Abstract
Over-aktivering av signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon 3 (Stat3) sti i lunge alveolar type II (AT II) epitelceller induserer kronisk betennelse og adenokarsinom i lungen av CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C bitransgenic mus. En av Stat3 nedstrøms gener produkter, kitinase tre-lignende en (CHI3L1) protein, viste økt konsentrasjon i begge bronchioalveolar lavage væske (Balf) og blod doksycyklin behandlet CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C bitransgenic mus. Når testet i andre betennelses-indusert lungecancer musemodeller ble CHI3L1 proteinkonsentrasjonen også sterkt øket i Balf og blod av disse modellene med svulster. Immunhistokjemisk farging viste sterk farging av CHI3L1 protein rundt tumor områder i disse musemodeller. Analyse av normale objekter og lungekreftpasienter viste en signifikant økning av CHI3L1 proteinkonsentrasjonen i humane serumprøver fra alle kategorier av lungekrefttilfellene. Videre rekombinant CHI3L protein stimulerte proliferasjon og vekst av Lewis lungekreft celler. Derfor spiller sekretoriske CHI3L1 en viktig rolle i inflammasjon-indusert lungecancer dannelse og potensielt tjene som en biomarkør for lungekreft forutsigelse. Basert på vår forrige publisering og dette arbeidet, er dette den første dyrestudie knytte overekspresjon av CHI3L1 til ulike lunge svulst musemodeller. Disse modellene vil lette identifiseringen av flere biomarkører for å forutsi og kontrollere lungekreft under ulike patogene forhold, som normalt ikke kan gjøres hos mennesker
Citation. Yan C, Ding X, Wu L, Yu M, Qu P, du H (2013) Stat3 Nedstrøms Gene Vare Chitinase 3-Like 1 er en potensiell Biomarker av Betennelse-indusert lungekreft i flere Mouse Lung tumormodeller og mennesker. PLoS ONE 8 (4): e61984. doi: 10,1371 /journal.pone.0061984
Redaktør: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina
mottatt: 12 november 2012; Godkjent: 16 mars 2013; Publisert: 22 april 2013
Copyright: © 2013 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av NIH CA138759, CA152099 (C. Yan) og HL087001 (H. Du). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den mest dødelige årsaken i menneskelig kreft befolkning. De fem års overlevelse er bare ca 15%. Det er et presserende behov for å identifisere biomarkører som kan brukes til å forutsi lungekreft forekomst. Nylig demonstrerte vi at både lunge epitelcellelinje-initiert regional betennelse og myeloid celle-initiert systemisk inflammasjon kan forårsake spontane lungetumordannelse i multiple lungetumor dyremodeller [1], [2], [3], [4], [5] Dette indikerer at inflammatoriske molekyler er potensielt nyttige for lungekreft forutsigelse. Disse betennelse-indusert lungetumordyremodeller er ideelle og verdifulle systemer for identifisering og verifisering av lungekreft biomarkører. Under den patogene prosessen med kronisk betennelse og lungetumordannelse i disse dyremodeller, er et felles trekk Stat3 overaktivering hos pasienter med inflammatorisk myeloid avledet undertrykkende celler (MDSCs) og lunge epitelceller, hvilket antyder at Stat3 spiller en kritisk rolle i inflammasjon-indusert lunge tumorigenesis . Faktisk, når en konstitutiv aktiv form av Stat3C er overuttrykt i alveolar type II epitelceller, induserer det nedstrøms inflammatoriske gener. Deretter opp-regulering av disse inflammatoriske molekyler stimulerer og rekrutterer inflammatoriske celler (slik MDSCs) i lungen for å danne et inflammatorisk miljø. Vedvarende tilstedeværelsen av disse betennelsesceller forenkler spontan adenokarsinom i lungene av CCSP-rtTA- /(Teto)
7Stat3C bitransgenic mus [1], [6].
