Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er en svært dødelig sykdom som kjennetegnes ved sen diagnose og behandling motstand. Tilbakevendende genetiske endringer i definerte gener i forbindelse med forstyrrelser av utviklingscellesignalveier har blitt assosiert med PDAC utvikling og progresjon. Her viser vi at GATA6 bidrar til bukspyttkjertelen kreftutvikling i løpet av tidsmessige utviklingen av pankreas intraepitelial neoplasi i kraft av Wnt veien aktivering.
GATA6
er recurrently forsterkes av både kvantitativ-PCR og fluorescerende in situ hybridisering i menneskelige bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi og i PDAC vev, og
GATA6
kopiere nummeret er signifikant korrelert med generelle pasient overlevelse. Tvunget overekspresjon av GATA6 i kreftcellelinjer forbedret celleproliferasjon og kolonidannelse i soft agar
in vitro Hotell og vekst
in vivo
, samt økt Wnt signalering. I motsetning siRNA mediert knockdown av GATA6 ført til tilsvarende reduksjoner i de samme parametrene. Virkningene av GATA6 ble funnet å være på grunn av dens evne til å binde DNA, som tvinges overekspresjon av et DNA-bindende mutant av GATA6 hadde ingen virkning på cellevekst
in vitro
eller
in vivo,
heller ikke de påvirker wnt signalnivåer i de samme cellene. En microarray analyse avslørte Wnt antagonist Dickopf-en (DKK1) som en feilregulert gen i forbindelse med GATA6 knockdown, og direkte binding av GATA6 til DKK1 arrangøren ble bekreftet av kromatin immunpresipitering og elektromobilitet skift analyser. Transient transfeksjon av GATA6, men ikke mutant GATA6, til kreftcellelinjer førte til redusert DKK1 mRNA ekspresjon og sekresjon av DKK1 protein i kulturmedier. Tvunget overekspresjon av DKK1 motvirket effekten av GATA6 på Wnt signal i kreft i bukspyttkjertelen celler. Disse funnene viser at en mekanisme som
GATA6
fremmer bukspyttkjertelen kreftutvikling er i kraft av sin aktivering av kanoniske Wnt signal via regulering av DKK1
Citation. Zhong Y, Wang Z, Fu B, Pan F, Yachida S, Dhara M, et al. (2011) GATA6 Aktiverer Wnt signale i bukspyttkjertelkreft ved Negativt Regulering av Wnt Antagonist Dickkopf-en. PLoS ONE 6 (7): e22129. doi: 10,1371 /journal.pone.0022129
Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 31 januar 2011; Godkjent: 16 juni 2011; Publisert: 19.07.2011
Copyright: © 2011 Zhong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av NIH gir CA106610, CA62924 og CA140599, The George Rubis Endowment for kreft i bukspyttkjertelen Research, Michael Rolfe Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP Foundation, Sigma Beta Sorority, Joseph C. Monastra Foundation, The Alfredo Scatena Memorial, The Patty Boshell Pancreas Cancer Foundation, og Grants SAF2007 -60860 og ONCOBIO Consolíder fra Ministerio de Ciencia e Innovación, Madrid, Spania (FR). Forfatterne har ingen økonomiske interessekonflikter knyttet til dette arbeidet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
GATA6 er medlem av GATA transkripsjonsfaktor familie som spiller viktige regulatoriske roller i vev utvikling [1]. Gata proteiner dele en konservert sink finger sekvens som binder seg til den kanoniske DNA motiv (G /A) GATA (A /T) [2] og er delt inn i to undergrupper basert på romlige og tidsmessige uttrykk mønstre. GATA1 /2/3 er uttrykt i hematopoietiske celle linjer, og GATA4 /5/6 i mesoderm og endoderm avledet organer [1], [3]. GATA6 spesielt er essensielt for utviklingen av hjerte, mage-tarmkanalen, bukspyttkjertel og andre vev [4], [5]. Betydningen av GATA6 understrekes av den observasjon at målrettet inaktivering av
GATA6
genet i mus forårsaker tidlig embryodødelighet som følge av mangel på endoderm differensiering [5] -. [7]
Tilbakevendende kopiantall gevinst på
GATA6
har nylig blitt identifisert i pankreasgang adenokarsinom (PDAC) cellelinjer og transplantater [8], [9]. Mens dens rolle i PDAC karsinogenese er ukjent, montering bevis indikerer at GATA6 er forbundet med tumorgenese i en rekke forskjellige vevstyper [10] – [14]. I ovarietumorer er ektopisk GATA6 uttrykk korrelert med celle dedifferentiation [15], mens i kolorektal cancer, GATA6 påvirker celleproliferasjon og apoptose ved å påvirke ekspresjon av 15-lipoksygenase-en som spiller en rolle i p53-avhengig cellerest [16]. Avvikende ekspresjon av GATA6 har også blitt implisert i human adrenal tumorer, så vel som i en alfa /SV40 T-antigen-transgen musemodell som utvikles binyrebark tumorer i et gonadotropin avhengig måte [17], [18]. I motsetning
GATA6
har vært innblandet som en tumor suppressor genet i astrocytomas [14].
