt 24 timer etter transfeksjon ved bruk av Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) ifølge produsentens protokoll. Relativ luciferase nivået ble beregnet som (Sample Luc /Sample Renilla) /(Kontroll Luc /kontroll Renilla), hvor Luc er rå ildflue luciferase aktivitet og Renilla er den interne transfeksjon kontroll luciferase aktivitet.
Celleproliferering analysen
for å vurdere spredning og følsomhet AP-positive ES-lignende kolonidannende kreftceller til 5-fluorouracil (5-FU, Kyowa Hakko Kirin Co, Tokyo, Japan), 1 x 10
3 celler eksponert for flere konsentrasjoner av 5-FU i 72 timer i en 96-brønns plate. Levedyktige celler ble evaluert med Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan). For å vurdere innvirkningen av disse er indikert Mirs på celleproliferasjon, HT29-celler og DLD-1-celler (5 x 10
4 celler /brønn i en 12-brønns plate) ble transfektert med enten MIR-302s, MIR-302s pluss mir -369s eller NC Mir, som beskrevet ovenfor. Cellene ble telt hver dag i tre dager, med start 24 timer etter transfeksjon.
Cell syklus analyse
For cellesyklus analyse av flowcytometri, 5 × 10
4 DLD-1 celler ble transfektert med hver MIR i en 24-brønns plate, trypsinert etter 72 timer, vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS), og fiksert i 70% etanol på is. Etter sentrifugering ble cellene farget med 50 mg /ml propidiumjodid (PI) løsning (Dojindo Molecular Technologies) og 0,1 mg /ml RNase A (Invitrogen) og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en FACS BD FACSAria III cellesorterer. Hvert histogram ble konstruert med data fra minst 10.000 hendelser og ble anvendt for å beregne prosentdelen av cellepopulasjonen i hver fase.
celle invasjon assay
Transwell invasjons analyser ble utført i 24- vel modifiserte kamre pre-belagt med Matrigel (BD BioCoat, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). DLD-1 celler og SW480 celler ble transfektert med enten 10 nM av MIR-302s, MIR-369s, Mir-302s pluss Mir-369s og NC MIR bruker CA. Etter 48 timer ble cellene trypsinisert og resuspendert ved en konsentrasjon på 10 x 10
4 celler /ml i serumfritt medium, og 0,5 ml cellesuspensjon ble tilsatt til toppen av hver brønn. Etter 48 timers inkubering, celler migrerer inn i det nedre kammeret, som inneholder 10% FBS som en chemo-tiltrekkende, ble fiksert og farget med Wright-Giemsa beis (Diff-Quick, Sysmex, Kobe, Japan). Fire tilfeldig felt ble telt i tre eksemplarer. Data er uttrykt som medianverdien med standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) av invaderte celler i en relativ ratio i forhold til NC MIR-behandlede kreftceller.
Cell differensiering studie
For å finne ut differensieringen evnen av de genererte ES-lignende kolonidannende cancerceller
in vitro
, ble cellene dyrket i flytende dyrking for å danne embryoid legemer (EBS). Etter 4-5 dager ble EBS overført til 0,1% gelatin-belagte plater og dyrket i RPMI-1640 med 10% FBS i ytterligere 14 dager.
RNA analyse
Totalt RNA ble ekstrahert ved hjelp av Trizol (Invitrogen, Tokyo, Japan). RNA kvalitet ble vurdert med en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) ved 260 og 280 nm (A260 /280). Revers transkripsjon (RT) for Mir ble utført
in vitro
med Taqman revers transkripsjon mikroRNA Kit (Applied Biosystems, Tokyo, Japan). qPCR ble utført med den universelle Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems).
