Abstract
RABEX-5, en guanin-nukleotid utveksling faktor (GEF) for RAB-5, er innblandet i tumorigenesis og i utviklingen av visse kreft hos mennesker. Her rapporterer vi at RABEX-5 fremmer tumorvekst og metastatisk evne mage kreftceller både
in vitro Hotell og
in vivo
. Ekspresjon av RABEX-5 er betydelig høyere i magekreft vev og er assosiert med tumorstørrelse og lymfeknutemetastase. I tillegg målrettet stanse av RABEX-fem redusert magekreft celleproliferasjon og kolonidannelse
in vitro
via induksjon av en G0 /G1 fase arrest, og stimulert magekreft celle apoptose. Knockdown av RABEX-5 også hemmet sårtilheling, migrasjon og invasive evnene til mage kreftceller. Resultatene av
in vivo
dyreforsøk var også i overensstemmelse med disse
in vitro
funn. Stanse av RABEX-fem førte til redusert uttrykk av VEGF. Disse resultatene indikerer at RABEX-5 er oppregulert og spiller en onkogen rolle i magekreftutvikling ved å aktivere VEGF signalveien
Citation. Wang S, Lu A, Chen X, Wei L, Ding J (2014) RABEX-5 oppreguleres og spiller en onkogen rolle i Gastric Cancer Development ved å aktivere VEGF signalveien. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10,1371 /journal.pone.0113891
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 03.09.2014; Godkjent: 31 oktober 2014; Publisert: 26.11.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
til tross for en nedgang i den globale forekomsten i enkelte deler av verden, forblir magekreft den fjerde høyeste i insidens og andre i dødelighet blant alle krefttilfeller i verden [1]. Studier tyder på at miljøfaktorer, som for eksempel
Helicobacter pylori
infeksjon, røyking og kosthold, kan spille en viktig rolle i magekreft utvikling [2]. Tidlig stadium magekreft er vanligvis asymptomatisk eller assosiert med uspesifikke symptomer som dyspepsi, og da symptomene oppstår, har det ofte nådd et avansert stadium. Til tross for felles bruk av multimodal behandling (kjemoterapi, stråling og kirurgi), 5-års overlevelse av pasienter er fortsatt lav, på 20-40% [3]. Selv om forskning i magekreft har gjort store fremskritt, forblir de molekylære mekanismene bak utviklingen av magekreft ufullstendig forstått.
eksocytose og endocytose er viktige prosesser som brukes av celler for å opprettholde normal fysiologisk funksjon, og vesikkeltransport er en kjerne en del av denne prosessen. Små GTPases spille en bryterfunksjon i intracellulære molekyler og en meget viktig rolle i endocytose og vesikkeltransport, deriblant regulering av cellevekst, signaltransduksjon, differensiering og aktin cytoskjelettet av mange aspekter av de andre cellulære prosesser [4]. I Ras-superfamilien, er det mer enn 50 typer GTPases, inkludert Rab, som hører til det største underfamilien [5]. Studier har vist at flertallet av Rab proteiner regulerer målretting transport, fagocytose, og vesikkel dokking til bestemte membraner, mens et lite antall Rab proteiner regulere vesikkel spirende [6], [7]. Den lille GTPase RAB-5, som distribueres i plasmamembranen og tidlige endosomer, er en mester regulator av tidlig endocytic menneskehandel [8]. Som andre små GTPases er RAB-5 aktiveres av en utveksling av bundet GDP med GTP, katalysert av en familie av guanin-nukleotid utvekslings faktorer [9]. RABEX-5 ble identifisert som en Interactor av Rabaptin-5 og besitter GEF aktivitet mot RAB-5 og relaterte GTPases. Likeledes, både RABEX-5 og Rabaptin-5 er nødvendig for RAB-5-drevet endosomet fusjon
in vitro product: [10].