Basert på disse observasjonene, hypotese vi at Stat3 nedstrøms gener tjene som potensielle biomarkører for inflammasjon-indusert lungekreft prediksjon. Affymetrix Genechip microarray analyse viser rundt 800 Stat3 nedstrøms gener i lungen av CCSP-rtTA- /(Teto)
7Stat3C bitransgenic mus som vi rapporterte tidligere [1]. Når de ble testet i dyr og mennesker, kan noen av disse genene kan brukes som biomarkører for lungekreft [1], [7]. Siden de fleste av disse genene er intracellulære proteiner, er det vanskelig å bruke dem i den hensikt å klinisk diagnose og prognose uten å gå gjennom biopsi. Derfor er det et behov for å identifisere oppløselige og sekretoriske proteiner som biomarkører i serum eller bronchioalveolar vaskevæske (Balf) prøver for lungekreft prediksjon og verifisering. Her rapporterer vi at sekresjonsprotein Chitinase 3-Like 1 (CHI3L1), en Stat3 nedstrøms genprodukt, er en potensiell biomarkør for lungekreft prediksjon i ulike dyretumormodeller og mennesker.
Metoder
Animal Care
Alle vitenskapelige protokoller som involverer bruk av dyr har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Indiana University School of Medicine og fulgt retningslinjer fastsatt av Panel on Avliving av American Veterinary Medical Association. Protokoller som involverer bruk av rekombinant DNA eller biologisk skadelige materialer har blitt godkjent av biosikkerhet Committee of Indiana University School of Medicine og fulgt retningslinjene fastsatt av National Institutes of Health. Dyrene ble plassert under (IACUC) -godkjent forholdene på en sikker Dyreavdelingen ved Indiana University School of Medicine. Alle celle-spesifikke transgene mus som har blitt beskrevet tidligere [1], [2], [3], [4], [5].
ELISA
For museserum samling, abdominal hulrom doksycyklin-behandlet eller ubehandlet CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3, CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-MMP12, CCSP-rtTA- /(Teto)
7 -CMV-Api6, C-FMS-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Api6 og c-FMS-rtTA- /(Teto)
7-CMV-MMP12 bitransgenic mus ble åpnet etter bedøvelse med trippel beroligende etter intraperitoneal (IP) injeksjon. Museblodprøver ble samlet inn fra indre vena cava (IVC). Sera ble separert ved sentrifugering ved 1500 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. For bronchioalveolar lavage væske (Balf) samling, ble luftrøret isolert og kanylert med en 20 gauge luer spire adapter. Anvendelse av en 1 ml sprøyte, ble bronchioalveolar vaskevæske (Balf) oppsamlet ved perfusert lungen med 1 ml alikvot av 0,9% natriumklorid og trekke seg tilbake væsker. BAL væsker ble sentrifugert i 5 minutter ved 1000 rpm og 4 ° C for å fjerne celle-pellets. CHI3L1 konsentrasjoner i mus og humant serum (50-100 mL) ble bestemt ved Mouse Chitinase tre-lignende en Quantikine ELISA Kit and Human Chitinase tre-lignende en Quantikine ELISA kits i henhold til produsentens instruksjoner (R D Systems, Minneapolis, MN) . Den humane serumprøver av vanlige objekter og lungekreftpasienter ble hentet fra Biosample Repository Kjerne Facility (BRCF) av Fox Chase Cancer Center i Philadelphia (støttet av NCI). Den humane serumprøver ble fortynnet til 1:100 før analysen.