Denne studien søkt å avklare mekanismer som GATA6 bidrar til bukspyttkjertelen kreftutvikling. Vi viser nå at
GATA6
forsterkning oppstår i løpet av de sene stadier av bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi, er betydelig korrelert med pasientenes prognose, og fremmer bukspyttkjertelkreftutvikling ved å aktivere den kanoniske Wnt signalveien på grunn av sin direkte transkripsjonen undertrykkelse av det utskilte Wnt antagonist Dickkopf-en.
Metoder
Etikk erklæringen
Alle menneskelige vevsprøver ble samlet inn med godkjenning av Johns Hopkins Hospital Institutional Review Board (IRB protokoller # NA_00036610 og NA_00001584) etter informert og skriftlig samtykke. For dyreforsøk, ble studier utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk ved Universitetet i Minnesota (ACUC protokoll # MO09M84). Alle prosedyrer ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
cellelinjer og vev
A6L, A13a, A10.7 og IMIM-PC2 cellelinjer ble etablert i våre egne laboratorier. PK8 og PK9 var fra Dr. Akira Horii (Tohoko universitet, Sendai, Japan), og HCG-25 fra Dr. Tony Hollingsworth (University of Nebraska Medical Center, Omaha NE). Alle gjenværende bukspyttkjertelcancercellelinjer som ble anvendt ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA). Den normale pankreasgang epiteliale cellelinjer HPNE og HPDE ble fremstilt som tidligere beskrevet [19]. Den tykktarmskreft cellelinjer HCT116 (
CTNNB1
mutant), SW480 (
APC
mutant) og RKO (
APC Hotell og
CTNNB1
vill type) var gitt av Dr. James Eshleman (Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore MD USA). Alle celler ble dyrket i DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin og 2 mmol /L L-glutamin ved 37 ° C og 5% CO
2.
Menneskelige pankreas vevsprøver ble innhentet fra kirurgisk patologi Avdeling for Johns Hopkins og xenotransplantater ble sjenerøst gitt av Dr. Scott Kern (Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore MD USA). Alle prøver ble samlet inn med godkjenning av Johns Hopkins Hospital Institutional Review Board.
Lentiviral konstruerer
Rekombinante lentiviruses uttrykker GFP nedstrøms en uekte shRNA eller en shRNA spesifikt for GATA6 ble opprettet ved hjelp av en tre- virus system som tidligere er beskrevet i detalj [20], [21]. Oligonukleotidsekvenser for GATA6 knockdown var forstand, 5′-gatccgctgtcacaccacaactaccttcaagagaggtagttgtggtgtgacagctttttta-3 «; og anti-sense, 5»-cgataaaaaagctgtcacaccacaactacctctcttgaaggtagttgtggtgtgacagcg-3 «. Etter infeksjon, en porsjon av hver cellelinje (1 x 10
5) ble analysert ved FACS i flowcytometri kjernefasilitet for å bekrefte effektiviteten av transduksjon (mer enn 95% i alle cellelinjene som ble testet) ved å overvåke GFP uttrykk 60 timer etter transduksjon.