Nyere studier har indikert at RABEX-5 uttrykket er betydelig høyere i flere kreftformer, herunder brystkreft [11], prostatakreft [12] og tykktarmskreft [13]. Unormal RABEX-fem uttrykk i tumorer antyder at RABEX-5 er vesentlig i kreft patogenesen og progresjon, og kan påvirke svulst biologisk atferd. Men rollen og virkningsmekanismen til RABEX-5 i magekreft kreftutvikling og progresjon har ennå ikke blitt fastslått. I denne studien har vi først analysert uttrykk for RABEX-5 i mage kreft vev ved hjelp av kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) og immunhistokjemi. Deretter undersøkte vi effekten av RABEX-5 på tumor biologisk funksjon
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre resultater viser at RABEX-5 er overexpressed og spiller en onkogen rolle i magekreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk som beskrevet i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Taishan Medical University og alle dyrene ble opprettholdt i samsvar med de IACUC retningslinjer. Innsamling og bruk av humane prøver ble godkjent av Institutional Review Board of Taishan Medical University og tilknyttet Tai Central Hospital Medical Center, etter informert skriftlig samtykke fra alle pasienter.
Pasient og vevsprøver
totalt 110 sett med mage svulster og tilstøtende, ikke-tumorvev (minst 5 cm fra svulsten margin) ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kurativ kirurgi ved Tai Central Hospital mellom januar 2010 og desember 2013. Disse inkluderte 27 kvinner og 83 menn, med en gjennomsnittsalder på 59,3 år (range: 32-80 år). Ingen pasienter hadde fått strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. Clinicopathological data ble samlet inn og patologisk tumor iscenesettelse ble bestemt i henhold til den amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) magekreft TNM staging system. Histologisk typing ble utført av minst to dyktige patologer, arbeide selvstendig i en dobbel-blindet mote. Studien ble godkjent av Institutional Review styrene i Taishan Medical University og tilknyttet Tai Central Hospital Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient før innmelding i studien.
Cellelinjer og kulturforhold
Menneskelige mage kreft cellelinjer og foreviget mage, mucosal epitel cellelinje, GES-1 ble kjøpt fra Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. Cellelinjer ble rutinemessig opprettholdt i RPMI-1640 medium inneholdende 10% kalveserum, penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 IU /ml) i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C.
Total RNA isolering og QRT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra vevsprøver eller cellelinjer som bruker Trizol reagens (Invitrogen, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av en ug total RNA i samsvar med produsentens instruksjoner (Promega, Madison, WI, USA). PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn-reagens (Applied Biosystems, CA, USA) og de følgende PCR-primere;
RABEX-fem plakater (fremover) 5′-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 «og (revers) 5′-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3»;
VEGF plakater (fremover) 5′-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 «og (revers) 5′-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3» og
GAPDH plakater (fremover) 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 «og (omvendt) 5»-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 «. PCR-reaksjoner ble utført med en innledende denaturering ved 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min.
GAPDH
ble anvendt som en intern kontroll, og alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. De relative uttrykk prosenter av
RABEX-5
i hver sammenkoblet tumor til ikke-tumor vevsprøve ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode.
Immunohistochemistry
Parafin -embedded vevssnitt fra pasienter eller nakne mus ble varmebehandlet ved 60 ° C i 1 time, avvokset i xylen, re-hydratisert i en etanol serie (100-50%) og ble behandlet i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0 ) for antigen gjenfinning. Endogen peroksidase-aktiviteten ble hemmet etter inkubering med metanol inneholdende 0,3% H
2o
2 i 30 minutter. Seksjonene ble deretter inkubert med antistoffer detektere RABEX-5 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, USA) eller VEGF (1:150; Ab46154, Abcam, USA) ved 4 ° C over natten. Den følgende eksperimentelle fremgangsmåte ble inkubert med det sekundære antistoff. Vevssnitt ble kontra med Mayers hematoksylin. Lysbilder ble uavhengig evaluert av to patologer, blindet for noen pasientdata. Den fargeintensitet for RABEX-5 ble scoret som 0 (ingen flekker), en (mild flekker), 2 (moderat farging) eller 3 (intens farging). Farging område ble scoret som 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) eller 4 (76-100%), på basis av prosentandelen av positivt farget celler. Den endelige farging score, beregnet som summen av intensitet og skjøte score, ble delt inn i tre grupper som følger: 0-2, negativ uttrykk; 3-4, svak uttrykk; og 5-6, sterkt uttrykk.