Western blotting
For Stat3C-Flag fusjonsprotein deteksjon, CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3 bitransgenic mus ble bedøvet og lungene ble fjernet og homogenisert i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer. Lunge Lysatene (10 ug) ble fraksjonert på en Novex® 4-20% Tris-Glycine Mini-gel (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter overføring til polyvinylidendifluorid-membran (Bio-Rad, Hercules, CA), ble membranen blottet med 5% fettfri tørrmelk PBS og hybridisert med kanin-anti-Flag-antistoff (Sigma, St. Louis, MO). Etter inkubering med sekundært antistoff ble proteinene detektert med kjemiluminescerende substrat (SuperSignal, Rockford, IL). For CHI3L1 proteinpåvisning, BALFs fra doksycyklin-behandlet eller ubehandlet ccsp-rtTA /(Teto)
7-CMV-STAT3 bitransgenic mus ble samlet opp som beskrevet ovenfor og fortynnet med Laemmli-prøvebuffer (Bio-Rad, Hercules, CA) ved 01:01, deretter oppvarmet i kokende vann i 5 min. Gelelektroforese og antistoff-hybridisering ble utført ved å følge den samme fremgangsmåte som ovenfor, bortsett fra at rotte-anti-mus ChI3L1 primære antistoff (1:1,000, R R 0,05. Konfidensintervall (CIS) ble også konstruert for alle estimater. For ROC analyse når AUC er en, har 95% CI både nedre og øvre grenser av 1, fordi AUC = 1 tilsvarer total separasjon av to grupper av CHI3L1 og CI-konstruksjonen er basert på bootstrap prosedyren.
Resultater
Western blot analyse av CHI3L1 Expression i Balf av CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C Mus
Som vi rapporterte tidligere, CCSP-rtTA- /( Teto)
7-CMV-Stat3C mus er en spontan lungetumor dyremodell. I denne modellen, Stat3C-Flag-fusjonsprotein var sterkt induserbar av doksycyklin behandling (figur 1A), noe som bekreftet vår tidligere observasjon ved immunhistokjemisk farging i lungen [1]. Induksjon av Stat3C indusert nedstrømsgener (inkludert CHI3L1), lungebetennelse og adenokarsinom [1], [6]. For å teste om CHI3L1 er en sekretorisk protein i denne musemodell, ble utført Western blot analyse i Balf av CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C mus. Som vist i figur 1, den CHI3L1 protein ekspresjonsnivået var detekterbar i Balf av doksycyklin, ubehandlede mus (-DOX, Felt 1, 2 og 3) som en bånd ved 39 kDa molekylvekt. Til sammenligning ble det CHI3L1 proteinekspresjon nivået øket i en av tre doksycyklin-behandlede mus uten tumor (+ DOX, spor 5), som indikerer at CHI3L1 ekspresjon ble hevet før tumordannelse, og i alt fire doksycyklin-behandlede ccsp-rtTA /(Teto)
7-CMV-Stat3C mus med tumor (lungekreft, baner 7, 8, 9 og 10).
A) uttrykk for Stat3C-Flag i hele lungen av CCSP-rtTA- /(Teto) 7-CMV-Stat3C dobbelttransgene mus. Aktin ble anvendt som kontroll. WT: villtype mus lungene; -Dox: Doxycycline ubehandlede Bouble transgene mus lungene; + Dox1 + Dox2: doksycyklin behandlet mus lungene. B) Expression of CHI3L1 protein i Balf av CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C dobbelttransgene mus. Lane 1-3, doxycycline-ubehandlet mus (Dox-); Lane 4-6, doxycycline-behandlede mus uten å vise lungesvulst (Dox +); Lane 7-10, doxycycline-behandlede mus viser lunge svulst (lungekreft).