RT-PCR
RNU48 uttrykk in vitro og RNU6B uttrykk in vivo ble brukt som en intern kontroll for å bestemme den relative uttrykk av MIR. RT for Mir ble utført
in vitro
med miScript II RT Kit (Qiagen, Tokyo, Japan). qPCR ble utført ved hjelp av miScript SYBR Grønn PCR Kit (Qiagen). RNU6B ekspresjon ble anvendt som en intern kontroll. Fold-endringer ble beregnet og normalisert ved hjelp av CT-metoden. mRNA nivåer ble analysert ved bruk av revers transkripsjon System (Promega, Tokyo, Japan) og LightCycler Faststart Reaction Mix SYBR Grønn jeg i en LightCycler (Roche, Tokyo, Japan). Alle resultater ble normalisert til GAPDH en kontroll. RNA uttrykk studier ble uavhengig gjentas minst tre ganger for å bekrefte reproduserbarhet.
Protein analyse
Protein nivåer ble bestemt ved immunoblotting. Antistoffer mot Bak (1: 200, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), Bud (1: 200, Santa Cruz), BCL-2 (1: 1000, CST, Tokyo, Japan), BCL-XL (1: 1000, CST), Mcl-en (1: 1000, CST), Caspase8 (1: 1000, CST), Caspase3 (1: 1000, CST), CyclinD1 (1: 200, Santa Cruz), CDK2 (1: 200, Santa Cruz ), CDK4 (1: 200, Santa Cruz), E-cadherin (1: 1000, CST), vimentin (1: 1000, CST), Zeb1 (1: 1000, CST), Phospho-Rb (Ser807 /811) ( 1: 1000, CST), og den interne kontrollen ACTB (1:. 2000, Sigma Aldrich, Tokyo, Japan) ble anvendt
Immunoblotting
Cellepelleter ble lysert på is kjølig radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer med protease inhibitor. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av Bradford-analysen. Proteinene ble separert på 4-10% Mini-Protean Prefabrikkerte Gels (BioRad, Tokyo, Japan). Etter natten over elektroforetisk overføring til PVDF-membran, ble membranene blokkert med Blokkering En løsning (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan) i 1 time og inkubert over natten ved 4 ° C med den angitte primære antistoff. Til slutt ble membranene inkubert med sekundær anti-mus eller kanin-hel IgG koblet til pepperrotperoksidase (GE Healthcare Life Sciences, Tokyo, Japan) i 1 time ved romtemperatur. Antistoffbinding for å målrette proteiner ble visualisert ved kjemiluminescens hjelp Amersham ECL Prime Western blotting Detection Reagenser (GE Healthcare og biovitenskap).
Immunocytochemistry
Cellene ble vasket to ganger med PBS og fiksert i 4% paraformaldehyde for 15 minutter ved værelsestemperatur. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS og gjennomtrengt med 0,1% TritonX-100 i 15 minutter ved romtemperatur. Uspesifikk binding ble blokkert ved inkubering i geit eller hesteserum (Vectastain, Funakoshi, Tokyo, Japan) i 10 minutter ved romtemperatur. Celler ble inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Primære antistoffer ble brukt var polyklonalt kanin-anti-human Oct3 /4 (1: 400, MBL, Nagoya, Japan), polyklonalt kanin-anti-humant Sox2 (1: 400, MBL), monoklonalt mus anti-human Nanog (1: 2 000, CST ), monoklonalt mus anti-human Ki-67-antigen (1: 400, DAKO), og monoklonale kanin anti-human E-cadherin (1: 200, CST). Den neste dag ble cellene vasket to ganger med PBS og behandlet med sekundært antistoff i 30 minutter ved romtemperatur. Sekundære antistoffer som ble anvendt var anti-kanin IgG (H + L) F (ab «) 2-fragment (Alexa Fluorr 488 konjugat, 1: 1000, CST) eller anti-mus IgG (H + L) F (ab») 2- fragment (Alexa Fluorr 555 Conjugate) (1: 1 000, CST). Kjerner ble farget med forlenge Gold Antifade reagens med DAPI (Invitrogen). Bilder ble tatt med et Keyence BZ-8000 mikroskop.