Plasmid konstruerer
Den menneskelige GATA6 vektor pcDNA3.1-GATA6 var en gave fra Dr. Clement Ho (University of Pennsylvania, Philadelphia PA) og brukes til å lage pcDNA3.1 -mGATA6 ved seterettet mutagenese (Invitrogen) i hvilket de åtte mest konserverte baser av sink-finger-motivet ble slettet [22], [23]. Menneskelig DKK1 ekspresjonsvektor pCMV-DKK1 og DKK1 arrangøren luciferaserapportørplasmid pGL3-DKK1 var både sjenerøst gitt av Dr. Hirotaka Osada (Aichi Cancer Instititue, Nagoya, Japan). Stabile cellelinjer ble opprettet etter våre metoder tidligere rapportert i detalj [8].
In vitro analyser av cellevekst
celleproliferasjon ble utført ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies) etter den foreslåtte protokoll. Kolonidannelse analyser ble utført som tidligere beskrevet [8]. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Cell Cycle Analysis
Flowcytometri ble utført på en Becton Dickenson LSR Stasjonære Flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, California). Prosentandeler av celler i G0-G1, S og G2-fasen ble bestemt ved anvendelse av Cellquest (BD Biosciences).
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ELISA ble utført ved anvendelse av mus-mAb-anti-human-1 DKK antistoff (Klon 141 119) etter produsenter protokollen (R 2.3 ble ansett kopiantall gevinst å gjøre rede for polysomy av kromosom 18q, og fordi opptil 20 ganger GATA6 overekspresjon kan oppstå i PDACs med enda lavt nivå kopi nummer gevinst [8]
Luciferase. og TOPFLASH analyser
For TOPFLASH analyser, pGL3-OT og pGL3-OF plasmider ble brukt (vennlig levert av Dr. Bert Vogel). Relativ Wnt aktivitet ble bestemt ved forholdet av luciferase-ekspresjon fra pGL3-OT vektor dividert med den for pGL3-vektor som tidligere beskrevet. For alle andre luciferase-analyser, ble vektoren PRL-TK (Promega) som uttrykker hav pansy luciferase anvendt som en kontroll. Den pcDNA3.1-tom vektor ble benyttet til å justere den totale mengde av transfektert DNA. Luciferase analyser ble utført 40 timer etter transfeksjon ved bruk av dual-Luciferase-reporter Assay System (Promega), og luciferase-aktiviteten ble bestemt med 1420 multilabel teller (PerkinElmer life science og analyse, CT, USA). Firefly luciferase aktiviteter ble normalisert ved sjøen stemorsblomst luciferasepreparater aktiviteter. Alle forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Chromatin Immunoutfelling Assay (CHIP assay)
brikke analyser ble utført ved anvendelse av reagenser og protokoller fra Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) ved anvendelse av tidligere beskrevne fremgangsmåter [24 ]. Alle primere som brukes ble utformet spesifikt mot Gata bindende motiver i
DKK1
promoter. (Probe sekvenser er gitt i File S1).
Elektro Mobility Skift Assay (EMSA)
EMSA analysene ble utført ved hjelp av tidligere beskrevne metoder [24]. Protein ekstrakter ble normalisert for total protein, og 5-10 mg protein ble inkubert med
32P-merkede høy affinitet GATA6 prober som er spesifikke for hver av de fire antatte Gata bindende motiver i
DKK1
promoter . Mutante prober hvori bindingsmotivet sekvensen ble mutert ble også anvendt. En GATA6-P sonde (5′-GCCAGCAGATAGCATGGAAAAG-3 «) avledet fra
TFF2
promoter inneholdende et GATA6 bindingssete [25] ble anvendt som en positiv kontroll. Protein-DNA komplekser ble løst på 5% nondenaturating polyakrylamidgeler og analysert ved autoradiografi hjelp Kodak film. (Probe sekvenser er gitt i File S1).