CHI3L1 proteinkonsentrasjonen i Balf og Serum fra CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C Mus
for mer kvantitativ analyse og nøyaktig anslag, ble ELISA brukes til å bestemme CHI3L1 konsentrasjonen i Balf av villtype, doksycyklin-ubehandlet, behandlet uten tumor, og behandlet med tumor CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C mus. Den gjennomsnittlige CHI3L1 konsentrasjonen var 8,3 ± 6,4 ng /ml i villtype mus, 8.8 ± 10 ng /ml i doksycyklin-ubehandlet CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C mus. Til sammenligning ble den gjennomsnittlige CHI3L1 konsentrasjonen øket mer enn 11 ganger (100,0 ± 49,0 ng /ml, p 0,001) i doksycyklin-behandlede mus uten tumor, noe som ytterligere støtter som CHI3L1 ekspresjon ble hevet før tumordannelse, og ble økt mer enn 17 ganger (151,8 ± 67,3 ng /ml, p 0,001) i doxycycline-behandlede mus med tumor (figur 2, øvre panel). AUCene til ROC kurver er en (95% CI: 1-1, p 0,001) for kresne doxycycline-behandlede mus med tumor vs doxycycline-ubehandlet mus, en (95% CI: 1-1, p 0,001) for doxycycline-behandlede mus uten tumor vs doxycycline-ubehandlet mus og 0,74 (95% KI: 0,56 til 0,93, p = 0,1). for doxycycline-behandlede mus med tumor vs. doksycyklin-behandlede mus uten tumor
Venstre: CHI3L1 protein konsentrasjoner i Balf og serum av doxycycline-behandlede og ubehandlede bitransgenic mus. Høyre: ROC (Receiver Operating Karakteristisk) kurve analyser for å bestemme arealet under kurven (AUC). Dox-: doxycycline-ubehandlet mus; Dox +: doxycycline-behandlede mus uten å vise lunge svulst; Kreft, doksycyklin-behandlede mus med lunge svulst. Mean ± SD i Balf (n 13), DOX -: 8,8 ± 10,0, DOX +: 100,0 ± 49,0, kreft: 151,8 ± 67,3. Mean ± SD i serum (n 13), DOX -: 6,2 ± 3,7, DOX +: 33,5 ± 35,6, kreft: 159,0 ± 90,0. De grå linjene representerer gjennomsnittsverdiene.
Vi testet CHI3L1 konsentrasjonen i blodet videre. Sammenlignet med doksycyklin-ubehandlede mus (6,2 ± 3,7 ng /ml), ble det gjennomsnittlige CHI3L1 konsentrasjonen øket mer enn 5 ganger (33,5 ± 35,6 ng /ml, p 0,001) i doxycycline-behandlede mus uten tumor (før tumordannelse ), og ble økt mer enn 26 ganger (159,0 ± 90,0 ng /ml, p 0,001) i doxycycline-behandlede mus med tumor (figur 2, nedre panel). AUCene til ROC kurver er 0,95 (95% KI: 0,87 til 1, p 0,001) for kresne doxycycline-behandlede mus med tumor vs. doksycyklin behandlet uten tumor mus, en (95% CI: 1-1, p 0,001) for doxycycline-behandlede mus med tumor vs doxycycline-ubehandlet mus, og 0,89 (95% KI: 0,77 til 1, p 0,001) for doxycycline-behandlede mus uten tumor vs doxycycline-ubehandlet mus. Dette resultatet viser klart at økning av CHI3L1 proteinkonsentrasjon i Balf og blod er forbundet med Stat3C-indusert inflammasjon og lungetumor. Det virker som CHI3L1 protein økningen skjedde før spontan lungetumordannelse i CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C musemodell, fungerer derfor potensielt som biomarkører.
