Abstract
ETV1
er overuttrykt i en undergruppe av kliniske prostatakreft som en fusjon transkripsjon med mange forskjellige partnere. Men
ETV1
kan også bli overuttrykt som en full-lengde transkripsjon. Full-lengde ETV1 protein fungerer annerledes fra avkortet ETV1 produsert av fusion gener. I denne studien vil vi beskrive den genetiske bakgrunn av full-lengde
ETV1
overekspresjon og de biologiske egenskapene til ulike helaftens ETV1 isoformer i prostatakreft. Break-apart FISH viste i fem av seks pasientprøver med overekspresjon av full-lengde
ETV1
en genomisk omorganisering av genet, noe som indikerer hyppig trans. Vi var i stand til å studere rearrangements i mer detalj i to svulster. I den første svulsten 5′-RACE på cDNA viste kobling av den fullstendige
ETV1
transkripsjon til første ekson av en prostata-spesifikt to ekson ncRNA genet som kart på kromosom 14 (
EST14
) . Dette resulterte i uttrykket av begge i full lengde
ETV1
transkripsjoner og
EST14-ETV1
fusion transkripsjoner. I kromosom sprer av en xenograft avledet fra andre prostatakreft observerte vi en kompleks
ETV1
trans involverer et kromosom 7 fragment som havner
ETV1 Hotell og fragmenter av kromosomer 4 og 10. Videre studier avslørte overekspresjon av flere forskjellige full-lengde-transkripter, som gir opphav til fire protein isoformene med forskjellige N-terminale regioner. Selv den korteste isoform syntetisert av full-lengde
ETV1
stimulert
in vitro
forankringsuavhengig vekst av PNT2C2 prostata celler. Dette står i kontrast til mangelen på aktivitet av enda kortere N-avkortet ETV1 produsert av fusion transkripsjoner. Våre funn som i klinisk prostatakreft overekspresjon av full-lengde
ETV1
skyldes at genomiske rearrangements involverer ulike kromosomer og identifisering av en forkortet biologisk aktiv ETV1 isoform er svært relevant for å forstå mekanismen av ETV1 funksjon i prostatakreft .
Citation: Gasi D, van der Korput HA, Douben HC, de Klein A, de Ridder CM, van Weerden WM, et al. (2011) Overuttrykte Full-Length
ETV1
transkripsjoner i klinisk prostatakreft grunn av Gene Trans. PLoS ONE 6 (1): e16332. doi: 10,1371 /journal.pone.0016332
Redaktør: Andrew Wilber, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 05.09.2010; Godkjent: 10 desember 2010; Publisert: 26 januar 2011
Copyright: © 2011 Gasi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en Marie Curie Grant (Cancure) gitt av EU. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
genfusjoner er viktige i utviklingen av mange hematologiske maligniteter og sarkomer, men er sjeldne i de fleste andre tumortyper [1]. Men de hyppige fusjon mellom
TMPRSS2 Hotell og ETS genet
ERG
viste at genet fusjon er et svært relevant hendelse i prostatakreft [2], [3]. Overekspresjon av
TMPRSS2-ERG
fusion genet har blitt rapportert i 40-70% av prostata kreft tilfeller [2] – [5]. Fusjoner av
TMPRSS2 Hotell og tre andre gener som koder for ETS transkripsjonsfaktorer,
ETV1
,
ETV4 Hotell og
ETV5
, som er plassert på forskjellige kromosomer, oppstår ved lav frekvens i prostatakreft [2], [6], [7]. Men for
ETV1
minst 10 ulike fusjonspartnerne er beskrevet [8] – [10]. De fleste av disse har til felles at, i likhet med
TMPRSS2
, er de prostataspesifikt og androgen-regulert uttrykt. Egenskapene til fusjonspartnere er sentrale elementer i å forklare androgen-regulert overekspresjon av en ETS onkogen i prostatakreft. Men en unik egenskap av
ETV1
er at den ikke bare kan overuttrykt i prostatakreft som en fusjon transkripsjon, men også som en full-lengde villtype transkripsjon.