Målrettet stanse av RABEX-5
RABEX-5 lentiviral interferensvektoren ble kjøpt fra Shanghai GenePharma Co., Ltd Sekvensen av RABEX-5 innblanding målretting oligo var 5′-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 «, mens den ikke-homologe kontrollsekvens var 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3». SGC-7901 og NCI-N87-celler ble sådd ut i 6-brønns plater (5 x 10
4 celler /brønn), dyrket til 40% konfluens og ble behandlet med titrert viral supernatant ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10.
Vest-blot analyse
Hele celleproteiner ble ekstrahert fra celler ved hjelp av RIPA buffer som inneholder proteasehemmer Cocktail (Pierce, Rockford, IL, USA). Protein ble kvantifisert ved hjelp av en BCA Protein Assay Kit (Pierce). Celleekstrakter (100 pg) ble separert ved 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese og overført til polyvinylidenfluorid membraner. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann (TBS) og inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C over natten. De primære antistoffer ble brukt var kanin anti-RABEX-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) og muse anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). Membraner ble deretter vasket tre ganger i TBS-Tween-løsning i 15 min, og inkubert med sekundære antistoffer. Signaler ble oppdaget ved hjelp av en forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) i henhold til produsentens protokoll.
Celleproliferering analysen
Celleproliferering ble målt ved hjelp av en Cell Counting Kit -8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). SGC-7901 eller NCI-N87-celler ble utsådd i 96-brønns plater (1,5 x 10
3 celler /brønn) og inkubert i forskjellige tidspunkter (24, 48, 72, 96 og 120 h). Vekstmediet ble deretter fjernet og erstattet med 200 ul RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS og 20 ul av CCK-8 og platene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer. Absorbans ble målt ved 450 nm ved hjelp av en Safire2 mikroplateleser. RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS og CCK-8 ble anvendt som en kontroll.
kolonidannelse assay
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater (1 x 10
3 celler /brønn) og kulturmediet ble erstattet hver 3-4 dager. Etter 14 dagers kultur, ble cellekolonier fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter og farget med 0,1% krystallfiolett i 20 min, og fotografert. Kolonier med mer enn 50 celler ble telt i hver strek.
Analyse av cellesyklus og apoptose
SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD celler og kontrollceller ble samlet og cellesyklus og apoptose ble bestemt ved flow-cytometri. For cellesyklusanalyse, ble cellene fiksert med 75% etanol og lagret ved 4 ° C over natten. Den følgende dag, fikserte celler ble vasket med PBS, behandlet med RNase A (50 ug /ml) og farget med propidiumjodid (PI) (50 ug /ml) i 30 min i mørket. De fargede celler ble analysert ved flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson).
For apoptose analyse, en Annexin V-APC apoptose Detection Kit I (BD Pharmingen, USA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. PI og Annexin V-APC dobbel farging ble utført, og cellene ble analysert ved flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson), ved hjelp av Cell quest software (Becton Dickinson). Annexin V-APC-positive og PI-negative celler ble definert som gjennomgår apoptose. Alle forsøk ble utført in triplo, og de gjennomsnittlige verdier for disse gruppene ble beregnet.
Transwell migrering og invasjon assay
For migrerings assays, 1 x 10
5-celler ble suspendert i serum- RPMI-1640-medium og sådd ut på kamre som ikke ble belagt med Matrigel (Corning Costar, NY, USA). For invasjonen analysen ble det øvre kammer forbelagt med Matrigel (BD Bioscience, CA, USA) i henhold til produsentens protokoller, og 1 x 10
5-celler i serumfritt RPMI-1640 medium ble tilsatt til kammeret. For begge analyser, ble medium inneholdende 10% FBS tilsatt til det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter 24 timers kultur, ble kamre farget med 0,5% krystallfiolett oppløsning i 15 min, og nedsenket i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 10 minutter. Celler i det nedre kammer ble deretter tellet under et invertert mikroskop. Verdier er uttrykt som gjennomsnittlig celletall i fem tilfeldige synsfelt (200 x).