CHI3L1 proteinkonsentrasjonen i Balf og Serum fra Regional Betennelse-indusert lungetumor dyremodeller
for å teste om sekretorisk CHI3L1 protein er oppregulert i en bredere anvendelse, ble andre betennelses-indusert spontan lungetumor musemodeller testet. Matriksmetalloproteinase 12 (MMP12) er en røyking-indusert matriksmetalloproteinase. Over-ekspresjon av MMP12 i lunge alveolar type II epitelceller indusert lokal inflammasjon, emfysem og lungetumor [3]. I CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-MMP12 spontan lungetumor musemodell, gjennomsnittlig CHI3L1 konsentrasjon i Balf av doxycycline-behandlede mus med tumor ble tre ganger høyere (159,7 ± 22,4 ng /ml) sammenliknet med det i Balf av doxycycline-ubehandlet mus (49,6 ± 22,8 ng /ml, p 0,001, figur 3A, øvre venstre panel). Det var ingen signifikant forskjell mellom doxycyclin-behandlede mus uten tumor (49,4 ± 18,1 ng /ml, p = 0,954) og doxycyclin, ubehandlede mus. Et lignende resultat ble observert i serum fra MMP12-indusert tumor-mus (figur 3A, nedre, venstre panel). ROC-analyse indikerte imponerende evne CHI3L1 konsentrasjon i diskriminerende tumoren gruppe med den ikke-tumor gruppe og doksycyklin-ubehandlede gruppen. AUC er en (95% CI: 1-1, p 0,001) i doksycyklin gruppen behandlet med tumor vs. behandlede gruppen uten tumor og i doksycyklin gruppen behandlet med tumor vs. doksycyklin-ubehandlet gruppe, og 0,52 (95% KI: 0,29 til 0,75, p = 0,46) i doksycyklin-behandlede gruppen uten tumor vs. dxycycline-ubehandlede gruppen (figur 3A, panel øverst til høyre). Et lignende resultat ble observert i serum fra ccsp-rtTA /(Teto)
7-CMV-MMP12 spontane lungetumor musemodell (figur 3A, høyre panel lavere)
Venstre:. CHI3L1 proteinkonsentrasjoner i Balf og serum av doxycycline-behandlede og ubehandlede bitransgenic mus. Høyre: ROC (Receiver Operating Karakteristisk) kurve analyser for å bestemme arealet under kurven (AUC). Dox-: doxycycline-ubehandlet mus; Dox +: doxycycline-behandlede mus uten å vise lunge svulst; Kreft, doksycyklin-behandlede mus med lunge svulst. A) CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-MMP12 mus. Mean ± SD i Balf (n 7), DOX -: 49,6 ± 22,8, DOX +: 49,4 ± 18,1, kreft: 159,7 ± 22,4. Mean ± SD i serum (n 7), DOX -: 18.6 ± 10.9, DOX +: 18,2 ± 4,6, kreft: 61,4 ± 33,5. De grå linjene representerer gjennomsnittsverdiene; B) CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Api6 mus. Mean ± SD i Balf (n 3), DOX -: 82,4 ± 37,1, DOX +: 93,8 ± 23,0, kreft: 409,8 ± 49,2. Mean ± SD i serum (n 3), DOX -: 14,0 ± 7,2, DOX +: 30,7 ± 43,1, kreft: 295,2 ± 194,0. De grå linjene representerer gjennomsnittsverdiene.
apoptose hemmer 6 (Api6) er en annen pro-inflammatorisk molekyl som induserer inflammasjon og lunge svulst når over-uttrykt i lunge alveolar type II epitelceller [5]. I ccsp-rtTA /(Teto)
7-CMV-Api6 spontane lungetumor musemodell, den gjennomsnittlige CHI3L1 konsentrasjon i Balf av doxycycline-behandlede mus med tumor ble 409,8 ± 49,2 ng /ml, sammenlignet med det i Balf av doksycyklin-ubehandlet mus (82,4 ± 37,1 ng /ml, p 0,001, 3B, øvre venstre panel). På samme måte var det ingen signifikant forskjell mellom doxycyclin-behandlede mus uten tumor (93,8 ± 23,9 ng /ml, p = 0,364) og doxycyclin, ubehandlede mus. Et lignende resultat ble også observert i serum hos Api6-indusert tumor mus (figur 3B, nedre venstre panel). AUC fra ROC-analyse er en (95% CI: 1-1, p 0,001) i doksycyklin gruppen behandlet med tumor vs. doksycyklin-behandlede gruppen uten tumor og i doksycyklin gruppen behandlet med tumor vs. doksycyklin-ubehandlet gruppe og 0,68 (95% KI: 0,45 til 0,90, p = 0,22) i doksycyklin-behandlede gruppen uten tumor vs. doksycyklin-ubehandlede gruppen (figur 3B, panel øverst til høyre). Et lignende resultat ble også observert i serum fra ccsp-rtTA /(Teto)
7-CMV-Api6 spontane lungetumor musemodell, figur 3B, høyre panel lavere).