Den store familien av ETS transkripsjonsfaktorer består av 27 medlemmer [11] – [13]. Alle medlemmer har til felles en meget homolog DNA-bindende domene, det ETS domene. De øvrige regionene i de fleste ETS proteiner viser begrenset strukturell homologi. ETV1, ETV4 og ETV5 er medlemmer av en liten familien av strukturelt beslektede ETS proteiner. Disse proteinene inneholder i det N-terminale område en konservert kort surt trans domene (TAD) som er fraværende i ERG. ETS proteiner regulere mange målgener som modulerer biologiske prosesser som cellevekst, angiogenese, migrasjon, spredning og differensiering. Men hvilke av de mange molekylære og biologiske funksjoner av ETS proteiner er viktigst i prostata kreft er ikke kjent.
Etter
ERG, er ETV1
den hyppigst overexpressed ETS-genet i prostatakreft ( ~ 10% av tumorene) [10]. Den ETV1 protein oversatt fra de fleste fusion transkripsjoner avkortes, mangler de 131 N-terminale aminosyrer (dETV1). Ca. halvparten av svulstene med
ETV1
overekspresjon uttrykke en fusjon avskrift, de andre viser en høy grad av full-lengde
ETV1
uttrykk.
in vitro
biologiske og molekylære egenskaper av dETV1 synes forskjellig fra de av full-lengde 477 aminosyreprotein [10]. Denne observasjonen antyder at svulster med overekspresjon av full-lengde ETV1 er forskjellig fra svulster uttrykker dETV1.
Lite er kjent om mekanismen av full-lengde
ETV1
overekspresjon og dens funksjon i klinisk prostatakreft . Våre nåværende resultater viser at overekspresjon av full-lengde
ETV1
er korrelert med omorganisering av
ETV1
kromosom regionen. Videre identifiserte vi en roman, N-avkortet
ETV1
isoform med samme aktivitet som i full lengde
ETV1
.
Diskusjon
Tidligere resultater og vi rapporterte
ETV1
overekspresjon i åtte av 84 prostatakreft prøver. I fire tilfeller ble forårsaket av et gen fusjon, i den andre fire full-lengde
ETV1
avskrift ble overexpressed [10]. I denne studien undersøkte vi overekspresjon av
ETV1
av kvantitativ revers transkriptase reaksjon (QPCR) i en roman kohort av 66 prostatakreft. I seks RNA
ETV1
overekspresjon ble oppdaget. Prøver G51, G59, G233, G270 og G268 ble avledet fra primære svulster og G210 ble avledet fra en tilbakevendende svulst. De seks prøvene ble ytterligere studert ved QPCR med primerpar i 5′-enden av
ETV1
mRNA (ekson 1F og ekson 4R) og ved 3′-enden av mRNA (ekson 11F og 12R ekson) (figur 1A). En høy ekson 11-12 til ekson 1-4 ratio er veiledende for en fusjon genet; en 1:01 ratio indikert overekspresjon av full-lengde
ETV1
mRNA. Basert på disse kriteriene, svulster G51, G59, G233 og G270 uttrykte full lengde
ETV1
mens G210 og G268 uttrykte en fusjon transkripsjon (se også styre PC374 som uttrykker
TMPRSS2-ETV1
).
HNRPA2B1-ETV1
ble funnet som fusjon transkripsjon i prøven G210 (data ikke vist); fusjon transkripsjon i G268 har ikke blitt identifisert ennå. Disse to prøvene ble ikke undersøkt videre i denne studien.