shRNA mediert knockdown
dyrkede celler i log fase vekst (50% konfluent) ble transfektert med DKK1 shRNA (Dharmacon), CTNNB1 shRNA (CTNNB1- VHS50819, Invitrogen Inc, California) eller håne shRNA (# 4611, Ambion) ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Inc, California) følger den anbefalte protokollen. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene høstet og utsatt for RT-qPCR analyse, celleproliferasjon og kolonidannelse analyser.
Flourescent in situ hybridisering (FISH)
FISH ble utført som beskrevet tidligere [8] med bakterielle kunstig kromosom kloner CTD-2376C8 inneholder genomiske sekvenser av 18q11.2 amplicon på 0,11 Mb (Invitrogen, Carlsbad, California).
metylering Spesifikk PCR
Arrangøren metylering var vurdert ved hjelp av primere og vilkår som tidligere rapportert av Suzuki et al [26].
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført med en uparet
t
-test for para distribusjoner, eller en Kji-kvadrat-test for sammenligning av frekvenser. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
GATA6 Kopier nummer Gain oppstår under bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi
Normal bukspyttkjertelen ductal epitel antas å utvikle seg til å infiltrere kreft gjennom en serie. av morfologisk definerte forløperne som kalles pankreatiske intraepitelial neoplasi (Panins-1, 2, 3) [27]. For å forstå sammenhengen mellom genetisk gevinst på
GATA6 Hotell og PDAC utvikling, vurderte vi
GATA6
kopiere nummer i microdissected prøver av normal duct epitel, Panin, og menneskelig PDAC av kvantitativ PCR. I forhold til haploid genom, var det ingen gevinst på
GATA6
i normal epitel kanalen (0 til 4), Panins-1 (0 av 13) eller Panins-2 (0 av 10) lesjoner. I motsetning til dette økte
GATA6
kopitall (≥2.3 kopier) ble identifisert i 6/17 prøver (35%) av Panins-3 og i 18/55 prøver (33%) av PDAC (figur 1A).
GATA6
Kopier nummer gevinst ble ytterligere bekreftet av fluorescerende
in situ
hybridisering (FISH) i parafininnstøpte deler av en Panin-3 og 10 PDAC prøver (Figur 1b).
(A)
GATA6
kopiere nummer (gjennomsnitt ± SE) i microdissected normale kanaler (N = 4), Panin-1 (N = 13), Panin-2 (10), Panin-3 (N = 17) lesjoner og kreft i bukspyttkjertelen (N = 55). (B) Representant FISH av kjernen i en neoplastisk celle i et PanIN3 lesjon med 11 ganger
GATA6
forsterkning (til høyre) i forhold til kjernen av en neoplastisk celle fra en annen PanIN3 lesjon uten kopiantall gevinst av
GATA6 plakater (til venstre). GATA6 probe ble merket med rød og kromosom 18 cent probe (18 Cent) ble merket med grønt. Seksjonene ble kontra med DAPI å markere kjerner. (C) Korrelasjonen av GATA6 mRNA uttrykk og kopiere nummer i microdissected prøver av normal, Panin og kreft vev. (D) GATA6 immunolabeling av to kreft i bukspyttkjertelen vev med GATA6 kopiantall gevinst sammenlignet med to kreft uten kopiantall gevinst. Økt kopiantall er sterkt forbundet med kjernefysisk merking av GATA6 protein. (E) Kaplan Meier overlevelseskurve som illustrerer forholdet mellom
GATA6
kopiere nummer gevinst (≥2.3 eksemplarer per haploid genom) til total overlevelse hos pasienter med kirurgisk reseksjon kreft i bukspyttkjertelen.
