Abstract
Bmi1 er overuttrykt i en rekke menneskelige kreft inkludert gastrointestinal kreft. Det høye nivået av ekspresjon Bmi1 protein er assosiert med dårlig prognose av gastrointestinale kreftpasienter. På den annen side, tumorassosierte makrofager (TAM) bidra til tumorvekst, invasjon og metastase ved fremstilling av forskjellige mediatorer i svulsten mikromiljøet. Målet med denne studien var å undersøke TAM-mediert regulering av Bmi1 uttrykk i gastrointestinal kreft. Forholdet mellom TAMs og Bmi1 uttrykk ble analysert ved immunhistokjemi og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR), og resultatene viste en positiv sammenheng med tumor-infiltrerende makrofager (CD68 og CD163) og Bmi1 uttrykk i kreftceller. Co-kultur med TAMs utløst Bmi1 uttrykk i kreftcellelinjer og forbedret sfære formasjon evne. miRNA microarray analyse av et magekreft cellelinje co-kultivert med makrofager ble gjennomført, og ved hjelp av
i silico
metoder for å analysere resultatene, identifiserte vi MIR-30e * som en potensiell regulator av Bmi1 uttrykk. Luciferasepreparater analyser ved hjelp av MIR-30e * ligne avslørte at Bmi1 var et direkte mål for Mir-30e * av interaksjoner med den antatte MIR-30e * bindingssteder i Bmi1 3 «uoversatt region. QRT-PCR-analyse av resected kreftprøvene viste at MIR-30e * ekspresjon ble nedregulert i tumor områder sammenlignet med ikke-tumor regioner, og Bmi1 ekspresjon ble inverst korrelert med MIR-30e * ekspresjon i magekreft vev, men ikke i tykktarmskreft vev . Våre funn tyder på at TAMs kan føre til økt Bmi1 uttrykk gjennom MIR-30e * undertrykkelse, som fører til tumorprogresjon. Undertrykkelse av Bmi1 uttrykk formidlet av TAMs kan derfor representere en mulig strategi som behandling av gastrointestinal kreft
Citation. Sugihara H, Ishimoto T, Watanabe M, Sawayama H, Iwatsuki M, Baba Y, et al. (2013) Identifisering av MIR-30e * Regulering av Bmi1 Expression mediert av Tumor-Associated Makrofager i Gastrointestinal Cancer. PLoS ONE 8 (11): e81839. doi: 10,1371 /journal.pone.0081839
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 04.07.2013; Godkjent: 17 oktober 2013; Publisert: 28.11.2013
Copyright: © 2013 Sugihara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av den Okukubo minnefond for medisinsk forskning på Kumamoto University School of Medicine, Medical Research Oppmuntring Prize av Japan Medical Association og Japan Society for Promotion of Science (JSP) Grant-i-Aid for Scientific Research (til TI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bmi1 er medlem av polycomb-undertrykkende kompleks en med en viktig rolle i å opprettholde kromatin stanse [1,2]. Bmi1 spiller en funksjon i selvfornyelse av nevronale og blodkreft stamceller gjennom undertrykkelse av INK4a /ARF locus [3-6]. I tillegg er Bmi1 uttrykt i tarm stamceller og innblandet i å opprettholde tynntarmen epitelet [7]. Bmi1 ble først identifisert som et onkogen som samvirker med c-myc i løpet av mus lymphomagenesis, og er overuttrykt i mange humane kreftformer, inkludert gastrointestinal kreft [8-10]. Videre er ekspresjonsnivået av Bmi1 protein assosiert med dårlig prognose av gastrointestinale kreftpasienter [9,10]. Imidlertid er mekanismen bak Bmi1 regulering i kreftceller stort sett ukjent.
Faste tumorer bestå av cancerceller og ulike typer av stromale celler, fibroblaster, endotelceller og hematopoetiske celler, hovedsakelig makrofager og lymfocytter. Makrofager har funksjonell plastisitet og beskrives av to forskjellige polarisasjonstilstander: klassisk aktivert (M1) og alternativt-aktiverte (M2) makro fenotyper. Tidligere studier viser at M1 og M2-polariserte makrofager spille ulike funksjonelle roller i svulsten mikromiljøet [11,12]. M1-polariserte makrofager har generelt antigenpresenterende funksjoner og tumorici-dal aktivitet. I motsetning til M2-polariserte makrofager spiller en rolle i respons til parasitter, sårheling, vev-omforming, og fremme veksten og vaskularisering av tumorer. I mange menneske kreft, tumor-assosiert makrofager (TAM), bidra til tumorvekst, invasjon og metastasering ved å skille ulike meglere, slik det ble foreslått at TAMs var overveiende polarisert til M2 makrofag fenotype [13-17]. På den annen side, mer nylige studier har vist at makrofager var meget plast-celler, og deres epigenetiske endringer reprogramed TAMs fra en M2 til en M1-lignende fenotype i tumorer [17,18].