DNA metylering analyse
miR302-transfekterte DLD-1 kolorektal kreft celler ble analysert for DNA metylering. Kort fortalt celler ble transfektert med Mir-302s eller mock-kontroll. Metylerte proteiner ble immunopresipitert fra cellelysatet ved hjelp av metylering-bindende protein. Prøvene ble sekvensert (Takara, Kyoto, Japan) for å få hele genom DNA metylering data. Data mellom de to prøvene ble sammenlignet for å bestemme DNA metylering svar på Mir-302s transfeksjon.
Histone metylering analyse
Histone utvinning og måling av globale metylering nivåer av histon 3 lysin-4 (H3K4 ) ble utført ved hjelp av Global Histone H3-K4 Metylering kit i henhold til produsentens protokoller (Abnova, Taipei, Taiwan).
mus studie
Dyrestudier studier~~POS=HEADCOMP ble utført i henhold til de prinsipper og prosedyrer godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i Osaka University (godkjenningsnummer, 24-122-011). Den tumorigenicity Analysen ble utført ved hjelp av en
in vivo
xenograft modell. For det første 5 x 10
6-celler suspendert i et totalt volum på 200 ul DMEM /Matrigel (1: 1 (v /v) suspensjon) ble injisert inn i flankene av 7-8 uker gamle hunnmus (BALB /cAJcl-nu /nu). Når tumorvolumene nådde 100 mm
3, målt av målepunkter, og beregnes ut fra formelen V = (ab
2) /2, hvor a er lengden og b er bredden, tumorer ble høstet og kuttet i tre -4 mm
3 seksjoner for serie transplantasjon. §§ var å bekrefte vasculaturization ved immunhistokjemi hjelp CD31, en vaskulær endotelial markør. Serielt transplanterte HT29 xenografter hadde den mest tallrike blodkar, ble jevnt fordelt over hele svulsten, og hadde minst mulig sentral nekrose. Mirs /CA Kompleksene ble administrert ved anvendelse av en 30G nål via halevenen. Tumorstørrelse og kroppsvekt ble målt en gang hver 3. dag. Xenografttumorer og mus blod ble samlet inn under offer og bevart i 10% nøytral-bufret formalin for histologiske og immunhistokjemiske studier eller i RNAlater RNA Stabilization Reagens (Qiagen, Tokyo, Japan).
Carbonate apatitt forberedelse
for å forberede en CA transfeksjon blanding
in vitro
, 2 mikrogram av hver MIR-302 (-a, -b, -c, -d), MIR-369 (-3p, -5p) eller NC MIR ble blandet med 4 ul av 1 M CaCl
2 i 1 ml serum-fritt bikarbonat (44 mM) -buffered DMEM-medium (pH 7,5) inkubert ved 37 ° C i 30 minutter, og brukt for transfeksjon [15- 17]. Denne metoden ble i hovedsak brukt til
in vitro
eksperimenter. For
in vivo
eksperimenter, en uorganisk løsning (0,9 mM NaH
2PO
4, 1,8 mM CaCl
2, pH 7,5) erstattet DMEM løsning. For en mus, ble en blanding av 15 ug av hver mir benyttes for enkelt injeksjon. Løsningen ble sentrifugert ved 12.000 rpm i 3 min, og pelleten ble oppløst i 200 ul saltvann inneholdende 0,5% albumin. Produkter i oppløsningen ble ultralydbehandlet (38 kHz, 80 W) i et vannbad i 10 minutter under 20 ° C for å generere MIR /CA komplekser, som ble injisert intravenøst i løpet av 5 min.
Pasientprøver
Kliniske prøver ble samlet under en operasjon fra ni pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon for kolorektal kreft ved Osaka University Hospital og tilhørende sykehus i 2005. pasientene er oppsummert i S2 tabell. Alle pasientene var i samsvar med bruk av resected eksemplarer i denne studien i henhold til retningslinjer godkjent av Institutional Forsk (godkjent protokoll # 213).