sårhelende assay
Celler ble sådd i 6-brønns plater og dyrket inntil de nådde konfluens. Sår ble klødd på monolag av celler ved hjelp av 20-ul pipettespisser. Platene ble vasket en gang med friskt medium for å fjerne ikke-adherente celler etter kultur av celler for 0 eller 48 h (medium uten kalveserum), og fotografert.
xenograft modell
Fire-uke- gamle BALB /C nakne mus ble kjøpt fra Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences i Shanghai. Dyrene ble plassert i bur med flis beddings i et temperaturkontrollert rom (68-72 ° C) med en 12-timers lys-mørke syklus og 45-55% relativ fuktighet, og fikk lov til fri tilgang til kosthold og drikkevann. I korthet, SGC-7901 /KD eller SGC-7901 /NC-celler ble trypsinisert og resuspendert i PBS (pH 7,4) for injeksjon inn i en mus, i et totalt volum på 100 ul. Cellesuspensjonen (1 x 10
6 celler) ble injisert inn i den høyre flanken til mus. Tumorstørrelse ble målt utvendig hver 3. dag ved hjelp av en skyvelære, og tumor volum ble beregnet ved hjelp av formelen: lengde (mm) × bredde
2 (mm) × 0,52. For å bøte på noen lidelse hos mus observert i løpet av disse eksperimentelle studier, ble musene avlivet av CO
2 innånding den 28. dagen etter intraperitoneal injeksjon, og svulster ble veid etter disseksjon. Prøvene ble lagret i flytende nitrogen for QRT-PCR eller fiksert i 4% formalin for å oppnå parafininnstøpte seksjoner. Alle prosedyrer ble utført i henhold til Animal Care og bruk retningslinjer godkjent av Taishan Medical University Animal Care komiteen.
Statistisk analyse
Data er representert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistiske forskjeller mellom de to gruppene ble undersøkt av Student
t
-test. Sammenhenger mellom RABEX-fem uttrykk i mage kreft vev og clinicopathological parametre ble analysert ved chi-square eller Fishers eksakte tester.
P
0,05 ble betraktet som signifikant, og
P
0,01 ble vurdert som svært betydnings
Resultater
RABEX-fem uttrykk er oppregulert i. mage kreft vev
uttrykk for
RABEX-5
ble undersøkt i magekreft og tilstøtende ikke-tumorvev ved QRT-PCR. Vi observerte signifikant høyere uttrykk for
RABEX-5
mRNA i mage kreft vev sammenlignet med tilsvarende ikke-tumorvev (
P
. 0,01, figur 1A). Disse resultatene ble bekreftet på proteinnivået ved immunhistokjemisk farging (Fig. 1 B, C, D, E). RABEX-5-ekspresjon ble hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma av kreftceller. RABEX-5 ble oppregulert i 61,8% (68/110) av magekreftpasienter. Vi neste undersøkt forholdet mellom RABEX-5 uttrykk og clinicopathologic funksjoner i magekreft. Oppregulering av RABEX-5 ble assosiert med tumorstørrelse (
P
= 0,035) og lymfeknutemetastase (
P
= 0,006), men ikke med andre clinicopathological faktorer, inkludert kjønn, alder eller svulst plassering (tabell 1).
(A)
RABEX-5
mRNA uttrykk i mage kreft vev og sammenkoblede tilstøtende ikke-tumorvev ble undersøkt av kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR ) og normalisert til
GAPDH
. Barer representerer hjelp av
RABEX-5
relative uttrykk i kreft vev og ikke-tumorvev, henholdsvis. (B-E) Karakterisering av RABEX-5-protein-ekspresjon i humane mage kreftvev og parvise tilstøtende ikke-tumor vev ved immunhistokjemisk farging. (B) Sterk positiv RABEX-fem uttrykk i magekreft. (C) Svak positiv RABEX-fem uttrykk i magekreft. (D) negative uttrykk i magekreft RABEX-5. (E) Negative RABEX-fem uttrykk i ikke-tumor mageslimhinnen.