microRNAs (mirnas) er ikke-kodende RNA (21-23 nukleotider) som binder ufullkomment til den 3 «ikke-translaterte region (UTR) av sine mål-mRNA for å undertrykke deres oversettelse. mirnas har blitt funnet å målrette ulike onkogener og tumor dempere, og nye bevis tyder på at feilregulering av miRNAs er involvert i patogenesen av mange kreftformer [19,20].
For å utforske regulering av Bmi1 uttrykk i kreftceller undersøkte vi en mulig sammenheng mellom Bmi1 uttrykk i gastrointestinale kreftceller og infiltrere makrofager i svulsten mikromiljøet, og undersøkt mekanismen bak reguleringen av Bmi1 uttrykk. Her viser vi at Mir-30e * mediert av TAMs regulerer direkte Bmi1 uttrykk i gastrointestinal kreft.
Materialer og metoder
Cell kultur og behandlings
cellelinjene AGS, NUGC4 , COLO201, og THP-1 ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). HCT116-celler ble dyrket under 5% CO
2 ved 37 ° C i Dulbeccos modifiserte Eagles medium-næringsblanding F-12 (Sigma, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% FBS. Cellelinjene ble hentet fra den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser Cell Bank og Riken Bioresource Senter Cell Bank.
Immunohistochemistry (IHC) og scoring
Utvalgets behandling og IHC prosedyrer ble utført som tidligere beskrevet [ ,,,0],21]. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved bruk av 3% -ig hydrogenperoksyd. Snittene ble inkubert først med fortynnede antistoffer, etterfulgt av inkubasjon med biotin-fri pepperrot peroksidase-merket polymeren fra Envision Plus-deteksjonssystem (Dako, Glostrup, Danmark). Positive reaksjoner ble visualisert ved hjelp av diaminobenzidin løsning, og kontra med Meyers hematoxylin. Som negativ kontroll ble mus primære antistoffer anvendt og ingen positive flekker ble observert. All IHC farging ble scoret uavhengig av to patologer. Nuclear Bmi1 og cytoplasmatiske CD68 og CD163 uttrykk ble tolket i henhold til de retningslinjer som er publisert i forrige undersøkelse. For atom Bmi1 og cytoplasma CD68 og CD163, scoret vi de positive farge resultater i kategorier fra 0 til 3+ som følger: 0, ingen farging; 1+, 1-25% av prøven farget; 2+, 26-50%; og 3+, 50%. . En score på 3+ ble ansett å være en positiv IHC resultat
Antistoffer for IHC og immunoblotting analyser
Følgende antistoffer ble brukt for IHC analyse: et monoklonalt antistoff spesifikt for humant Bmi1 ( 1: 100 fortynning; Abcam, Cambridge, UK), et mus monoklonalt antistoff som er spesifikt for humant CD68 (1: 100 fortynning; Dako, Glostrup, Danmark), og et monoklonalt antistoff som er spesifikt for humant CD163 (1: 100 fortynning; Novocastra, Newcastle, UK). De følgende antistoffer ble anvendt for immunblotanalyse: En mus monoklonale antistoffer mot Bmi1 (1: 1000), og et kanin polyklonalt antistoff for human β-aktin (1: 1000; Cell Signaling Technology).
RNA og miRNA isolasjon
Total RNA, inkludert miRNA, ble isolert fra cellelinjer ved hjelp av en Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA), og eluert i 100 mL av oppvarmet eluering løsning, i henhold til produsentens protokoll. mirnas ble ekstrahert fra formalinfiksert parafin-embedded gastrointestinal kreft vev og deres matchet tilstøtende normale gastrointestinale epitel ved hjelp av en RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (Ambion), i henhold til produsentens instruksjoner. Renheten og konsentrasjonen av alle RNA-prøver ble evaluert ved deres absorbans-forhold ved 260/280 nm, bestemt ved bruk av et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Rockland, DE, USA).