(A) QPCR på RNA fra kliniske prøver som viser
ETV1
overekspresjon. To primer-par ble benyttet for å bestemme
ETV1
uttrykk:
ETV1
ekson 1 fremover og exon 4 revers, og ekson 11 forover og ekson 12 revers, henholdsvis. Primer sekvenser er gitt i Utfyllende Tabell S1. Amplifiserte produkter ble kvantifisert i forhold til uttrykk for porphobilinogen deaminase (
PBGD
) husholdningsgenet. Data ble normalisert til full lengde
ETV1
uttrykt i xenograft PC135. En høy ekson 11/12 til ekson 1/4 ratio indikerer en
ETV1
fusjon hendelse, en 1-1 ratio indikerer overekspresjon av en full lengde
ETV1
transkripsjon. PC374 er en kontroll xenograft som uttrykker en
TMPRSS2-ETV1
fusjonsgenet. En representant eksperiment av de seks prøvene som viser
ETV1
overekspresjon er avbildet. (B) Interphase FISH på fersk frosne prostata kreft vevssnitt. BACS brukt er angitt under kromosom 7 regionen undersøkt. BAC RP11-124L22 (rød) spenn
ETV1 Hotell og RP11-1149J13 (grønn) lapper
DGKB plakater (venstre panel). Posisjonene til gener fra toppen av kromosom 7 er angitt i MBP. En splittet signal som representerer en
ETV1
trans er angitt med en pil. (C) Translokasjon av
ETV1
til kromosom 14 i tumor G270. Vevssnitt ble hybridisert med BAC RP11-460G19 (grønn) som overlapper
MIPOL1 Hotell og flankene
ETS14 Hotell og med
ETV1
BAC RP11-124L22 (red) (se B for detaljer). I venstre panel posisjonen
MIPOL1
BAC på kromosom 14 er indikert. I panelet til høyre en sammenslåing signal (gul) viser samlokalisering av
ETV1 Hotell og
MIPOL1 Twitter /
EST14
i G270, som indikert av pilen.
i de neste forsøkene vi fokusert på klarlegging av mekanismen av overekspresjon av full-lengde
ETV1
. Nylig har det vist seg at i to prostatakreft cellelinjer overekspresjon full lengde
ETV1
, LNCaP og MDA PCa2b,
ETV1
er translocated [8]. Vi adressert nå spørsmålet om i kliniske prøver trans av hele
ETV1
genet kan oppstå. For å oppdage genomiske rearrangements vev lysbilder av alle fire prostatakreft prøver med full lengde
ETV1
overekspresjon ble analysert ved innbrudd fra hverandre inter FISH med to merkede BAC sonder, en BAC anerkjent
ETV1
og andre en de flankerer genet
DGKB plakater (figur 1B). Serien ble supplert med to prøver husing full lengde
ETV1
overekspresjon fra vår forrige undersøkelse, G89 og G308 [10], som frosne vev av tilstrekkelig morfologisk kvalitet var tilgjengelige. Figur 1B viser resultatene av fisken eksperimenter. Interessant, fant vi delte signaler i alle prøvene bortsett fra G59, noe som indikerer hyppig
ETV1
rearrangements i prostata kreft som overuttrykker full-lengde
ETV1
. Fravær av en delt signal i G59 antyder fravær av trans, selv om vi ikke kan utelukke et stoppunkt utenfor undersøkt regionen. Dens observert høy frekvens indikerer genomisk omorganisering som en viktig mekanisme i full lengde
ETV1
overekspresjon i klinisk prostatakreft. Selvfølgelig, det kromosomale region som
ETV1
er translocated kan bidra til å belyse mekanismen av
ETV1
overekspresjon. Vi var i stand til å identifisere flere detaljer om rearrangements i prøvene G270 og G89.
Det har vært vist i LNCaP celler som
ETV1
er translocated til 14q13.3-q21.1. Hele genet er integrert i den siste intron i
MIPOL1
. I MDA PCa2b,
ETV1
er translocated til samme region, selv om den nøyaktige posisjon er ukjent [8]. Videre vi tidligere beskrevet innsetting av avkortet
ETV1
i intron av en to ekson gen som koder for et ncRNA, betegnet
EST14
, noe som gir opphav til en
EST14-ETV1
fusjon transkripsjon som inneholder
ETV1
exon 5-12 sekvenser (prøve G342 i ref 10,. Figur 2A). Viktigere,
EST14
kart direkte tilknytning til
MIPOL1
på 14q. Som de fleste
ETV1
fusjonspartnere,
EST14
er et androgen-regulert prostata-spesifikt gen. For å undersøke om det samme kromosom region var involvert i full lengde
ETV1
trans i vår romanen kohort, ble inter FISH utført med
ETV1
BAC (figur 1B) i kombinasjon med en
MIPOL1
BAC (figur 1C). En sammenslåing gul signal ble påvist i prøven G270 (figur 1C), men i ingen av de andre svulster. Disse dataene indikerer at selv om det synes en preferanse for kromosom 14q13.3-21.1, vil andre genomiske regioner også bidra til omorganisering og overekspresjon av full-lengde
ETV1
.