nedregulering av RABEX-5 hemmer magekreft celleproliferasjon og kolonidannelse
Vi neste undersøkt ekspresjon av RABEX-5 i gastriske cellelinjer, og den ikke-kreftcellelinje, GES-en, ved western blot-analyse. RABEX-5 ble uttrykt i alle cellelinjene som ble testet, og var spesielt høy i SGC-7901 og NCI-N87 celler (Fig. 2A). For å utforske funksjonene RABEX-5 i mage kreft cellelinjer utførte vi målrettet knockdown av RABEX-5 i høy-uttrykke cellelinjer, SGC-7901 og NCI-N87. RABEX-5 uttrykket ble betydelig redusert i SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD celler sammenlignet med (Fig. 2B) kontrollceller. Først undersøkte vi effekten av tapet av RABEX-5 på veksten av magekreftceller. Etter 5 dager med kultur, vekstraten til SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD celler var betydelig tregere enn (Fig. 2C) kontrollgrupper. Vi har også bekreftet disse observasjonene i kolonidannelse analyser. Colony tallene ble betydelig redusert i SGC-7901 /KD celler og NCI-N87 /KD celler sammenlignet med kontrollceller (Fig. 2D), og vi observert at kolonistørrelse var også mindre i forsøksgruppene sammenlignet med kontroller. Disse dataene antyder at nedregulering av RABEX-5 hemmer magekreft celleproliferasjon.
(A) Western blot analyse av RABEX-fem protein uttrykk i sju magekreftcellelinjer og GES-1. (B) RABEX-fem proteinnivåer i SGC-7901 /KD, SGC-7901 /NC, NCI-N87 /KD og NCI-N87 /NC celler ble analysert ved western blot. (C) CCK-8 celleproliferasjonsanalyse for SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD og kontrollgrupper. Curves indikerer en betydelig grad av spredning sammenlignet med kontroller (
P
0,05). (D) Representative fotografier og kvantifisering av kolonidannelse forsøk i hver cellelinje. *
P
0,05; **
P
. 0,01
nedregulering av RABEX-5 fremmer apoptose av mage kreft celler og induserer G0 /G1 cellesyklus arrest
De observerte effekter av RABEX-5 knockdown på cellevekst kan skyldes endringer i cellesyklusprogresjon og apoptose. Vi undersøkte derfor effekten av RABEX-fem stanse på cellesyklus og apoptose
in vitro
, ved hjelp av flowcytometri. Flowcytometrisk analyse viste at andelen celler i G0 /G1 fase i SGC-7901 /KD eller NCI-N87 /KD cellene var høyere enn i SGC-7901 /NC eller NCI-N87 /NC kontrollgruppene, mens andelen celler i G2 /M fasen ble signifikant redusert sammenlignet med kontroller (fig. 3A, B). Vi har også observert signifikante effekter på apoptose i de forskjellig behandlede gruppene (fig. 3C, D), med nedregulering av RABEX-5 ekspresjon som fører til en økning i magekreft celle apoptose.