THP-1 makrofag forberedelse og co-kulturen assay
THP-1-celler ble sådd i transwellinnsatser (3540, Corning) i 6-brønners plater (1 x 10
6 celler /brønn). For fremstilling av M1-polariserte THP-1-makrofager, ble 320 nM forbolmyristatacetat (PMA) tilsatt til THP-1-celler i 6 timer, etterfulgt av PMA pluss 20 ng /ml interferon (IFN) -γ og 100 ng /ml lipopolysakkarid for de følgende 18 timer. For fremstilling av M2-polariserte THP-1-makrofager, ble 320 nM PMA tilsatt til THP-1-celler i 6 timer, etterfulgt av PMA pluss 20 ng /ml interleukin (IL) -4 /IL-13 for den følgende 18 timer. Etter tre vaskinger for å fjerne cytokiner, M1 eller M2-polariserte THP-1-makrofager ble ko-dyrket i øvre innsatser med AGS eller HCT116-celler i 6-brønners plater (1 x 10
5-celler /brønn) uten direkte kontakt, i hvert medium uten 10% FBS, som beskrevet ovenfor. Etter 24 timer med ko-kultur, ble de øvre innsatser inneholdende makrofager forkastet. AGS og HCT116-celler ble vasket og anvendt for etterfølgende forsøk.
Sphere kultur
Som beskrevet ovenfor, M1 eller M2-polariserte THP-1-makrofager ble fremstilt. Etter tre vaskinger for å fjerne cytokiner, M1 eller M2-polariserte THP-1-makrofager ble ko-dyrket i øvre innsatser med AGS og HCT116-celler (1 x 10
4 celler /brønn) ikke-klebende i 6-brønners plater ( 3471, Corning) uten direkte kontakt, belagt med tynn agarose ved en tetthet på 2 x 10
4 /mm
3 i serumfritt DMEM /F12-medium (Invitrogen) inneholdende 1% N2 (Gibco), 2% B27 (Gibco), 20 ng /ml human fibroblast vekstfaktor (FGF) -2 (Sigma, St. Louis, MO), og 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF) (Sigma). Hver behandling ble utført i triplikat. Dyrkningsmediet ble endret annenhver dag inntil sfære formasjon. Etter 10 dager, ble kulene oppsamlet.
Macrophage kultur og ko-kultur assay
perifere mononukleære blodceller ble oppnådd fra friske frivillige givere. CD14 + monocytter ble isolert ved anvendelse av CD14-mikroperler (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Monocytter ble sådd ut i 6-brønns plater (1 x 10
5 /brønn) og dyrket med granulocytt M-CSF (2 ng /mL) (Wako, Tokyo, Japan) i fem dager for å indusere umodne makrofager. Etter vaskinger med PBS, ble cellene stimulert med IFN-γ (1 ng /mL) (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) for å fremkalle M1 makrofager. Monocytter ble sådd ut og dyrket med M-CSF (100 ng /mL) (Wako) i fem dager for å indusere umodne makrofager. Etter vaskinger med PBS, ble cellene stimulert med IL-10 (10 ng /ml) (Peprotech) for å indusere M2 makrofager. Media fra M1 eller M2-polariserte makrofag kulturer ble oppsamlet og overført inn i 6-brønners plater inneholdende AGS og HCT116-celler (1 x 10
4 celler /brønn). Etter 24 timer med ko-kultur, ble AGS og HCT116-celler vasket og benyttet for etterfølgende eksperimenter.
miRNA microarray
cyanine-3 (Cy3) merket cRNA ble fremstilt av 100 ng RNA ved hjelp av Agilent miRNA Komplett Merking og Hyb Kit (p /n 5190-0456) i henhold til produsentens instruksjoner. Agilent Menneskelig 8 x 60K miRNA Array ble utført på de to samleprøver. Hybridisering ble utført i henhold til instruksjonene fra Agilent miRNA Komplett Merking og Hyb Kit. Lysbilder ble skannet umiddelbart etter vask på Agilent DNA microarray Scanner (G2505C) ved hjelp av en fargeskanning innstilling for 8x60k matrise lysbilder (Skann.område 61×21.6 mm, Skanneoppløsning 5um er Dye kanalen satt til Grønn og Grønn PMT er satt til 100% ). De skannede bildene ble analysert med Feature Extraction programvare 10.7.3.1 (Agilent) ved hjelp av standardparameterne (protokoll miRNA_107_Sep09). Probe intensiteter ble normalisert ved hjelp GeneSpring 12,0 gjennom persentil skift normalisering. Forskjellig uttrykt mirnas ble identifisert gjennom Fold Endre filtrering. Microarray data har blitt deponert i GEO (tiltredelse ingen GSE50601;. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50601).