CHI3L1 proteinkonsentrasjon i Balf og Serum av systemisk inflammasjon-indusert lungetumor dyremodeller
i motsetning til lunge regionale inflammatoriske dyremodeller, når MMP12 eller Api6 var over-uttrykt i myeloide celler, systemisk inflammasjon er initiert fra misdannelse og funksjonsfeil myelopoiesis fra beinmarg. Lungetumordannelse ble observert i både MMP12 og Api6 bitransgenic musemodeller [2], [4]. Dette representerer en annen cellulær mekanisme for lungekreft formasjonen. I C-FMS-rtTA /(Teto)
7-CMV-MMP12 spontane lungetumor musemodell, den gjennomsnittlige CHI3L1 konsentrasjon i Balf av doxycycline-behandlede mus med tumor (70,9 ± 36,5 ng /ml) ble 4-fold øke i forhold til at det i Balf av doksycyklin-ubehandlet mus (17,7 ± 13,8 ng /ml, p = 0,027, 4A, øvre venstre panel). Doksycyklin-behandlede mus uten tumor (42,1 ± 67,9 ng /ml, p = 0,043, figur 4 A) viste også den økte CHI3L1 konsentrasjon sammenlignet med doxycyclin, ubehandlede mus. Et lignende resultat ble observert i serum fra c-fms-rtTA /(Teto)
7-CMV-MMP12 spontane lungetumor musemodell med tumor (figur 4, nedre venstre panel), hvori den gjennomsnittlige CHI3L1 konsentrasjonen var mer enn 6 ganger høyere hos kreft mus enn for doxycycline-ubehandlet kontroll mus. AUC fra ROC analyse var 0,82 (95% KI, 0,62 til 1, p = 0,05) i doksycyklin gruppen behandlet med tumor vs. doksycyklin-behandlede gruppen uten tumor, 0,94 (95% KI, 0,82 til 1, p 0,001 ) i doksycyklin gruppen behandlet med tumor vs. doksycyklin-ubehandlet gruppe, og 0,45 (95% KI, 0,17 til 0,73, p = 0,57) i doksycyklin-behandlede gruppen uten tumor vs. doksycyklin-ubehandlede gruppen (Figur 4A, panel øverst til høyre ). Lignende resultater ble observert for serumprøver av c-fms-rtTA /(Teto)
7-CMV-MMP12 spontane lungetumor musemodell (figur 4A, panel nederst til høyre)
Tv:. CHI3L1 proteinkonsentrasjoner i Balf og serum av doxycycline-behandlede og ubehandlede bitransgenic mus. Høyre: ROC (Receiver Operating Karakteristisk) kurve analyser for å bestemme arealet under kurven (AUC). Dox-: doxycycline-ubehandlet mus; Dox +: doxycycline-behandlede mus uten å vise lunge svulst; Kreft, doksycyklin-behandlede mus med lunge svulst. A) c-FMS-rtTA- /(Teto)
7-CMV-MMP12 mus. Mean ± SD i Balf (n 7), DOX -: 17.7 ± 13.8, DOX +: 42,1 ± 67,9, kreft: 70,9 ± 36,5. Mean ± SD i serum (n 7), DOX -: 39,1 ± 25,6, DOX +: 57,7 ± 55,5, kreft: 232,3 ± 110,6. De grå linjene representerer gjennomsnittsverdiene; B) c-FMS-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Api6 mus. Mean ± SD i Balf (n 6), DOX -: 69,6 ± 16,6, DOX +: 73,2 ± 28,1, kreft: 189,9 ± 47,2. Mean ± SD i serum (n 6), DOX -: 25,2 ± 7,3, DOX +: 21,0 ± 11,7, kreft: 69,5 ± 19,1. De grå linjene representerer gjennomsnittsverdiene.