(A) Andel av celler i ulike faser av cellesyklusen. (B) Representative histogram som viser cellesyklus profiler av SGC-7901 /KD, SGC-7901 /NC, NCI-N87 /KD og NCI-N87 /NC celler. (C) Celler farging positiv for Annexin V-APC og negative for propidiumjodid (PI) ble ansett for å ha gjennomgått apoptose. (D) Representative histogrammer som viser apoptose av hver gruppe av magekreftceller. *
P
0,05; **
P
. 0,01
nedregulering av RABEX-5 hemmer migrasjon, invasjon og sårhelende evne mage kreftceller
For å undersøke påvirkning av RABEX-5 på migrasjon og invasjon, vi neste utført Transwell migrasjon og invasjon analyser. Nedregulering av RABEX-5 trykkes celle migrasjon (SGC-7901 /KD-gruppen, 121,3 ± 6,1 celler /idrettsplass; SGC-7901 /NC-gruppen, 261,0 ± 10,5 celler /idrettsplass; NCI-N87 /KD-gruppen, 108,7 ± 6,1 celler /felt ; NCI-N87 /NC-gruppen, 241,7 ± 10,6 celler /idrettsplass;
P
. 0,05) (figur 4A, C). Lignende resultater ble observert i Transwell invasjonsanalyser (SGC-7901 /KD-gruppen, 76,3 ± 6,1 celler /idrettsplass; SGC-7901 /NC-gruppen, 108,7 ± 6,0 celler /idrettsplass; NCI-N87 /KD-gruppen, 60,7 ± 6,0 celler /felt ; NCI-N87 /NC-gruppen, 119,0 ± 8,5 celler /idrettsplass;
P
. . 0,05) (figur 4B, D)
(A, B) Transwell analyser. Fotografier viser celler etter migrasjon gjennom Micropore membraner med eller uten Matrigel. (C, D) Histograms viser antall trekkende og invadere celler. (E) sårhelende analysen med mage kreftceller. Bilder ble tatt 0 og 48 timer etter å skrape celleoverflaten. En representant bilde fra tre uavhengige eksperimenter er vist. (F)
VEGF
mRNA uttrykk ble evaluert ved QRT-PCR. (G) VEGF-protein-ekspresjon ble undersøkt ved western blot. *
P
0,05; **
P
. 0,01
For å undersøke effekten av RABEX-5 på motilitet og sårheling, vi også utført sårhelende analyser. Vi har observert at avstanden mellom viklet kanter av SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD-celler var vesentlig lengre enn de av SGC-7901 /NC eller NCI-N87 /NC-celler (fig. 4E). I samsvar med disse observasjonene ble nivåer av VEGF nedregulert både på mRNA og protein nivå i SGC-7901 /KD celler (Fig. 4F, G).
stanse av RABEX-5 hemmer vekstmagekreft
in vivo
Basert på
in vitro
funn beskrevet ovenfor, undersøkte vi neste effekten av RABEX-fem stanse på tumorvekst
in vivo
ved å injisere SGC7901 /KD eller SGC7901 /NC celler subkutant i høyre flanke regioner av nakne mus. Tumorstørrelse ble overvåket hver 3. dag med en caliper. Tumor volum ble betydelig redusert hos mus 2 uker etter injeksjon av SGC-7901 /KD celler sammenlignet med kontrollceller (
P
0,05, Fig. 5A). Svulsten volumet av xenografter avledet fra SGC-7901 /KD gruppen var sammenlignbar med SGC-7901 /NC gruppe, viser en markert nedgang i tumorvolumet 4 uker etter tumorcelle vaksinasjon (
P
0,05, fig. 5B, C). I tillegg er vekten av tumorer avledet fra SGC-7901 /KD cellene var betydelig mindre enn den til kontrollgruppen (
P
0,05, Fig. 5D). Vi neste undersøkte uttrykk for VEGF i transplantasjon tumorprøver ved QRT-PCR og immunhistokjemi. Som vist på fig. 5E og 5F, ble nivåer av VEGF mRNA og protein redusert i SGC-7901 /KD-gruppen sammenlignet med SGC-7901 /NC-kontroll. Disse
in vivo
data er konsistente med våre
in vitro
observasjoner og bekrefter at knebling av RABEX-5 hemmer magekreft vekst og progresjon ved å modulere VEGF transkripsjonen aktivitet. I sammendraget, spiller RABEX-5 en onkogen rolle i magekreft.
(A) Tumor volum ble målt på ulike tidspunkter i mus inokulert med SGC-7901 celler infisert med RABEX-fem knockdown lentiviral vektor (SGC- 7901 /KD celler). (B) Svulster høstet fra mus 4 uker etter injeksjon med SGC-7901 /KD celler (C) Individuelle kreft volumer for hver mus etter disseksjon. (D) Den endelige tumorvekt ble målt ved slutten av forsøket. (E) Uttrykk for
VEGF
mRNA i tumorer avledet fra nakne mus. (F) Immunhistokjemisk analyse av VEGF uttrykk i tumorer avledet fra SGC-7901 /NC og SGC-7901 /KD grupper. *
P
0,05; **
P
. 0,01
Diskusjoner
Selv om tidligere studier har vist at RABEX-fem spiller en rolle i tumordannelse i flere typer kreft [11 ] – [14], dens rolle i magekreft hadde ikke blitt undersøkt. I denne studien fant vi at RABEX-fem uttrykk er betydelig oppregulert i mage kreft vev sammenlignet med tilstøtende normalt vev, noe som indikerer at RABEX-5 kan bidra til magekreft tumorigenesis. I tillegg ble ekspresjon av RABEX-5 signifikant assosiert med tumorstørrelse og lymfeknutemetastase. I kontrast, var det ingen signifikante korrelasjoner mellom unormal RABEX-5 uttrykk og kjønn, alder eller svulst plassering. Dette er den første studien som belyse clinicopathological betydningen av RABEX-fem uttrykk hos pasienter med magekreft.