(A) Skjematisk framstilling av
ETV1 Anmeldelser –
EST14
fusion transkripsjoner i prostatakreft G270 og G342 (sample G342 er fra ref. 10). Pilene viser posisjonene av primerne anvendt i RT-PCR-eksperiment. Primer sekvenser er vist i Tilleggs Tabell S1. (B) Sekvens av smeltepunkt
EST14 Hotell og
ETV1
i prøven G270. Plasseringen av smeltepunkt i tumor G270 ble kartlagt av langtrekkende PCR på genomisk DNA med en skrå primer i
EST14
intron og revers primer oppstrøms
ETV1
exon 1. På fusjon punkt to T rester gikk tapt. Stoppunkt i
EST14
i G270 og G342 er indikert med piler.
Ytterligere informasjon fra
ETV1
omorganisering i G270 kom fra 5′-RACE svulst cDNA (data ikke vist). Bemerkelsesverdig, vi ikke bare oppdage som forventet full-lengde
ETV1
transkripsjon men også en fusjon transkripsjon (Figur 2A). Et slikt resultat ble ikke funnet på noen av de andre svulster overekspresjon full lengde
ETV1
. Sekvensering viste at fusjonstranskript i G270 var sammensatt av
ETV1
exon 1-12 innledes med den første ekson av
EST14 plakater (Figur 2A). Skanning av
EST14
intron og
ETV1
flankerende område av lang PCR og sekvensering kartlagt stoppunkter i G270 ~1.9 kbp oppstrøms
ETV1
ekson 1 og ~ 5 kbp nedstrøms
EST14
exon 1. stoppunkt i
EST14
er bare 180 bp bortsett fra stoppunkt i G342 (figur 2B og ref. 10).
Ytterligere informasjon av
ETV1
omorganisering ble også samlet inn for prøve G89. Tidligere en xenograft spredd på mannlige naken mus hadde blitt generert fra denne svulsten (PC135). Som svulst G89, PC135 overexpressed full lengde
ETV1 product: [3]. Tilgjengeligheten av xenograft tillatt utarbeidelse av metakromosom sprer seg. I flerfarget FISH et komplekst kromosom omorganisering mønster ble funnet (data ikke vist). Individuelle kromosom maling ble brukt til å validere flerfarget FISH data. Maling av kromosom 7 indikerte tilstedeværelse av multiple kromosom 7-fragmenter (figur 3). Hybridisering med en
ETV1
BAC identifisert tilstedeværelsen av tre genkopier: to i tilsynelatende normale kromosomer 7 og en i en kompleks markør kromosom. Oppfølgings eksperimenter viste at markøren kromosom inneholdt fragmenter av kromosomer 4, 7 og 10, som først angitt med flerfarget FISH (figur 3).
ETV1
BAC hybridisert i krysset av kromosom 7 og kromosom 4 fragment, sterkt tyder på at 4; 7 trans var instrumental i overekspresjon av
ETV1
. De nøyaktige posisjoner av de svake punktene i 4 og 7 gjenstår å bli bestemt. Våre data spår at flere kromosomale regioner er involvert i overekspresjon av full-lengde
ETV1
. I det minste ett av disse områdene er på kromosom 14 og en andre en på kromosom 4. kromosom 14-regionen er også involvert i
ETV1
genfusjon. Deep sekvenseringsteknologi kan være medvirkende til identifisering av andre
ETV1
rearrangements.