I C-FMS-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Api6 spontan lungetumor musemodell, gjennomsnittlig CHI3L1 konsentrasjon i Balf av doksycyklin behandlede mus med tumor (189,6 ± 47,2 ng /ml) var ~3 ganger høyere enn i Balf av doksycyklin-ubehandlet mus (69,6 ± 16,6 pg /ml, p = 0,002, 4B, øvre venstre panel). På samme måte var det ingen signifikant forskjell mellom doxycyclin-behandlede mus uten tumor (73,2 ± 28,1 ng /ml, p 0,001) og doxycyclin, ubehandlede mus. Et lignende resultat ble også observert i serum fra Api6-induserte tumor-mus (figur 4B, nedre venstre panel), hvori den gjennomsnittlige CHI3L1 konsentrasjonen var 3 ganger høyere i tumor mus enn for doxycyclin, ubehandlede kontrollmus. AUC fra ROC-analyse er en i doksycyklin gruppen behandlet med tumor vs. doksycyklin-behandlede gruppen uten tumor, en i doksycyklin gruppen behandlet med tumor vs. doksycyklin-ubehandlet gruppe, og 0,6 (95% KI, 0,34 til 0,86, p = 0,35) i doksycyklin-behandlede gruppen uten tumor vs. ubehandlet gruppe (figur 4B, panel øverst til høyre). Lignende resultater ble observert for serumprøver av c-fms-rtTA /(Teto)
7-CMV-Api6 spontane lungetumor musemodell (figur 4B, høyre panel lavere).
Lung immunohistologi
det er viktig å lokalisere hvor CHI3L1 er uttrykt i lungen av ovennevnte spontane lungetumormusemodeller. Lunge vevssnitt fra doxycycline-ubehandlede mus, -behandlet uten svulst, og -behandlet med tumor mus ble immunhistokjemisk farget med anti-CHI3L1 antistoff. I doxycycline-ubehandlede ccsp-rtTA /(Teto)
7-CMV-Stat3C mus, CHI3L1 var hovedsakelig uttrykt i epitelceller langs de ledende luftveier (figur 5 A a), distale bronchiolar epitelceller (figur 5A b), og alveolar type II-epitelceller (figur 5 A c) (røde piler). CHI3L1 ble også uttrykt i alveolære makrofager. I doksycyklin behandlet CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C mus når betennelsen ble indusert men uten tumor utseende, noen områder viste vev remodellering (figur 5A e) og emfysem (figur 5A f). Nesten alle infiltrert makrofager ble farget positivt med CHI3L1 (figur 5A e, grønn pil). I doksycyklin behandlet CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C mus med tumor utseende, ble CHI3L1 uttrykk påvist i kreftceller og omkringliggende makrofager (figur 5A g, h, i). Ko-lokalisering av CHI3L1 i alveolære makrofager ble ytterligere bekreftet i lungen av doksycyklin-behandlede bitransgenic mus med anti-CHI3L1 og anti-F4 /80-antistoffer i immunofluorescerende farging. Et representativt resultat fra ccsp-rtTA /(Teto)
7-CMV-Stat3C mus ble presentert i figur 6.
A) Immunohistokjemisk farging i lungene hos doksycyklin-behandlet eller ubehandlet ccsp-rtTA /( Teto)
7-CMV-Stat3C mus; B) Immunhistokjemisk farging av tumor regioner i lungene av doksycyklin behandlet CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-MMP12 mus, c-FMS-rtTA- /(Teto)
7-CMV-MMP12 mus, og c-FMS-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Api6 mus. -Dox: Doxycycline-ubehandlet mus; + Dox. Doxycycline-behandlede mus
CCSP-rtTA- /(Teto)
7-CMV-Stat3C bitransgenic mus ble behandlet (+ DOX) eller ubehandlet (-DOX) med doksycyklin. Immunofluorescerende farging av lungeseksjoner ble utført ved anvendelse av anti-CHI3L1 og F4 /80 antistoffer. Ko-lokalisering av både farging ble observert i det fusjonerte bildet. Bar representerer 20 mikrometer.