Kvantitativ sanntid revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR)
uttrykk nivåer av MIR-30e * ble bestemt av TaqMan QRT-PCR bruker TaqMan miRNA analysesett (Ambion), i henhold til produsentens protokoll, som beskrevet tidligere . MIR-30e * uttrykket ble normalisert til uttrykk av RNU6B liten kjernefysiske RNA. Expression nivåer av Bmi1 ble kvantifisert ved Sonder Master QRT-PCR ved hjelp av en LightCycler 480 prober Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og normalisert til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase. Alle QRT-PCR reaksjoner ble kjørt med LightCycler 480 System II (Roche Diagnostics). De relative mengder av MIR-30e * og Bmi1 ble målt med to
-ΔΔCT metode. Alle QRT-PCR reaksjoner ble utført i tre eksemplarer.
Transfeksjon av miRNA
Celler ble transfektert med 5 nM ligne eller inhibitor MIR-30e (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ved hjelp Lipofectamine RNAiMax transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Spesifisiteten til transfeksjon ble verifisert ved hjelp av en negativ styreetterligner (Applied Biosystems). Uttrykket nivåer av MIR-30e * ble kvantifisert 48 timer etter transfeksjon, og cellene ble brukt for senere eksperimenter.
Generering av Bmi1 3’UTR mutanter
vektorer som inneholder muterte MIR-30e * målsekvenser i menneske Bmi1 3’UTR ble innført ved seterettet mutagenese ved hjelp av følgende PCR-primere: 5′- ccUAUGGACGU-UAAUUGAAAa -3 «for Luc-Bmi1-vill-type, og 5′- ccUAUGGACGU-UAUGACUUUa -3» for Luc-Bmi1-mutant.
Luciferase assay
AGS celler ble sådd ut i 96-brønners plater og transfektert med MultiFectam (Promega) ved hjelp av pMIR-RAPPORT ™ Luciferase miRNA Expression Reporter Vector inneholder firefly luciferase under kontroll av et pattedyr-promoter /terminator-systemet. En miRNA mål kloning regionen ble tatt nedstrøms av luciferase oversettelse sekvens eller tom vektor (Invitrogen), og etterligner kontroll eller etterligne MIR-30e (Invitrogen). Reporter ble utført 48 timer etter transfeksjon med Luc-Screen® System (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Alle forsøk ble utført in triplo.
Western blot-analyse
dyrkede celler oppsamlet fra 6-brønns plater ble vasket en gang i PBS og lysert i radioimmunopresipitasjon buffer supplert med protease /fosfatase-inhibitor cocktail (Thermo Scientific , Tokyo, Japan). Proteinprøver ble underkastet natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese og overført til en nitrocellulosemembran, og membranen ble inkubert med primære antistoffer. Signaler ble detektert ved inkubasjon med sekundære antistoffer ved hjelp av ECL Detection System (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
Pasienter og vevsprøver
Primær gastrointestinale karsinom vev og deres matchet tilstøtende normal gastrointestinal epitel ble innhentet fra 83 mage kreftpasienter og 49 tykktarmskreftpasienter som gjennomgikk gastrointestinal kreft reseksjon uten preoperativ behandling ved Institutt for gastroenterologisk kirurgi, Kumamoto universitetssykehus fra 2005 til 2008. signert informert samtykke til å delta ble innhentet fra alle pasienter. Studien ble godkjent av medisinsk etikk komité av Kumamoto University.