Maling av kromosomer 4, 7 og 10 er grønne og
ETV1
BAC (Figur 1b) er rød. Svarte piler indikerer translocated
ETV1
. I nedre panel relevant markør kromosomet er eske med rødt.
Detaljert karakterisering av full-lengde
ETV1
transkripsjoner i de ulike svulstene ved 5′-RACE og sekvensering viste at ikke bare
ETV1
exon 1- ekson 12 transkripsjoner var tilstede, men også flere andre full-lengde
ETV1
transkripsjoner, som følge av alternativ arrangøren bruk. Disse transkripsjoner ble betegnet som
ETV1
,
ETV1-1a
,
ETV1-1b Hotell og
ETV1-1c
. 4A og Supplerende Figur S1-show posisjonene av de forskjellige første exon i genet og angir de forskjellige ATG-start- kodon. Av både
ETV1-1a Hotell og
ETV1-1b
to spleisevarianter ble funnet (data ikke vist). QPCR eksperimenter ved hjelp av transkript-spesifikke primere for RNA fra alle seks kliniske prostatakreft prøver som overuttrykt
ETV1
viste at nivået av ekspresjon av de forskjellige transkriptene var variable i de forskjellige tumorer (se fig S2).
ETV1
ble knapt uttrykt i kontroll benign prostata hyperplasi prøve G277. Figur 4B viser skjematisk den antatte sammensetning av de forskjellige ETV1 protein isoformer som vil bli produsert. Merk at ETV1-1c er den desidert korteste, mangler de N-terminale 60 aminosyrer, inkludert store deler av den konserverte sure TAD. I dETV1 som er uttrykt ved de fleste fusjonsgen, N-termimal 131 aminosyrer er fraværende. ETV1, ETV1-1b1 og -1b2 var av samme størrelse, som vist i vestlige blotter av lysatene fra transfekterte HEK293T celler (figur 4B).
(A) Skjematisk fremstilling av organiseringen av
ETV1
genet. Alternative første eksoner er 1a, 1, 1b og 1c. Posisjonene av de fire forskjellige ATG-start- kodon, er angitt. Flere detaljer er gitt i Utfyllende Figur S1. (B) Skjematisk fremstilling av sammensetningen av forskjellige ETV1 proteiner og deres ekspresjon i transfekterte celler HEK293T. Forskjellige farger av N-terminale regioner indikerer en forskjellig aminosyresammensetning. dETV1 er den avkortede ETV1 protein som produseres av fusjonsgener. Dette proteinet er i stand til å indusere forankringsuavhengig vekst. I panelet til høyre vises en Western blot av ETV1 isoformer produsert av forbigående transfekterte HEK293T celler. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. (C) Soft-agar-analysen viser forankringsuavhengig vekst av PNT2C2 celler infisert med lentivirus uttrykker de ulike ETV1 isoformene eller kontrollere GFP. Stolpene representerer det midlere antall kolonier pr mikroskopfelt av tre uavhengige eksperimenter (± SD). Representative bilder av de fargede kolonier er vist nedenfor baren figuren.
Tidligere har vi vist at ETV1 og dETV1 skilte seg i stimulering av
in vitro
forankringsuavhengig vekst [10] . PNT2C2 celler infisert med alle nye ETV1 konstruksjoner induserte forankringsuavhengig vekst på lignende måte som ETV1 (figur 4C). Bemerkelsesverdig, ETV1-1c, selv om uttrykt på et lavere nivå og mye mindre, er så aktiv som de lengre ETV1 isoformer. Således, det fullstendige N-terminale TAD var ikke nødvendig, men aminosyrene 61-131 synes vesentlig for biologisk aktivitet av ETV1 (figur 4B, C).