Immunhistokjemisk analyse
Immunhistokjemisk analyse ble utført på 3,5 mikrometer parafin-embedded seksjoner fra xenografter. Parafin-embedded seksjoner ble de-paraffinized i Hemo-De (Farma) og rehydrert i en gradert etanol serien. Objektglass ble oppvarmet i antigen gjenfinning buffer i 40 min, blokkert med geite eller hesteserum i 20 minutter ved romtemperatur og inkubert med monoklonalt mus anti-human Ki67-antigen (1: 400, DAKO), polyklonalt kanin-anti-human Oct3 /4 (1: 100, MBL), polyklonalt kanin-anti-humant Sox2 (1: 200, MBL), eller monoklonalt mus anti-human CK20 (DAKO) antistoff over natten ved 4 ° C. Vectastain ABC system (Vectastain, Funakoshi, Japan) ble brukt for å visualisere antigen. Counter-farging ble utført ved hjelp av hematoxylin.
Immunofluorescensanalyse
Immunofluorescensanalyse ble utført på 3,5 mikrometer parafininnstøpte seksjoner fra xenografter å oppdage kreft fartøy. Parafin-embedded seksjoner ble de-paraffinized og behandlet som beskrevet for immunhistokjemi. Seksjonene ble blokkert med geiteserum i 20 minutter ved romtemperatur og inkubert med rotte-anti-muse-CD31-antistoff (1:20, Dianova, Hamburg, Tyskland) over natten ved 4 ° C. Den neste dag, det sekundære antistoff anti-rotte-IgG (H + L) F (ab «) 2 fragment (Alexa Fluorr555 Conjugate) (1: 1 000, CST) ble påført. Snittene ble kontra farget med forlenge Gold Antifade Reagens med DAPI. Bilder ble tatt med et Keyence BZ-8000 mikroskop.
Alcian blå flekker
Alcian blå flekker ble utført på 3,5 mikrometer parafininnstøpte seksjoner fra xenografter å oppdage slim. I korte trekk, lysbildene ble de-pareffinized i Hemo-De (Farma), rehydrert i graderte etanol serien, nedsenket i 3% eddiksyre i 3 min, og farget i Alcian blå løsning (1 g Alcian blå 8GX, 3 ml eddiksyre syre, og 97 ml destillert vann) i 20 min. Seksjonene ble deretter vasket og kjerner kontra med Kernechtrot (TCI, Tokyo, Japan) i 5 min.
apoptose analysen
Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (Biovision, Milpitas, CA) ble brukt i henhold til produsentens protokoll for
in vitro
tidlig og sen fase påvisning av apoptotiske celler. Kort fortalt, for å oppdage apoptose
in vitro
, 20 × 10
4 DLD-1 celler ble transfektert med MIR-302s, MIR-369s, Mir-302s pluss Mir-369s eller NC Mir bruker CA i en 6-brønns plate in triplo 60 timer før analysen. Cellene ble trypsinert og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en FACS BD FACSAria III cellesorterer. Tre uavhengige eksperimenter ble utført i tre eksemplarer.
For å oppdage DNA pauser i apoptotiske celler
in vitro
brukte vi deadend Fluorometrisk TUNEL System (Promega) i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble cellene transfektert med hver Mir bruker CA bruker Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System (Fisher Scientific, Tokyo, Japan). Objektglassene ble vasket 48 timer etter transfeksjon og fiksert i 4% formaldehyd i PBS i 25 min ved 4 ° C. Objektglassene ble vasket to ganger i PBS og permeabilisert i 0,2% Triton X-100 i PBS i 5 min. Objektglassene ble deretter vasket i PBS, ekvilibrert i ekvilibreringsbuffer i 7 minutter ved romtemperatur, og som er merket med TdT reaksjonsblandingen i 60 minutter ved 37 ° C i et fuktet kammer for å unngå lys. Objektglass ble neddykket i 2 x SSC i 15 minutter for å stanse reaksjonen. Kjerner ble kontra hjelp med å forlenge Gold Antifade Reagens med DAPI. Apoptotiske celler ble oppdaget av en Keyence BZ-8000 mikroskop.