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer og dataene som vises er representative for konsekvent observerte resultater. Data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Chi-squared tester ble brukt for å vurdere forskjeller i andelen mellom Bmi1 uttrykk og CD68 /CD163 uttrykk. Uavhengig Student
t
-UNDERSØKELSER ble brukt til å sammenligne kontinuerlige variabler mellom de to gruppene, og Tukey-HSD prosedyren ble brukt til å sammenligne kontinuerlige variabler mellom de tre gruppene. For de statistiske analysene brukte vi JMP (versjon 9, SAS Institute) og SAS programvare (versjon 9.1, SAS Institute). En P-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Uttrykket av Bmi1 korrelerer med nivåene av TAMs i gastrointestinal kreft vev
TAMs bidrar til tumorvekst, invasjon og metastasering i mange kreftformer ved å produsere ulike meklere [13-17]. For å avgjøre om uttrykket av Bmi1 i kreftceller korrelerer med nivåene av TAMs, undersøkte vi Bmi1, CD68, og CD163 uttrykk i gastrointestinale kreftvevet ved hjelp av IHC. CD68-farging ble anvendt for å detektere pan-makrofager, og M2 populasjonen ble evaluert ved bruk av CD163, som tidligere beskrevet [22]. Resultatene viste en positiv sammenheng med Bmi1 og CD68 /CD163 uttrykk i magekreft (figur 1A, C) og i tykktarmskreft (figur 1B, D). Disse resultatene tyder på at makrofager i tumor stroma kan være involvert i Bmi1 ekspresjon i gastrointestinale kreftceller.
(A) Immunhistokjemi av Bmi1, CD68, CD163 og ekspresjon i 83 magekreft vev. Skala barer, 100um. (B) Andelen CD68 /163 positive prøver i høy Bmi1 uttrykker magekreft. Det var en signifikant sammenheng mellom Bmi1 uttrykk og CD68 /163 uttrykk (*
P
0,05, ***
P
0,001, henholdsvis). (C) Immunohistochemistry av Bmi1, CD68, og CD163 uttrykk i 49 tykktarm kreft vev. Skala barer, 100um. (D) Andelen CD68 /163 positive prøver i høy Bmi1 uttrykker tykktarmskreft. Det var en signifikant sammenheng mellom disse to gruppene (**
P
0,01, **
P
0,01, henholdsvis).
Bmi1 uttrykk økes i gastrointestinale kreftcellelinjer co-dyrket med M1 eller M2-polariserte THP-1 makrofager, som fører til ervervet evne sfære formasjonen i 3D kultur
Vi neste utførte en
in vitro
ko-kultur assay med M1 eller M2-polariserte THP-1-makrofager for å undersøke om makrofager påvirke Bmi1 ekspresjon i kreftceller og cancercellefunksjoner. Som vist tidligere, ble THP-1 celler differensiert i M1 eller M2-polariserte makrofager med distinkt cytokiner behandling (figur 2A) [23]. QRT-PCR-analyse viste at Bmi1 ekspresjon ble betydelig økt i AGS og HCT116-celler ko-dyrket med både M1 og M2-polariserte THP-1-makrofager (figur 2B, C). Bmi1 er involvert i selvfornyelse kapasitet gjennom undertrykkelse av INK4a-ARF locus, og dermed vi en hypotese om at gastrointestinale celler co-dyrket med TAMs kan ha kapasitet for selvfornyelse gjennom upregulating Bmi1 uttrykk. For å undersøke fenotypen til gastrointestinale celler ko-dyrket med TAMs, utførte vi en 3D-kule kultur dyrket i serumfritt ikke-klebende kultur i gastrointestinale celler ko-dyrket med M1 eller M2-polariserte THP-1-makrofager (figur 2D, E ). Sfæren dannelsen evne gastrointestinale celler co-dyrket med TAMs ble forsterket (figur 2F, G). Disse resultatene antydet at TAMs oppregulert Bmi1 uttrykk og forbedret sfære formasjon.
(A) cytokin produksjon profilen til M1 og-M2 polariserte THP-1 makrofager. (B) QRT-PCR-analyse av Bmi1 ekspresjon i AGS-celler ko-dyrket med M1 og M2-polariserte THP-1-makrofager sammenlignet med Bmi1 ekspresjon i AGS-celler bare som en kontrollgruppe. Betydelig høyere Bmi1 uttrykk ble oppdaget i co-kultivert grupper sammenlignet med kontrollgruppen (***
P
0,001, ***
P
0,001, henholdsvis). (C) QRT-PCR-analyse av Bmi1 ekspresjon i HCT116-celler ko-dyrket med M1 og M2-polariserte THP-1-makrofager sammenlignet med Bmi1 ekspresjon i HCT116-celler bare som en kontrollgruppe. Betydelig høyere Bmi1 uttrykk ble oppdaget i co-kultivert grupper sammenlignet med kontrollgruppen (***
P
0,001, ***
P
0,001, henholdsvis). (D) Mikroskopiske bilder av 3D sfære dyrkede AGS celler co-dyrket med makrofager, sammenlignet med 3D sfære dyrkede AGS celler bare som en kontrollgruppe. Skala barer, 100um. (E) mikroskopiske bilder av 3D sfære dyrkede HCT116-celler ko-dyrket med makrofager, sammenliknet med 3D-kule dyrkede HCT116-celler bare som en kontrollgruppe. Skala barer, 100um. (F) Betydelig høyere sfære tall ble påvist i ko-dyrket grupper sammenlignet med kontrollgruppen i AGS-celler (*
P
0,05, *
P
0,05, henholdsvis). (G) Betydelig høyere sfære tall ble påvist i ko-dyrket grupper sammenlignet med kontrollgruppen i HCT116-celler (*
P
0,05, **
P
0,01, respektivt) .