For seks pasienter matchet Panin-3 og PDAC ble microdissected fra samme vev delen og analysert for
GATA6
kopiere nummer,
KRAS Hotell og
TP53
genet status (tabell 1) . Hos to pasienter (pasienter 7 og 53)
GATA6
kopinummer vinning ble funnet i både de Panins-3 og PDAC prøver som indikerer at det oppsto før utviklingen av infiltrerende karsinom, mens i en tredje pasient (pasient 53)
GATA6
kopiere nummer gevinsten var bare til stede i PDAC prøven tyder det oppsto under tidsmessige progresjon til PDAC. Men som en enkelt Panin-3 ble analysert i denne pasienten, vi kan ikke utelukke at flere og utestet Panin-3 lesjoner i denne pasientens bukspyttkjertelen også inneholdt kopiantall gevinst. For å bekrefte at øker i
GATA6
kopiere nummer resultat i økt genekspresjon, vi kvantifisert GATA6 mRNA nivåer i de samme microdissected prøver (figur 1C), noe som indikerer at relative nivåer av GATA6 mRNA var signifikant større i prøver med
GATA6
kopiere numre ≥2.3 forhold til de med kopiantall 2,3 (461,9 ± 126,2 og 194,1 ± 69,7, p 0,0004). Tilsvarende immunolabeling for GATA6 i fem bukspyttkjertel kreft med kopi nummer gevinst viste sterk positiv atom merking mens ingen merking ble observert i fem bukspyttkjertel kreft med kopiantall. 2,3 (figur 1D)
Bukspyttkjertel carcinogenesen er ledsaget av opphopning av genetiske endringer i
KRAS, CDKN2A, TP53 Hotell og
SMAD4
gener [27]. Vi bestemte derfor forholdet mellom
GATA6
kopiere nummer gevinst til den genetiske statusen til disse fire genene i 56 xenograft beriket PDACs. Sytten xenografter (30%) hadde en
GATA6
kopiere nummer ≥2.3 forhold til haploid genom, hvorav seks (11%) hadde en kopi nummer 5.0. Men det var ingen sammenheng av
KRAS, CDKN2A, TP53
eller
SMAD4
status med
GATA6
kopiere nummer. Fordi
GATA6
ligger også på samme kromosom arm som
SMAD4
som ofte målrettet av homozygot delesjon [28], vi neste lurte på om
GATA6
kopiere nummer gevinsten er spesielt knyttet til genomisk omorganisering hendelser som kan føre til homozygot sletting av
SMAD4
i samme xenograft DNA. Men dette igjen ikke avsløre en forening, med seks av åtte
SMAD4
mutanter oppstår på grunn av homozygot delesjon i xenografter med økt
GATA6
kopiere antall versus 13 av 21 med en homozygot delesjon i xenografter uten
GATA6
kopiere nummer gevinst (p = 0,2844). Tatt sammen, konkluderer vi at
GATA6
kopiere numbe≥r gevinst oppstår under sene stadier av bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi, men er ikke spesielt beriket for innen karsinomer med endringer av disse fire genene.
Vi neste fast i hvilken grad
GATA6
kopiere nummer gain er assosiert med clinicopathologic funksjonene resected PDAC. Ingen relasjoner ble funnet for
GATA6 Hotell og alder, kjønn, tumorstørrelse, tumor differensiering, tumor sted eller lymfeknutestatus. Men pasienter med kopi nummer ≥2.3 hadde en lengre total overlevelse enn pasienter uten kopiantall gevinst ved Kaplan Meier overlevelsesestimat (p = 0,0096, figur 1E).