I sammendrag, presenterte data viser to viktige nye aspekter ved rollen ETV1 i prostatakreft. For det første er det vist at i kliniske prostatacancere en undergruppe av ETV1 positive pasienter viser full-lengde
ETV1
overekspresjon på grunn av translokasjoner i hele genet til forskjellige kromosomer. Denne oppfinneriske observasjon utfyller vel beskrevne mekanisme av overekspresjon av avkortede ETV1 forårsaket av genfusjoner hvor ekspresjon reguleringen bestemmes av promotoren og enhancere av fusjonspartnere. For det andre, i motsetning til dETV1 produsert av genfusjoner, en kort isoform av full-lengde ETV1, ETV1-1c, mangler det meste av det N-terminale TAD, er like aktiv som lengre ETV1 isoformer, inneholdende det fullstendige N-terminale sure TAD. Dette funnet viser nøyaktig den forankrings-uavhengig vekst i et lite område som er fraværende i avkortede ETV1 uttrykt ved fusjonsgen.
Det er svært relevant for å utvide antall kliniske prøver for å kunne sammenligne tumorprogresjon hos de to undergrupper av prostatakreft viser overekspresjon av avkortet kontra full-lengde ETV1, og for å bestemme de molekylære mekanismene som er involvert i deres ulike biologiske oppførsel.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
bruk av prøvene ble godkjent av Erasmus MC Medical Ethics Committee i henhold til medisinsk forskning som omfatter mennesker handle i protokollen MEC-2004-261, med tittelen «bruk av humant normalt og kreft rest vev fra en vev bank for karakterisering av DNA, RNA og protein «.
Mus ble plassert i henhold til retningslinjene fra Erasmus Medical Centre, og prosedyrer ble utført i samsvar med standarder for bruk av forsøksdyr. Dyreforsøk, utført i dette manuskriptet er godkjent av dyret eksperimentelle komiteen av Erasmus Medical Centre (DEC-consult Erasmus MC prosjekt 102-10-01).
Vevsprøver, RNA og DNA
Snap-frosne prostatakreft ble oppnådd ved radikal prostatektomi eller transuretral reseksjon. Hematoksylin /eosin (HE) farget vevssnitt ble histologisk evaluert av en patolog (G. van Leenders). Alle prøver inneholdt minst 50% tumorceller.
RNA fra kliniske prøver ble isolert ved anvendelse av RNA Bee-(Campro Scientific, Berlin, Tyskland). DNA ble isolert ved hjelp av DNeasy DNA Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). RNA fra cellelinjer ble isolert ved anvendelse av RNeasy Extraction RNA-kit (Qiagen).
Stoppunkt kartlegging
Posisjonen av smeltepunkt i tumor 270 ble kartlagt av lang PCR på genomisk DNA ved å bruke en fremover primer i
EST14
intron og revers primer oppstrøms
ETV1
ekson 1. PCR produktene ble separert på en 1% agarosegel og sekvensert i en ABI 3100 genetisk analysator (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).
Q-PCR
mRNA uttrykk ble analysert ved QPCR. cDNA ble utarbeidet med MMLV-RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og oligo (dT) 12 primer. QPCR ble utført i kraft SYBR Grønn PCR Master Mix på en ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Amplifiserte produkter ble kvantifisert i forhold til porphobilinogen deaminase (
PBGD
) av standardkurven metoden. For primere se tabell S1.
RNA ligase-mediert rask forsterkning av cDNA ender
5′-RLM-RACE ble utført ved hjelp av GeneRacer kit av Invitrogen. cDNA ble amplifisert ved hjelp av GeneRacer 5′-primer og en revers-gen-spesifikke primer (ETV1 exon 6). PCR produktene ble analysert på en 1,5% agarosegel, og båndene ble skåret ut, renset og sekvensert.
Fluorescence
in situ
hybridisering
FISH ble gjort på 5-mikrometer frosne vevssnitt ifølge standard protokoller med mindre modifikasjoner [14]. BAC kloner RP11-124L22 (
ETV1
), RP11-460G19 (
MIPOL1
), RP11-1149J13 (
DGKB
) ble kjøpt fra BacPac Resources (bacpac.chori. org). BACS var enten digoxigenin-11-dUTP eller biotin-16-dUTP (Roche, Basel, Schweiz) merket og visualisert med anti-digoxigenin FITC (Roche) eller streptavidin-Alexa 594 (Invitrogen). Vevssnitt ble kontra med DAPI. Bilder ble samlet inn på en epifluorescence mikroskop (Leica DM, Wetzlar, Tyskland) er utstyrt med en CCD avkjølt kamera (fotometriske, Tuscon, Arizona, USA).