Identifikasjon av miRNAs regulerer Bmi1 uttrykk ved hjelp av kreft-relaterte miRNA screening i magekreftceller
Flere mirnas er involvert i å regulere virksomheten til kreftstamceller, inkludert selvfornyelse og tumorigenicity [19,20]. Vi testet derfor hypotesen om at reguleringen av Bmi1 ekspresjon i gastrointestinale kreftceller kan bli mediert ved hjelp mirnas miRNA mikromatriseanalyse. Vi valgte de ti mest downregulated mirnas i gastrointestinale celler co-dyrket med M1 eller M2-polariserte THP-1 makrofager sammenlignet med gastrointestinale celler alene (Tabell 1A, B). Ved hjelp av flere elektroniske databaser (Miranda, Diana, Targetscan, TargetMiner, miRbase), MIR-30e-3p (MIR-30e *) ble den eneste kandidaten miRNA blant alle identifiserte mirnas funnet å direkte målrette Bmi1 3 «UTR. Vi fokuserte derfor på MIR-30e * for videre analyse.
A
B
miRNAfold endring (M1 vs kontroll) miRNAfold endring (M2 vs control)hsa-miR-36820.006816627hsa-miR-36820.005809477hsa-miR-30e-3p0.011009754hsa-miR-373-3p0.015210649hsa-miR-3350.013768308hsa-miR-192-3p0.015870558hsa-miR-335-3p0.016194038hsv1-miR-H6-3p0.016751566hsa-miR-373-3p0.017847616hsa-miR-1225-3p0.017139628hsa-miR-192-3p0.01862193hsa-miR-36760.017353492hsa-miR-296-5p0.019188985hsa-miR-7660.032502682hsa-miR-1225-3p0.020111009hsa-miR-335-3p0.324230407hsa-miR-7660.038137453hsa-miR-769-5p0.445738351hsa-miR-769-5p0.434152471hsa-miR-30e-3p0.54343376Table 1. Microarray analyse av 1360 miRNAs i AGS cellelinjer co-kultivert med THP-1 makrofager. Product: (A) De ti beste mirnas nedregulert i AGS cellelinjer co-kultivert med M1-polariserte makrofager sammenlignet med kontrollene. (B) de ti beste mirnas nedregulert i AGS cellelinjer co-dyrkede med M2-polariserte makrofager sammenlignet med kontroller. CSV Last ned CSV
MIR-30e * undertrykker Bmi1 uttrykk i gastrointestinale celler og direkte rettet mot det Bmi1 3 «UTR
for å avdekke funksjonelle relevansen av MIR-30e * uttrykk, undersøkte vi Bmi1 uttrykk i de 6 gastrointestinale kreftcellelinjer ved Western blotting (figur 3A), og analysert sammenhengen mellom MIR-30e * og Bmi1 uttrykk i høy Bmi1 uttrykke kreft cellelinjer (AGS og HCT116) transfektert med MIR-30E * etterligner, og lav Bmi1 uttrykke kreftcellelinjer (NUGC4 og COLO201) transfektert med MIR-30E * hemmere. Western blot analyse viste signifikant redusert Bmi1 proteinnivået i AGS og HCT116-celler transfektert med MIR-30e * ligner sammenlignet med kontroller (figur 3B, C), og økte nivåer i NUGC4 og COLO201 celler transfektert med MIR-30E * hemmere sammenlignet med kontroller (Figur 3D, E). I tillegg til å undersøke fenotype av kreft celler transfektert med MIR-30E * ligner utførte vi en 3D-sfære kultur dyrket i serumfritt non-tilhenger kultur i AGS celler transfektert med MIR-30E * ligner (Figur 4A). Sfæren dannelsen evne AGS celler transfektert med MIR-30e * ligner ble hemmet (figur 4B), så vi bekreftet at nedregulering av MIR-30e * forårsaket en forbedret sfære formasjon.