GATA6 Fremmer cellevekst
In Vitro
og
in Vivo
Forsterkning og overekspresjon av
GATA6
i Panin og PDAC antyder det bidrar til PDAC biologi [8], [9]. Vi konstruerte derfor lentiviral vektorer som uttrykker enten en uekte eller GATA6 spesifikk shRNA og brukt dem til å stabilt infisere PDAC cellelinjer AsPC1 og A13a med kopiantall på 2,3 og 9,0 i forhold til haploid genom, henholdsvis [8], [9]. I begge cellelinjer, er GATA6 også overuttrykt i det minste 10 ganger i forhold til normale kanalsystem celler [8], [9] (figur S2). Knockdown av GATA6 i begge cellelinjer (figur 2a, 2b) førte til en signifikant reduksjon i celleformering og kolonidannelse (figur 2C og D), en reduksjon i celler i G2 /M fasen (figur 2E) og redusert vekst in vivo (figur 2F og 2G). Omvendt, tvunget overekspresjon av GATA6 i PDAC cellelinjen Panc1 med lave nivåer av endogen GATA6 uttrykk [8] (figur 3A og figur S2) førte til økt celleproliferasjon og kolonidannelse (figur 3B og 3C) lik den som også tidligere er vist for cellelinjen MiaPaca2 som ikke har endogene ekspresjon av GATA6 [8].
(A) Totalt protein ble ekstrahert fra AsPC1-GATA6sh og A13a-GATA6sh celler og mock shRNA kontroller og analysert ved hjelp av Western blot for relative nivåer av GATA6 protein i forhold til aktin. (B) Real-time PCR for GATA6 uttrykk i AsPC1-GATA6sh og A13a-GATA6sh celler. (C) Disse cellene ble også analysert for celle-proliferasjon ved forskjellige tidspunkter, (D) dyrket i myk agar, og antall kolonier på 2 uker telles, og (E) analysert ved strømningscytometri for å bestemme den prosent av celler i G2 /M fase. (F) Representant xenograft formasjon
in vivo plakater (over) og etter explantation (lavere) av AsPC1 kontroll og GATA6sh cellene ved 8 uker postinjection. (G) Gjennomsnittlig tumorvolum (gjennomsnitt ± SE) av de samme xenotransplantater på 8 uker postinjection. Lignende resultater ble notert for A13a-GATA6sh-celler (data ikke vist). Med unntak av flowcytometri som ble utført i duplikat, alle eksperimentelle data er vist representerer oppsummeringen tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P. 0,001
(A) Real-time PCR for GATA6 uttrykk i Panc1-mock, Panc1-GATA6 og Panc1-mGATA6 celler. (B) Panc1-mock, Panc1-GATA6 og Panc1-mGATA6 celler ble enten analysert for celleproliferasjon eller (C) dyrket i myk agar, og antall kolonier på 2 uker telles. (D) Representant xenograft formasjon
in vivo plakater (over) og etter explantation (lavere) av Panc1-mock, Panc1-GATA6 og Panc1-mGATA6 celler på 8 uker postinjection. (E) Gjennomsnittlig tumorvolum (gjennomsnitt ± SE) av de samme xenotransplantater på 8 uker postinjection. Alle forsøksdata vist representerer sammendraget tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P. 0,001
GATA6 regulerer DNA transkripsjon ved å binde seg til kanoniske Gata motiver, eller som en transkripsjons kofaktor [2], [29]. For å bestemme om effekten i Panc1 celler var på grunn av GATA6 DNA-bindende aktivitet, anvendte vi seterettet mutagenese for å skape en mutant cDNA hvor GATA6 Zn finger domenet ble avbrutt (kalt mGATA6), og på nytt stabilt transfektert Panc1-celler (figur 3A ). Det var ingen forskjell i cellevekst eller kolonidannelse mellom Panc1-mGATA6 celler og Panc1-kontroll transfekterte celler (figur 3B og 3C) som tyder på at den vekstfremmende effekter av GATA6 observert
in vitro
er på grunn av sin funksjon som en transkripsjonsfaktor. For ytterligere å klargjøre den vekstfremmende effekten av GATA6 ble nakne mus inokulert subkutant med Panc1-GATA6 eller Panc1-mGATA6 celler. Etter 8 uker, gjennomsnittlig tumorvolum var betydelig større i mus injisert med Panc1-GATA6 celler enn med Panc1-mGATA6 celler (Figur 3D og 3E), fører oss til å konkludere med at GATA6 fremmer kreft via sin evne til å binde DNA.