Disse observasjonene var stort sett repeterbare i andre MMP12 og Api6-indusert spontan lungetumor musemodeller. Uavhengig av lungetumor initiert fra alveolar type II celler eller myeloidceller, CHI3L1 var over-uttrykt i tumorceller av disse MMP12 og Api6-induserte spontane lungetumormusemodeller. Makrofager som omgir emfysem (figur 5B c, g, k) og tumorceller (figur 5B b, e, f, i) ble også intenst farget med anti-CHI3L1 antistoff (grønn pil). Dette kan forklare hvorfor CHI3L1 konsentrasjonen var høyere i både Balf og blod av tumor mus.
CHI3L1 Stimulering på kreftceller
For å teste om CHI3L1 besitter stimulerende effekt på lunge kreftceller, rekombinant CHI3L1 -GST fusjonsprotein og GST protein var forberedt og renset fra bakterier (figur 7A). Rekombinant CHI3L1-GST-fusjonsprotein eller kontroll GST-protein ble inkubert med LLC celler. CHI3L1-GST-fusjonsprotein signifikant stimulert cancer celleproliferasjon sammenlignet med den for kontroll GST-protein (figur 7B). Den apoptotiske aktivitet av CHI3L1-GST-fusjonsprotein behandlede LLC celler ble redusert sammenlignet med den for kontroll GST-protein (figur 7C). Dette støtter et konsept som CHI3L1 stimulerer lungekreft spredning og vekst
A) Purity av rekombinant CHI3L1-Flag fusjonsprotein (øvre pil).; B) LLC celleproliferasjon behandlet med GST eller CHI3L1-GST fusjonsprotein; C) Den apoptotiske aktivitet av LLC celler behandlet med GST eller CHI3L1-GST-fusjonsprotein av Annexin V merkingsassay. *, P 0,05, **, P . 0,01
CHI3L1 proteinkonsentrasjonen i serum fra humane lungekreft
Siden CHI3L1 proteinkonsentrasjonen korrelerer meget godt med svulst forekomst i både regional betennelse og systemiske inflammasjons initiert spontan lungetumor musemodeller, er det interessant å finne ut om denne observasjonen kan gjentas hos mennesker. Omtrent 30 serumprøver fra humane pasienter med lunge adenokarsinom, lunge-skvamøs karsinom og lunge liten celle kreft ble testet ved hjelp av ELISA. Sammenlignet med humane serumprøver uten kreft (normal), ble CHI3L1 proteinkonsentrasjonen signifikant forhøyet i humane serumprøver fra alle kategorier av lungekreftpasienter (Figur 8, øvre panel). AUC er 0,83 (95% konfidensintervall, 0,69 til 0,92, P = 0,005) for adenokarsinom vs Control, 0,87 (95% konfidensintervall, 0,77 til 0,97, P 0,001) for plateepitel karsinom vs Control, og 0,81 (95 % konfidensintervall 0,72 til 0,94, P = 0,001) for småcellet karsinom vs kontroll (Figur 8, nedre panel)
Top:. CHI3L1 protein konsentrasjoner i humant serum. Nederst: ROC (Receiver Operating Karakteristisk) kurve analyse for å bestemme arealet under kurven (AUC). Mean ± SD kontroll (n 30): 17,3 ± 7,8. Mean ± SD i adenokarsinom (n 30): 66.9 ± 64.8. Mean ± SD i plateepitel karsinom (n 30): 69,3 ± 69,0. Mean ± SD i småcellet lungekreft (n 30): 56.3 ± 58.8. De grå linjene representerer gjennomsnittsverdiene. Kontroll:. Normal menneskelig uten kreft
Diskusjoner
CHI3L1 ble først identifisert som en nedstrøms genet av Stat3 i CCSP-rtTA- /(Teto)
7Stat3C spontan lungetumor mus modell av Affymetrix Genechip microarray [1].