(A) Western blot analyse av Bmi1 uttrykk i 6 gastrointestinale kreftcellelinjer. (B) Western blot analyse av Bmi1 uttrykk i høye Bmi1-uttrykke AGS cellelinjer transfektert med negativ kontroll (NC) og Mir-30e * etterligner. (C) Western blot-analyse av Bmi1 ekspresjon i høyt Bmi1-uttrykkende HCT116-cellelinjer transfektert med NC og MIR-30E * etterligner. (D) Western blot analyse av Bmi1 uttrykk i lave Bmi1-uttrykker NUGC4 cellelinjer transfektert med NC og MIR-30E * hemmere. (E) Western blot analyse av Bmi1 uttrykk i lave Bmi1-uttrykker COLO201 cellelinjer transfektert med NC og MIR-30e * hemmere.
(A) 3D sfære kultur dyrket i serumfritt non-adherent kultur med AGS-celler ko-dyrket med makrofager og transfektert med etterligne MIR-30e *, sammenliknet med 3D-kule kultur med AGS-celler ko-dyrket med makrofager og transfektert med etterligne NC som en kontrollgruppe. Skala barer, 100um. (B) betydelig lav sfære tall ble påvist i mimic MIR-30e * transfektert gruppene sammenlignet med kontrollgruppen (* P 0,05, * P 0,05, henholdsvis). (C) Det antatte MIR-30e * målstedet eller en mutert sekvens av 3′-UTR av Bmi1 ble klonet umiddelbart nedstrøms for luciferase-genet. (D) Luciferase-aktivitet av AGS-celler ko-transfektert med plasmider som inneholdt villtype MIR-30e * target-sekvens i den 3′-UTR av Bmi1 eller kontroll plasmider sammen med mRNA etterligne NC og etterligne MIR-30e *. (E) Luciferase-aktivitet av AGS-celler ko-transfektert med plasmider som inneholdt villtype eller mutant MIR-30e * target-sekvens i den 3′-UTR av Bmi1 sammen med mRNA etterligne NC og etterligne MIR-30e *.
Analyse av Bmi1 3 «UTR bruker online database Miranda avdekket en spådd målsekvens for MIR-30e *. Vi neste undersøkt om MIR-30e * direkte rettet mot det 3′-UTR av Bmi1 å bruke konstruksjoner som inneholder den antatte MIR-30e * målstedet eller en mutert sekvens av 3»-UTR av Bmi1 klonet umiddelbart nedstrøms for en luciferase genet. Den LUC-Bmi1 konstruere inneholdende den forutsagte MIR-30e * target-sekvens i den Bmi1 3 «UTR er vist i figur 4C, med frø-sekvenser angitt ved linjer. Transfeksjon av AGS celler med MIR-30e * ligne undertrykte betydelig luciferaseaktivitet fra reporter vektor inneholdende vill-type Bmi1 3 «UTR (LUC-Bmi1-WT) sammenlignet med kontroll-vektor (figur 4D). Vi har også bygget reporter vektorer som inneholder den muterte Bmi1 3 «UTR (LUC-Bmi1-MT). Transfeksjon med MIR-30e * mimic ikke undertrykke luciferaseaktivitet fra reporter vektor inneholdende det muterte 3 «UTR av Bmi1 sammenlignet med villtype-3» UTR-vektoren (figur 4E). Disse resultatene indikerer at Mir-30e * regulerer Bmi1 uttrykk ved direkte rettet mot sin 3 «UTR.
Bmi1 uttrykk er omvendt korrelert med MIR-30e * uttrykk hos pasienter med magekreft
Vi neste analysert nivåene av MIR-30e * uttrykk i kreftvev og deres matchet tilstøtende normale epithelia bruker QRT-PCR. Uttrykk av MIR-30e * var betydelig lavere i kreftvev sammenlignet med sine matchet tilstøtende normalt epitel i både magekreft (figur 5A) og tykktarmskreft (figur 5C). Videre sammenlignet vi MIR-30e * uttrykk nivåer mellom høy og lav Bmi1 uttrykker kreft vev. Høye Bmi1 uttrykk nivåene ble påvist i 45% (24/53) av magekreft prøver og 54% (20/37) av tykktarmskreft prøver. Bmi1 uttrykk ble omvendt korrelert med MIR-30e * uttrykk i magekreft (figur 5B). Men Bmi1 uttrykk var ikke assosiert med Mir-30e * uttrykk i tykktarmskreft (figur 5D). Disse dataene viste at Bmi1 uttrykk var sterkt korrelert med MIR-30e * uttrykk hos pasienter med magekreft, men ikke hos pasienter med tykktarmskreft.