den Wnt Antagonist Dickkopf1 (DKK1) er en GATA6 Target Gene
Gata proteiner er knyttet til Wnt signal i embryogenese av hjertet og lungene [4], [30], [31]. Vi har derfor en hypotese om at GATA6 bidrar til bukspyttkjertelen karsinogenese delvis gjennom dens virkning på Wnt signalering, en antatt forhold som ikke har blitt undersøkt i detalj for denne tumortype. Sammenlignet med mock shRNA lentivirale-infiserte celler, både AsPC1-GATA6sh og A13a-GATA6sh celler viste en signifikant reduksjon i funksjonell Wnt signaleringsaktiviteten av TOPFLASH analysen (figur 4A), mens overekspresjon av GATA6 i Panc1 og HPNE celler fremmes Wnt signal aktivitet (figur 4B ). For å finne ut om SS-catenin uttrykk er nødvendig for disse effektene vi forstummet ß-catenin uttrykk ved hjelp av en shRNA strategi i Panc1-GATA6 celler, som fører til en betydelig hemming av celleproliferasjon og kolonidannelse (figur 4C og 4D). I kreft i bukspyttkjertelen vev, ble GATA6 overekspresjon signifikant korrelert med atom opphopning av ß-catenin protein (8/12 PDACs med GATA6 overekspresjon viser ß-catenin atom opphopning versus 3/20 uten GATA6 overekspresjon, p = 0,004) (figur 4E). Dermed GATA6 overekspresjon i PDAC bidrar til celleproliferasjon og kolonidannelse ved å styrke kanoniske Wnt signal.
(A) Wnt signalaktivitet i AsPC1-GATA6sh og A13a-GATA6sh celler basert på TOPFLASH analysen. Luciferaseaktiviteten er representert som forholdet mellom OT til nivåer i celler med GATA6 knockdown forhold til den mock-transfekterte celler. (B) Wnt signalaktivitet i Panc1-GATA6 og HPNE-GATA6 celler bestemt ved TOPFLASH analysen. Luciferaseaktiviteten er representert som forholdet mellom OT til nivåer i GATA6 transfekterte celler i forhold til det av mock-transfekterte celler. (C og D) Panc1-GATA6 celler ble transient transfektert med ß-catenin eller håne shRNA og (C) celleproliferasjon eller (D) kolonidannelse bestemt. Alle forsøksdata vist representerer sammendraget tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01. (E) Immunolabeling mønstre av GATA6 og ß-catenin protein i to representative PDAC vev. Pilene angir atom merking av både GATA6 og ß-catenin i seriesnitt av samme kreftvevet. I motsetning til PDAC prøven med lav GATA6 uttrykk viser heller ingen uttrykk for ß-catenin.
GATA6 regulerer sine mål gener gjennom binding til GATA-bindende motiv [2]. Å identifisere GATA6 målgener som kan påvirke Wnt signal, utførte vi genuttrykk profilering ved hjelp AsPC1-GATA6sh og A13a-GATA6sh og deres mock kontrollene og identifisert 113 ofte feilregulert gener (figur 5A og tabell S1) hvorav en var Dickkopf-en (
DKK1
), en motstander av kanonisk Wnt signal [32]. Wnt11, en kjent GATA6 target genet [30], ble også identifisert som tyder på at GATA6 bidrar til Wnt veien regulering blant annet gjennom regulering av disse genene. Fordi DKK1 har ikke tidligere blitt anerkjent som en
GATA6
målet genet vi spesielt fokusert på forholdet mellom GATA6 til DKK1.