For utarbeidelse av metafase sprer seg, xenograft PC135 ble spredd på mannlige nakne mus. Enkeltceller ble samlet ved hakking og filtrering. Metafase forberedelse og hybridisering ble i det vesentlige som beskrevet [14]. Kromosom maling 4, 7 og 10 var fra Euro-Diagnostica (Malmö, Sverige). Meta ble analysert med en Axioplan to Imaging mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) og bildene ble tatt med Isis programvare (MetaSystems, Altiussheim, Tyskland).
Ekspresjonsplasmider
cDNA av de ulike ETV1 isoformer ble PCR forsterket og klonet inn pGEM-TEasy (Promega). Setter inn ble sekvensen verifisert og klonet inn i pcDNA3 ekspresjonsvektor (Invitrogen) eller lenti-viral vektor pWPXLd (Didier Trono, Universitetet i Geneve).
Western blot analyse
For Western blot analyse, HEK293T-celler ble transfektert med de forskjellige pcDNA3-ETV1 ekspresjonskonstruksjoner ved hjelp av kalsiumfosfat-utfellingsmetoden. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon. Western blot analyse ble utført ved bruk av standard prosedyrer med antistoff rettet mot den ETV1 C-terminalen (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA). p-aktin ble brukt som lastekontroll (Sigma, St. Louis, MO, USA). Proteinene ble visualisert ved chemiluminescence (Pierce, Rockford, IL, USA).
Lentiviral infeksjoner
HEK293T celler ble transfektert med pWPXLd-ETV1 ekspresjonsvektorer, eller pWPXLd-GFP (kontroll), og pPAX2 og pMD2.G (Trono) ved anvendelse av kalsiumfosfat-utfellingsmetoden. Virus ble høstet fra supernatanten og anvendt for infeksjon av PNT2C2 celler. Bassenger av infiserte celler ble formert.
myk-agar assay
Et lag av 0,6% lavtsmeltende agarose i standard kulturmedium ble fremstilt i seks-brønns plater. På toppen, et lag av 0,3% agarose inneholdende 1 x 10
4 PNT2C2 celler infisert med forskjellige ETV1 uttrykker virus eller kontroll PNT2C2-GFP-celler ble sådd ut. På dag 14 ble cellene farget med krystallfiolett og kolonier ble talt opp.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
del av genomisk sekvens av
ETV1
. De ulike eksoner er merket med gult. Oversettelse startkodonene er understreket. Legg merke til at transkript som starter ved exon 1a kan eller kan ikke inkludere exon 1A1 men translasjonsstartsetet er den samme som for den transkript som starter ved exon 1. Enden av ekson 1B1 er angitt i rødt.
ETV1
transkripsjoner starter på ekson 1c mangel eksoner 1, 2 og 3, som resulterer i en forkortet TAD i den oversatte protein
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016332.s001 plakater (DOC)
Figur S2.
Uttrykk for de forskjellige
ETV1
transkripsjoner ble bestemt av QPCR i 7900HT Fast Real-Time PCR system fra Applied Biosystems bruke kraften SYBR-grønn mester mix (Applied Biosystems). Expression nivåer står i forhold til husholdningsgenet
PBGD
.
ETV1 Hotell og
PBGD
primere er oppført i Tilleggs Tabell S1. Eksempel G277 er en BPH. Den har svært lav eller ingen uttrykk for alle de forskjellige
ETV1
transkripsjoner. Prøver G51, G59, G89, G233, G270 og G308 alle overuttrykker
ETV1
De ulike transkripsjoner er uttrykt i variable nivåer
doi:.. 10,1371 /journal.pone.0016332.s002 plakater (TIF )
Tabell S1.
Primer sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016332.s003 plakater (TIF)