(A) Nivåene av MIR-30e * uttrykk i 16 mage kreft vev og deres matchet tilstøtende normale gastriske epitel som bedømt ved QRT-PCR. (B) Nivåene av MIR-30e * uttrykk i 29 av høy og 24 av lav Bmi1-uttrykke mage kreft vev som vurderes av QRT-PCR. (C) Nivåene av MIR-30e * uttrykk i 37 tykktarm kreft vev og deres matchet tilstøtende normalt kolon epitel som vurderes av QRT-PCR. (D) Nivåene av MIR-30e * uttrykk i 20 av høy og 17 i lav Bmi1-uttrykke tykktarm kreft vev som vurderes av QRT-PCR.
M1 og M2-polariserte makrofager renset fra humane monocytter indusert nedregulering av MIR-30e * og oppregulering av Bmi1
Våre tidligere resultater viste at Bmi1 uttrykk øker betydelig hos AGS og HCT116 cellene co-dyrket med både M1 og M2-polariserte THP-1 makrofager. Vi neste co-kultivert AGS og HCT116-celler med M1 og M2-polariserte makrofager renset fra humane monocytter. Bmi1 uttrykk øker betydelig hos AGS celler co-dyrket med både M1 og M2-polariserte makrofager renset fra humane monocytter, og MIR-30e * uttrykket ble betydelig redusert i AGS celler co-dyrket med både makrofager (Figur 6A, C). I motsetning til dette ble Bmi1 ekspresjon betydelig øket i HCT116-celler ko-dyrket med M1-polariserte makrofager, men ikke i HCT116-celler ko-dyrket med M2-polariserte makrofager. Uttrykk av MIR-30e * ble betydelig redusert i HCT116 cellene co-dyrket med både makrofager (figur 6B, D). Dette resultat viste at M1 og M2-polariserte makrofager renset fra humane monocytter indusert nedregulering av MIR-30e * i gastrointestinale cellelinjer, og oppregulering av Bmi1 i magekreft cellelinje, men ikke i tykktarmskreftcellelinje.
(A) QRT-PCR analyse av MIR-30e * uttrykk i AGS celler co-dyrket med M1 og M2-polariserte makrofager. Betydelig lavere MIR-30e * uttrykket ble oppdaget i co-kultivert grupper sammenlignet med kontrollgruppen (***
P
0,001, *
P
0,05, henholdsvis). (B) QRT-PCR analyse av MIR-30e * uttrykk i HCT116 cellene co-dyrket med M1 og M2-polariserte makrofager. Betydelig lavere MIR-30e * uttrykket ble oppdaget i co-kultivert grupper sammenlignet med kontrollgruppen (***
P
0,001, **
P
0,01, henholdsvis). (C) QRT-PCR analyse av Bmi1 uttrykk i AGS celler co-dyrket med M1 og M2-polariserte makrofager. Betydelig høyere Bmi1 uttrykk ble oppdaget i co-kultivert grupper sammenlignet med kontrollgruppen (***
P
0,001, **
P
0,01, henholdsvis). (D) QRT-PCR analyse av MIR-30e * uttrykk i HCT116 cellene co-dyrket med M1 og M2-polariserte makrofager. Betydelig høyere Bmi1 ekspresjon ble påvist i M1 makrofag ko-dyrket grupper sammenlignet med kontrollgruppen (**
P
0,01). (E) Skjematisk fremstilling av MIR-30e * -Bmi1 signale mediert av TAM.
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at TAMs oppregulert Bmi1 uttrykk, noe som fører til økt sfære formasjon evne. Bmi1 uttrykk ble undertrykt av MIR-30e * gjennom MIR-30e * direkte binding til Bmi1 3 «UTR, og Bmi1 uttrykk ble omvendt korrelert med MIR-30e * uttrykk i kreftvevet.