For å oppdage apoptotiske celler
in vivo
, ble en TUNEL analyse utført i henhold til produsentens protokoll. Kort, lysbilder ble de-paraffinized i Hemo-De, rehydrert i en gradert etanol serie, midt i 0,85% NaCl, og fiksert i 4% formaldehyd. Celler ble permeabilisert med 20 pg /ml proteinase K-løsning i 10 minutter ved romtemperatur. Objektglassene ble ekvilibrert med ekvilibreringsbuffer i 10 min ved romtemperatur og merket ved anvendelse av TdT reaksjonsblandingen i 60 minutter ved 37 ° C i et fuktet kammer. Objektglass ble neddykket i 2 x SSC i 15 minutter for å stanse reaksjonen. Kjerner ble kontra hjelp forlenge Gold Antifade Reagens med DAPI. Apoptotiske celler ble oppdaget av en Keyence BZ-8000 mikroskop.
Resultater
Endogen uttrykk for MIR-302s og Mir-369s i primære svulster og kreft cellelinjer av tykktarms
tidligere studier indikerte at MIR-302a-b, -c og-d (MIR-302s), miR369-3p, -5p (MIR-369s) og Mir-200c kan lokke fram mobil omprogrammering i normale somatiske celler [13]. Her palneed vi å omprogrammere kreftceller ved hjelp av disse Mirs. Vi begynte med å undersøke det endogene uttrykk for disse Mirs i kolorektal kreft cellelinjer og kliniske prøver av tykktarmskreft (Fig 1A og 1B). Uttrykk av MIR-302s i tykktarmskreft var svært lav eller umulig å oppdage i forhold til at det i menneskelige Teratom NTERA celler, som angivelig uttrykker MGP-spesifikke gener og brukes som kontrollceller for å evaluere ESC-lignende genuttrykk i mange studier [2, 3, 5, 11]. I kontrast, MIR-200c uttrykk var høy i ni primære svulster undersøkt og mange cellelinjer, slik som HT29. Expression nivåer av Mir-302s og Mir-369s ble lavere sammenlignet med MIR-200c, noe som tyder på at MIR-200c uttrykk er allerede høy i mange tykktarmskreftceller og kan være ildfast til eksogen overekspresjon. Neste, vi transfektert bare Mir-302s eller Mir-369s i tykktarm kreft celler. For å optimalisere
in vivo
eksperimenter, som etterligner primære svulster, studerte vi immunofluorescerende fargemønstre for CD31, en vaskulær endotelial markør, ved hjelp av DAPI til counterstain atomkjerner, i xenotransplantater av HT29, DLD-1 og SW480-celler (Fig 1C). HT29-xenografter hadde den mest tallrike vaskularisering, ble jevnt fordelt over hele tumoren, og den minste mengde av nekrose. Videre omprogrammering kreft analyse av Mir-302s og Mir-369s ble utført i hovedsak med HT29 celler og andre tilleggscellelinjer.