(A) Venn-diagram som viser antall feilregulert gener identifisert ved microarray analyse av AsPC1-GATA6sh (venstre sirkel, blå) og A13a-GATA6sh celler (høyre sirkel, gul). Den grønne kryss-området viser ofte feilregulert gener og inkluderer DKK1. (B) Real-time PCR bekrefter DKK1 overekspresjon i AsPC1-GATA6sh og A13a-GATA6sh celler. (C) Påvisning av utskilt DKK1 protein i kondisjonert media i AsPC1-GATA6sh og A13a-GATA6sh celler. Utskilte DKK1 proteinnivåer er angitt ved hjelp av absorbans OD450. (D) Chromatin immunoprecipitation analysen bekrefter binding av GATA6 til
DKK1
promoter. Non-immun IgG og hele genomet avledet gDNA blir anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. (E) EMSA analyse som bekrefter binding av GATA6 til putative Gata bindingsseter # 2 og # 3. Mutant sekvens mGATA- # 3 ikke generere noen påvisbar binding. Nuclear gassutvinning, kjerneekstrakt; GATA6-P, en positiv kontroll sonde hentet fra
TFF2
promoter inneholder en GATA6 bindingssete; GATA- # 2, sonde som inneholder antatte GATA bindingssete nr 2; GATA- # 3, sonde som inneholder antatte GATA bindingssete nr 3; mGATA- # 3, sonde som inneholder en mutert antatt GATA bindingssete nr 3; referere til metoder for ytterligere detaljer (F) Effekt av GATA6 uttrykk på aktiviteten i
DKK1
promoter. Dataene er presentert som forholdet mellom ildflue luciferase-aktivitet til sjøs pansy luciferase-aktivitet. pGL3 ble anvendt som en negativ kontroll for bakgrunns. (G) Real-time PCR for DKK1 mRNA uttrykk i Panc1 celler. Når det er hensiktsmessig, alle eksperimentelle data som vises representerer sammendraget tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; ***, P. 0,001
Real-time PCR bekreftet DKK1 mRNA oppregulering og økt utskillelse av DKK1 protein i cellemateriale i begge cellelinjene i nærvær av GATA6 knockdown (Tall 5B og 5C) . For å avgjøre om
DKK1
er et direkte mål for GATA6, vi søkte på
DKK1
promoter for GATA6 konsensus bindende sekvenser. Fire uavhengige GATA-bindende motiver ble identifisert (figur S3), og av kromatin immunoprecipitation analysen direkte binding av GATA6 til disse motivene i
DKK1
promoter ble demonstrert (figur 5D). Binding av GATA6 ble også bekreftet ved elektroforetisk mobilitet shift assay (figur 5E og data ikke vist). Vi neste brukte en luciferase reporter under kontroll av
DKK1
arrangøren å bestemme om GATA6 binding til
DKK1
virkninger på transkripsjonen aktivitet fra genet. Dette reporter ble aktivert i begge 293T og Panc1 celler reflekterer endogen aktivering av DKK1 uttrykk. Imidlertid ved tvungen GATA6 uttrykket (fig. 5F) luciferaseaktivitet ble signifikant redusert, mens ingen effekt på
DKK1
promoter-aktivitet ble observert i nærvær av det GATA6 bindingsmotiv mutant (mGATA6), som indikerer at de undertrykkende virkninger av GATA6 på
DKK1
krever direkte binding av GATA6 til
DKK1
promoter. Tvunget uttrykk for vill-type, men ikke mGATA6 protein i Panc1 førte også til betydelige reduksjoner i DKK1 mRNA nivåer (Figur 5G). Samlet utgjør disse dataene indikerer at GATA6 regulerer negativt DKK1 transkripsjon gjennom direkte binding til GATA motiv i
DKK1
promoter-regionen.
DKK1 Expression i PDAC korrelerer med Wnt Activation
medlemmer av DKK familien (DKK1, DKK2, DKK3 og DKK4) skilles proteiner som hemmer kanoniske Wnt signal ved å binde seg til en subenhet av Wnt reseptor kompleks LRP5 /6 [32]. Real-time PCR indikerte at DKK1 var det eneste medlem av DKK familien som ble uttrykt i både normale kanalen cellelinjer og i de fleste PDAC cellelinjer analysert (figur S4A). TSS, transkripsjon start stedet; 0,01;