For å undersøke hvilken rolle RABEX-5 i tumorvekst, vi neste utført omfattende tap av funksjonsanalyse i RABEX- 5 høyt uttrykker cellelinjer, SGC-7901 og NCI-N87. Vellykket inhibering av RABEX-5-ekspresjon ble oppnådd ved RNAi-teknologi, og knockdown ble bekreftet ved western blot. Våre analyser viste at celleformering ble signifikant redusert i SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD-celler og lignende resultater ble oppnådd i kolonidannelse analyser. Viktigere,
in vivo
xenograft modeller støttet disse
in vitro
observasjoner. Denne fenotype kan være forårsaket av RABEX-5 regulerer spesifikke gener og signalveier, og dermed påvirke cellesyklus og apoptose. I Transwell-analyser, færre SGC-7901 /KD og NCI-N87 /KD celler migrert til det nedre kammer enn kontrollcellene, noe som tyder på at RABEX-5 forbedrer migrering og invasjon i magekreftceller. Sårtilheling var også betydelig redusert etter stanse av RABEX-5. Disse resultatene bekrefter den viktige rollen RABEX-5 i magekreft cellevekst og metastatisk atferd. Men den nøyaktige molekylære mekanismen som RABEX-5 utøver disse effektene er ikke kjent, siden studier som involverer RABEX-5 er begrenset.
Tidligere studier har vist at RABEX-5 spesifikt kan bindes til den aktive formen av RAB- 5, og dermed regulerer dokking og fusjon av endosomale membraner, motiliteten i endosomer og intracellulær signaltransduksjon [15]. Ekspresjonen av RAB-5-proteiner har blitt assosiert med utvikling av forskjellige ondartede tumorer [16] – [18] og er i stand til å fremme migrering av tumorceller [19], [20]. Angiogenese spiller en nøkkelrolle i tumorgenese [21], og reguleres av en rekke faktorer som for eksempel blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [22]. Den PI3K /Akt signalveien kan reguleres ved både VEGF og PDGF. For eksempel VEGF forbedrer neuroblastom spredning ved å aktivere PI3K /Akt signaliserer [23]. På samme måte har studier vist at PDGF kan påvirke migreringen evnen til cellene via PI3K /AKT sti [24]. Aktivering av PI3K /Akt signalering kan inhibere celle apoptose indusert ved forskjellige stimuli [25] – [29], og fremmer cellesyklusprogresjon [30], [31], og dermed fremme celleoverlevelse og proliferasjon. Denne reaksjonsveien deltar også i angiogenese [32], [33], og spiller en viktig rolle i tumordannelse, invasjon og metastase [34], [35]. Vår studie viser at RABEX-fem stanse utløser en reduksjon i VEGF uttrykk. Derfor hypoteser vi at RABEX-5 fremmer vekst og metastatisk evne mage kreftceller gjennom aktivering av VEGF og nedstrøms signalveier.
I konklusjonen, viser vi at RABEX-5 fremmer spredning, kolonidannelse, migrasjon og invasjon, noe som tyder på at RABEX-5 kan være et onkogen i magekreft, og dens virkning kan være delvis mediert ved modulering av VEGF aktivering. RABEX-5 kan derfor representere en ny diagnostisk og prognostisk markør og en roman terapeutisk mål i magekreft. Flere tiltak bør gjøres for å avklare signalveier bak disse biologiske fenomener.