A) Relativ uttrykk for endogene MIR-302s (MIR-302a, -B, -C, og-d), Mir-369s (MIR-369-3p og -5p), og MIR-200C i primærsvulster og tykktarm kreft cellelinjer. Den humane cellelinje teratocarcinom NTERA ble anvendt som en kontroll. B) Mirs uttrykk i HT29, DLD-en og SW480 celler (n = 3). C) Immunofluorescensanalyse av CD31-ekspresjon i xenotransplantater fra HT29, DLD-1 og SW480-celler. HT29 xenografter utstilt mange CD31-positive områder med lite nekrose. Skala barer, 200 mikrometer. D) Relativ uttrykk for MIR-302s og Mir-369s i HT29 celler 24 timer etter transfeksjon av 30 nM MIR-302s pluss Mir-369s (n = 3). NC, negativ kontroll. E) Relativ uttrykk for Mir-302s i HT29 celler på dag 2 og 6 etter transfeksjon av MIR-302s (n = 3). NC, negativ kontroll. F) For å vurdere transfeksjon effektivitet, ble en fluorescensmerket dsRNA oligomer transfektert med karbonat apatitt (CA) eller lipofeksjon (LP) i DLD-1 celler. Transfeksjonseffektiviteten ble vurdert ved fluorescerende mikroskopi og flowcytometri etter en enkelt transfeksjon, som angitt. G) Relativ uttrykk for Mir-302s i HT29 celler 48 timer etter transfeksjon av CA eller LP (n = 3).
Eksogene innføring av MIR-302s og Mir-369s utløser cellular omprogrammering
Vi transfektert Mir-302s pluss Mir-369s til tykktarmskreftcellelinjer ved hjelp av CA for å oppnå Mir uttrykk nivåer som ligner på NTERA celler, som ble brukt som en positiv kontroll (fig 1D) [13]. Vi bekreftet at Mir-302s ble effektivt transfektert (figur 1E). Transfeksjonseffektivitet ved hjelp CA var høyere enn for LP henhold til våre betingelser (figur 1F og 1G). Derfor CA metoden ble brukt i alle senere forsøk.
For å finne ut om kreftcellene kan omprogrammeres ved hjelp av Mirs, undersøkte vi effekten av innføring av eksogene MIR-302s med og uten Mir-369s tre ganger i løpet av transfeksjon periode. På dag 6 ble cellene forsiktig trypsinert overført til MEF feeder-celler, og dyrket i ytterligere 21 dager i ES-medium med tre kjemiske inhibitorer (3i; 0,5 uM A83-01, en ALK4 /5/7-reseptor inhibitor; 3 uM CHIR99021 , en GSK-3β inhibitor, og 0,5 uM PD0325901, en MEK-inhibitor) (figur 2A) [5,13,18]. Runde kolonier ble indusert ved transfeksjon av HT29 med MIR-302s. Disse koloniene var lik de ESCS /iPSCs og tilsynelatende forskjellig fra de av de overordnede celler (figur 2B). ESCs /iPSCs er kjent for å være alkalisk fosfatase-positive, så vi farget cellene bruker AP levende flekken (Fig 2C) for å identifisere og plukke kolonier som besto av virkelig omprogrammeres celler [19]. Blant de cellene som danner ES-lignende kolonier, AP
+ men ikke AP
– celler viste en økning uttrykket nivåer av OCT3 /4, SOX2 og Nanog (Fig 2D) og Mir-302s (Fig 2E). Celler transfektert med Mir-302s pluss Mir-369s eller Mir-302s alene var AP
+ i kultur etter 28 dager med omprogrammering. Disse omprogrammeres cellene uttrykte pluripotente markørproteiner som Oct3 /4, Sox2, Nanog, og TRA-1-60 (Fig 2F).
A) Scheme av omprogrammering kreft metoder transfeksjon av MIR-302s eller speil 302s pluss MIR-369s. B) MIR-302s-indusert morfologiske endringer i HT29 celler på dag 1, 6 og 28. omprogrammeres HT29 har en embryonale stamceller-lignende utseende. Skala barer, 100 mikrometer. C) Celler farges ved hjelp av alkalisk fosfatase (AP) levende flekken. Skala barer, 100 mikrometer. D) Relativ uttrykk for
OCT3 /4
,
SOX2 Hotell og
Nanog
forhold til AP
– celler ved QRT-PCR (n = 3). E) Relativ uttrykk for MIR-302s og Mir-369s i AP
+, AP
– og NTERA celler.
